CN115003817A - 猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性、GGTA1、CMAH、iGb3s及β4GalNT2基因被敲除并且表达人类CD46及TBM基因的异种器官移植用转基因克隆猪及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及如下异种器官移植用转基因克隆猪及其制备方法：猪内源性逆转录病毒包膜C(PERV(Porcine Endogenous Retrovirus)EnvC)为阴性，α‑1,3半乳糖基转移酶(GGTA1，α‑1,3‑galactosyltransferase)、胞苷一磷酸‑N‑乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH，CMP‑N‑acetylneuraminic acid hydroxylase)、异球三己糖神经酰胺合酶(iGb3s，Isoglobotrihexosylceramide synthase)及β‑1,4‑N‑乙酰基‑半乳糖胺转移酶2(β4GalNT2，Beta‑1,4‑N‑Acetyl‑Galactosaminyl Transferase2)被敲除，表达人类CD46及血栓调节蛋白(TBM，Thrombomodulin)基因。本发明的转基因克隆猪不发生在异种器官移植中发生的猪内源性逆转录病毒的转移的同时，还可以克服超急性及抗原‑抗体介导的免疫排斥反应、由血液凝固引起的免疫排斥反应、由补体活性引起的免疫排斥反应，从而可以将其有效用作用于异种间器官及细胞移植的供体动物。
Description
技术领域
本发明涉及如下异种器官移植用转基因克隆猪及其制备方法：猪内源性逆转录病毒包膜C(PERV(Porcine Endogenous Retrovirus)EnvC)为阴性，α-1,3半乳糖基转移酶(GGTA1，α-1,3-galactosyltransferase)、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH，CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase)、异球三己糖神经酰胺合酶(iGb3s，Isoglobotrihexosylceramide synthase)及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2(β4GalNT2，Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2)被敲除，表达人类CD46及血栓调节蛋白(TBM，Thrombomodulin)基因。
背景技术
截止2017年，韩国国内等待器官移植的患者为27701人，相对于此，器官捐献者仅为1693人。虽然从国家层面积极宣传器官捐献的必要性并通过优待捐献者家属来努力活跃器官捐献文化，但供应和需求之间的差异仍在逐年持续增加。这不仅在韩国，在全世界都是个大问题，以至于非法的器官买卖横行，因此成为人类不得不直面的问题之一。
异种器官移植(Xenotransplantation)为使用其他物种(species)的器官完全代替活体器官的方法，一旦激活就可以从根本上解决器官供应的问题，成为备受期待的解决方案之一。在诸多文献中得到证实，在异种器官源动物模型中，微型猪的器官在形态学、遗传学上与人类相似。尤其，尤卡坦微型猪(Yucatan miniature pig)与哥廷根微型猪(Gottingen miniature pig)为使用最多的实验动物模型，从中导出了许多研究结果。然而，在目前的研究结果中，在将微型猪的器官移植到人体时，会出现比自体移植、同种移植更加严重的多的免疫排斥反应。
在引起免疫排斥反应的因子中，α-半乳糖基转移酶(α-gal，α-galactosyltransferse)为通过α-1,3半乳糖基转移酶基因合成的抗原，存在于除灵长类以外的哺乳动物、啮齿动物等所有动物的细胞表面。因此，在将保有α-半乳糖基转移酶的猪的器官移植到没有α-半乳糖基转移酶的人体时，通过抗原-抗体反应引起组织坏死及死亡。因此，进行了生产α-半乳糖基转移酶缺失的转基因克隆猪的研究，据2005年的报告，以同型接合的方式将α-1,3半乳糖基转移酶基因缺失的转基因克隆猪的器官移植到猴的结果，未出现超急性免疫排斥反应而生存了下来。虽然通过生产α-1,3半乳糖基转移酶基因缺失的转基因克隆猪控制了从几秒钟到几分钟的超急性免疫排斥反应，但由于随后的急性、细胞性免疫排斥反应，器官接受者的生存时间并不长。在引起排斥反应的基因中，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(Cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acidhydroxylase)为将N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)合成为N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的基因，存在于除人类以外的灵长类、哺乳动物等所有生物中，但人类通过进化改变胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶基因，因此不合成N-羟乙酰神经氨酸。因此，N-羟乙酰神经氨酸在人体内起到抗原的作用，在器官移植时发生由抗原-抗体反应引起的免疫排斥反应。并且，异球三己糖神经酰胺合酶(Isogloboside 3synthease；A3GalT2)基因通过糖基转移酶在乳糖神经酰胺加上半乳糖来合成作为复合脂质的鞘糖脂的异球三己糖神经酰胺合酶(iGb3)，已知这是生成通过α-1,3半乳糖基转移酶基因合成的α-半乳糖基转移酶抗原的替代途径。β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2(Beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2)基因为生成糖链的基因，生成GalNAcβ1-4、Galβ1-4GlcNAcβ1-3Gal、Sd(a)(Sid blood group；CAD或CT)抗原。据报告，β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因引起由通过补体活性的细胞裂解作用、non-gal引起的免疫排斥反应。
并且，在将猪的器官移植到人体的情况下，不仅引起通过抗原-抗体介导的免疫排斥反应调节的超急性、急性免疫排斥反应控制，还引起由血液凝固作用及人类的补体活性导致的免疫排斥反应。与此相关地，CD46(膜辅因子蛋白(Membrane Cofactor Protein；MCP))基因为表面膜糖蛋白，上述膜辅因子蛋白(MCP)在表面膜上与作为补体激活成分的C3b或C4b结合来起到辅助因子的作用，通过促进C3b或C4b的分解来起到抑制补体活性的作用。并且，血栓调节蛋白(Thrombomodulin)基因在血液凝固途径中与凝血酶结合生成血栓调节蛋白-凝血酶复合物(Thrombomodulin-Thrombin complex)，激活蛋白C来起到通过因子(factor)V、因子VII活性的抑制血液凝固的作用。
发明内容
技术问题
在上述背景下，本发明人持续致力于开发能够用于异种器官移植的转基因克隆猪，其结果，制备了如下异种器官移植用转基因克隆猪：猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性，α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2被敲除，表达人类CD46及血栓调节蛋白基因。确认在使用上述转基因克隆猪时，在不发生以往开发的转基因克隆猪在异种器官移植中发生的猪内源性逆转录病毒的转移问题的同时，还克服超急性及抗原-抗体介导的免疫排斥反应、由血液凝固引起的免疫排斥反应、由补体活性引起的免疫排斥反应，具有可以延长器官接受者的生存时间的优秀效果，从而完成本发明。
因此，本发明的目的在于，提供如下异种器官移植用转基因克隆猪及其制备方法：猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性，α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2被敲除，表达人类CD46及血栓调节蛋白基因。
解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明提供如下用于制备异种器官移植用转基因克隆猪的转化细胞：导入α-1,3半乳糖基转移酶敲除用重组载体、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶敲除用重组载体、异球三己糖神经酰胺合酶敲除用重组载体、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2敲除用重组载体、人类CD46表达用重组载体及人类血栓调节蛋白表达用重组载体，猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性。
并且，本发明提供异种器官移植用转基因克隆猪的制备方法，包括：将上述转化细胞移植到脱核的***来形成细胞核移植卵的步骤；以及将上述细胞核核移植卵移植到***母的输卵管的步骤。
并且，本发明提供通过上述方法生产的异种器官移植用转基因克隆猪。
发明的效果
本发明的转基因克隆猪的特征在于，猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性，通过作为基因剪刀的CRISPR-Cas9敲除α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2及异球三己糖神经酰胺合酶等4个基因，表达人类CD46及血栓调节蛋白基因。因此，本发明的转基因克隆猪在不发生异种器官移植中发生的猪内源性逆转录病毒的转移问题的同时，还可以克服超急性及抗原-抗体介导的免疫排斥反应、由血液凝固引起的免疫排斥反应、由补体活性引起的免疫排斥反应，从而可以将其有效用作用于异种间器官及细胞移植的供体动物。
附图说明
图1示出用于使α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因缺失的靶向载体。
图2为示出用于表达人类CD46的载体图谱的图。
图3为示出用于表达人类血栓调节蛋白的载体图谱的图。
图4为示出猪内源性逆转录病毒包膜C(Envlope C)检查结果的图。
图5为示出转导后利用人类CD46抗体的免疫荧光染色及细胞分类结果的图。
图6为确认转化细胞内是否导入人类CD46及血栓调节蛋白表达载体的图。
图7为示出转化细胞内α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因的碱基序列的图。
图8为示出在转化细胞株#18中通过脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)分析确认集落猪内源性逆转录病毒包膜C是否为阴性的结果的图。
图9为示出对转化细胞株#18进行集落免疫荧光染色后通过荧光显微镜观察的结果的图。
图10为示出对转化细胞株#18进行集落免疫荧光染色后通过流式细胞荧光分选(FACS)分析确认的结果的图。
图11为示出有关转化细胞株#18集落的蛋白印迹结果的图。
图12为通过利用作为转化细胞株的细胞株#18的体细胞克隆生产的转基因克隆猪的照片。
图13为示出通过利用作为转化细胞株的细胞株#18的体细胞克隆生产的转基因克隆猪的基因分析的图。
图14为示出利用源自通过利用作为转化细胞株的细胞株#18的体细胞克隆生产的转基因克隆猪血液的外周血单核细胞(PBMCs)进行免疫荧光染色后进行流式细胞荧光分选分析的结果的图。
图15为示出利用通过利用作为转化细胞株的细胞株#18的体细胞克隆生产的转基因克隆猪的耳成纤维细胞进行蛋白印迹的结果的图。
图16为示出利用通过利用作为转化细胞株的细胞株#18的体细胞克隆生产的转基因克隆猪的角膜内皮细胞进行免疫荧光染色后进行流式细胞荧光分选分析的结果的图。
图17为示出利用通过利用作为转化细胞株的细胞株#18的体细胞克隆生产的转基因克隆猪的器官进行组织免疫荧光染色的结果的图。
图18为示出在通过利用作为转化细胞株的细胞株#18的体细胞克隆生产的转基因克隆猪的脾脏细胞中定量活化蛋白C(APC，Activated Protein C)的结果的图。
图19为示出利用通过利用作为转化细胞株的细胞株#18的体细胞克隆生产的转基因克隆猪的耳成纤维细胞进行C3沉积分析的结果的图。
具体实施方式
以下，更为详细地说明本发明。
作为一实施方式，本发明提供如下用于制备异种器官移植用转基因克隆猪的转化细胞：导入α-1,3半乳糖基转移酶敲除用重组载体、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶敲除用重组载体、异球三己糖神经酰胺合酶敲除用重组载体、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2敲除用重组载体、人类CD46表达用重组载体及人类血栓调节蛋白表达用重组载体，猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性。
在本发明中，“载体”是指包含能够在适当的宿主内表达目标基因的、以能够在适当的调控序列作图的方式连接的基因的碱基序列的基因构建物，上述调控序列可以包含能够启动转录的启动子、用于调节上述转录的任意的操纵子序列以及调节转录及解读的终止的序列。本发明的载体只要是能够在细胞内复制的就不受特别限制，可以利用本发明所属技术领域已知的任意的载体，例如，可以为质粒、粘粒、噬菌体颗粒、病毒载体。
在本发明中，敲除用重组载体可以为在一个载体上包含所有用于编码有关α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2的小向导核糖核酸(sgRNA)的碱基序列的形态，或者可以为由多个包含用于编码上述各小向导RNA的碱基序列中的一个以上的个别载体组成的组的形态。即，只要能够包含目标序列，其形态及数量不受限制。在本发明的一实施例中，利用了分别包含有关α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2的小向导RNA的4种敲除用重组载体，其具体的载体图谱如图1所示。
在本发明中，“α-1,3半乳糖基转移酶”基因负责α-半乳糖基转移酶的生物合成，在猪的情况下，由8个内含子和9个外显子构成。上述α-1,3半乳糖基转移酶基因可以为GenBank accession No.AH010595.2。
上述α-1,3半乳糖基转移酶敲除用重组载体的特征在于，识别位于猪1号染色体的4号外显子的由序列1表示的碱基序列位点，即，识别前导序列位点。
在本发明中，“胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶”基因负责N-羟乙酰神经氨酸的生物合成。上述胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶基因可以为GenBank accessionNo.NM_001113015.1。
上述胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶敲除用重组载体的特征在于，识别位于猪7号染色体的9号外显子的由序列2表示的碱基序列位点，即，识别前导序列位点。
在本发明中，“异球三己糖神经酰胺合酶(Isogloboside 3synthase)”基因合成作为鞘糖脂的异球三己糖神经酰胺合酶(igb3)。上述异球三己糖神经酰胺合酶基因可以为Genbank accession No.XM_021095855。
上述异球三己糖神经酰胺合酶敲除用重组载体的特征在于，识别位于猪6号染色体的4号外显子的由序列3表示的碱基序列位点，即，识别前导序列位点。
在本发明中，“β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2”基因合成SDa抗原。上述β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因可以为Genbank accession No.NM_001244330.1。
上述β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2敲除用重组载体的特征在于，识别位于猪12号染色体的1号外显子的由序列4表示的碱基序列位点，即，识别前导序列位点。
在本发明中，上述向导核糖核酸(gRNA)可以通过Cas9蛋白形成复合物，作为把Cas蛋白带向目标DNA的RNA，例如可以从由序列1至序列4表示的DNA转录。换句话说，在本发明中，混用向导RNA序列和与其相对应的DNA序列来使用，本发明所属技术领域的普通技术人员应该明了的是，这是向导RNA包含于载体内并通过转录来表达，实验上可以记载为DNA序列。
在本发明中，“CRISPR-Cas9”为基因剪刀的一种，是在用于基因去除的克隆中使用的。在本发明中，上述Cas9蛋白是指在CRISPR/Cas9***中必须的蛋白质要素，在形成被称为CRISPR RNA(crRNA)及反式激活crRNA(transactivating crRNA，tracrRNA)的两种RNA和复合物时，形成活性核酸内切酶或者切口酶(nickase)。编码Cas9蛋白的基因通常与CRISPR-重复间隔阵列(CRISPR repeat-spacer array)相关，存在有40个以上的互不相同的Cas蛋白家族。代表性的有三个种类的CRISPR-Cas***，其中伴随Cas9蛋白的Ⅱ型CRISPR/Cas***具有代表性。
在本发明中，“基因剪刀”是指从基因组上剪切所希望位点的DNA的技术，是指在基因组上识别特定碱基序列后，精准地剪切相关位点的DNA的基因组编辑(genome editing)技术。
本发明的敲除用重组载体除包含与DNA结合相关的向导RNA(guide RNA)外，还包含用于剪切DNA的化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)游离SpCas9，上述向导RNA的结构域中有能够与DNA内的任意序列结合的克隆位点，可以与基因组DNA(genomic DNA)中所希望的特定序列结合。通过结合于特定位点的向导RNA的诱导及Cas9蛋白的活性来诱导DNA剪切。
在本发明中，hCD46(膜辅因子蛋白)基因负责抑制补体活性。
上述人类CD46表达用重组载体用于导入人类CD46基因，例如，可以为由图2所示的载体图谱组成的载体，但不限定于此。
在本发明中，人类血栓调节蛋白(Thrombomodulin)基因负责抑制血液凝固。
上述人类血栓调节蛋白表达用重组载体用于导入人类血栓调节蛋白基因，例如，可以为由图3所示的载体图谱组成的载体，但不限定于此。
本发明的载体可以包含引物序列，例如，可以包含CAG启动子，此外，还可以利用通常所有被视作与CAG启动子同等的EF1α启动子之类的能够在哺乳动物中表达的启动子。并且，还可以是用ICAM2启动子之类的哺乳动物组织特异性启动子。上述CAG启动子作为基因表达启动子中的一种，用于表达外来基因。
在本发明中，“启动子”通常作为转录的起点，位于带有所要表达的基因的遗传信息的DNA碱基序列的前部分，位于从转录起点开始的数百个碱基以内。在真核生物中，被称为转录调节因子的蛋白质与启动子部分结合，从而参与RNA聚合酶的结合。
在本发明中，“转基因”是指将DNA导入宿主后将DNA作为染色体外因子或者通过染色体整合完成使其能够复制的过程。转基因包括将核酸分子导入有机体、细胞、组织或者器官的任意方法，可以根据宿主细胞选择相关领域公知的适当的标准技术进行，例如，包括电穿孔法(electroporation)、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、显微注射法(microinjection)、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及醋酸锂-二甲基亚砜(DMSO)法等，但不限定于此。为了将通过质粒或者非质粒型裸DNA(naked DNA)的真核细胞的转化与作为细胞的肿瘤化的含义的转化区分开来，也称为“转染(transfection)”，在本发明中使用含义相同。
优选地，上述转化细胞为成纤维细胞，更优选地，为猪的成纤维细胞，但不限定于此。
本发明的转化细胞可以为与2019年1月16日保藏于韩国细胞系研究基金会(KCLRF)的保藏编号为KCLRF-BP-00464的细胞。
作为其他实施方式，本发明提供异种器官移植用转基因克隆猪的制备方法及通过上述方法生产的异种器官移植用转基因克隆猪，上述方法包括：将上述转化细胞移植到脱核的***来形成细胞核移植卵的步骤；以及将上述细胞核移植卵移植到***母的输卵管的步骤。
在本发明中，“细胞核移植”是指将其他细胞的细胞核DNA以人工的方式与没有细胞核的细胞结合来形成相同的性状的基因操作技术，可以使用本发明所属技术领域中公知的方法。
在本发明中，“细胞核移植卵”是指导入或者融合有供体原细胞的***。
在本发明中，“脱核***”是指去除***的细胞核的***。
本发明的转基因克隆猪的特征在于，猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性，通过作为基因剪刀的CRISPR-Cas9***去除α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因的两个座位及异球三己糖神经酰胺合酶基因的一个座位，表达人类CD46及血栓调节蛋白基因，在不发生异种器官移植中发生的猪内源性逆转录病毒的转移的同时，还可以克服超急性及抗原-抗体介导的免疫排斥反应、由血液凝固引起的免疫排斥反应、由补体活性引起的免疫排斥反应。
因此，本发明的转基因克隆猪可以有用地用作用于异种之间的器官及细胞移植的供体动物。
以下，通过实施例详细说明本发明。下述实施例仅用于例示本发明，本发明不受下述实施例的限制。
实施例1.制备α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因的靶向载体
为了敲除猪的α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因，在分析各个基因碱基序列后，确定能够结合向导RNA的外显子的碱基序列位点。在此情况下，用于基因靶向的向导RNA并不是简单地使用公知的向导RNA，而是通过筛选过程确定能够使基因靶向效率最高外显子位点，并预先进行了筛选在相关外显子位点上显出优秀的效果的向导RNA的实验。为了将通过上述过程筛选的向导RNA***载体中，委托博尼(Bioneer)公司合成了上述RNA(序列1至序列4)。各基因的向导RNA的序列、NCBI登录编号、染色***点及外显子位点如表1所示。
表1
为了包含能够与表1所示的猪的α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2的外显子碱基序列位点结合的向导RNA碱基序列，将表2所示的各基因的两种引物杂交后，将其产物分别***Cas9-GFP载体中。更具体地，将各基因的两种引物各100pmol混合后，在95℃的温度下放置10分钟，在85℃的温度下放置10分钟后，以每秒下降0.1℃的速度降至12℃进行杂交。将使用限制酶BbsI剪切杂交的产物的Cas9-GFP载体用作模板，按照不同基因分别使用T4DNA连接酶(T4 DNA ligase)(NEB公司)进行连接及转基因。通过对完成的载体进行序列分析来确认是否导入向导RNA，载体图谱如图1所示(Genotech公司)。
表2
实施例2.制备人类CD46及血栓调节蛋白基因表达载体
为了制备人类CD46及血栓调节蛋白基因表达质粒载体，基于NCBI公开的序列，分别扩增了有关Genbank number D84105.1(人类CD46)、Genbank number J02973.1(人类血栓调节蛋白)的碱基序列。更具体地，为了利用限制酶进行克隆，利用在5'末端***XbaI限制酶序列，在3'末端***EcoRI限制酶序列的引物(人类(human)CD46：正向引物(forwardprimer)(序列13)：5'-TATCTAGAATGGAGCCTCCCGGC-3'，反向引物(reverse primer)(序列14)：5'-CGGATATCTATTCAGCCTCTCTGCTCTGCTGGA-3'；人类血栓调节蛋白：正向引物(序列15)：5'-CCTGGGTAACGATATCATGCTTGGGG-3'，反向引物(序列16)：5'-GACGGAGGCCGAATTCGCTCAGAGTC-3')与以人类互补DNA(cDNA)文库为模板的pfu taq聚合酶进行了基因扩增。对生产的各聚合酶链式反应(PCR)产物进行末端加A(A-tailing)后实施TA-克隆。碱基序列分析后将未经修饰的克隆质粒DNA***由XbaI和EcoRI剪切的pCX载体中。构建的重组载体示意图如图2及图3所示。
实施例3.筛选猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性的个体
为了筛选猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性的个体，在提取各个个体的基因组DNA后，利用表3所示的引物对进行聚合酶链式反应。更具体地，获取各个个体的耳组织后，利用Dneasy Blood&tissue kit(QIAGEN公司，德国)提取各基因组DNA。为了利用提取的基因组DNA及引物进行初始变性，在95℃的温度下反应5分钟后，共反复如下周期35次：在95℃的温度下反应40秒钟，在61℃的温度下反应40秒钟，在72℃的温度下反应1分钟。最后在72℃的温度下反应7分钟。将聚合酶链式反应结果物上样到2％的琼脂糖TAE凝胶，其结果如图4所示。
表3
如图4所示，确认在W16-172个体中猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性。从上述W16-172个体分离出耳成纤维细胞，将其用作之后生产转基因克隆猪的模板细胞。
实施例4.构建α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因被去除并表达人类CD46及血栓调节蛋白基因的转化细胞株
4-1.制备α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因被去除并表达人类CD46及血栓调节蛋白基因的转化细胞珠
利用脂质体3000(Lipofectamine 3000)(Invitrogen公司)向上述实施例3中分离的源自猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性的W16-172个体的成纤维细胞导入实施例1中制备的α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2靶向重组载体。导入靶向重组载体后，利用FACSAriaII设备只对***在Cas9载体中的GFP基因阳性细胞进行第一次筛选。利用脂质体3000将实施例2中制备的人类CD46及血栓调节蛋白表达重组载体两种全都导入第一次筛选的细胞中。为了提高筛选效率，在导入表达载体后利用人类CD46抗体进行了细胞免疫染色，通过利用FACS AriaII设备只分离出人类CD46阳性细胞来第二次筛选转化细胞。其过程如图5所示。
如图5所示，通过FACS AriaII分离的结果确认很好地只分离出了人类CD46阳性细胞。
然后，对利用FACS AriaII设备分离的细胞进行单一细胞集落培养后，进行了集落基因分析。更具体地，利用Dneasy Blood&tissue kit从各转化细胞集落中提取基因组DNA后，利用包含人类CD46及血栓调节蛋白表达重组载体内各个位点的引物(人类CD46正向引物(human CD46 forward primer)(序列27)：CGAGTTTGGTTATCAGATGCA，反向引物(reverseprimer)(序列28)：CGTGCTCTCTCCAATAAGTGA；人类(human)血栓调节蛋白正向引物(序列29)：TACGGGAGACAACAACACCA，反向引物(序列30)：AACCGTCGTCCAGGATGTAG)进行聚合酶链式反应。将获得的聚合酶链式反应产物上样在1％的琼脂糖TAE凝胶，其结果如图6所示。
如图6所示，在多数集落中确认到很好地***了人类CD46及血栓调节蛋白表达载体。
进一步地，利用从转化细胞集落中提取的DNA，利用表4所示的引物对进行聚合酶链式反应以使上述DNA包含α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2靶向位点。获得的聚合酶链式反应产物委托(株)Solgent公司分析碱基序列，其结果如图7所示。
表4
如图7所示，确认到在表达人类CD46及血栓调节蛋白的转化细胞株#18中，作为目标基因位点的α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因的两个座位都被去除，异球三己糖神经酰胺合酶基因的一个座位被去除。
4-2.在筛选的转化细胞株中分析猪内源性逆转录病毒包膜C
在从实施例4-1中筛选的转化细胞株#18中进行猪内源性逆转录病毒包膜C分析。更具体地，利用Dneasy Blood&tissue kit从转化细胞株#18中提取基因组DNA后，利用三篇参考文献中记载的引物进行聚合酶链式反应。将扩增的产物上样在1％的琼脂糖TAE凝胶。
另外，利用Trizol(Ambion公司)方法从实施例4-1中筛选的转化细胞株#18中分离全部RNA后，利用RT-PCR premix(Genetbio公司)以信使RNA(mRNA)为模板进行互补DNA(cDNA)的合成。以合成的互补DNA和提取的DNA为模板进行实时聚合酶链式反应(real-timePCR)。
有关以上实验中使用的引物序列的信息如表5所示，聚合酶链式反应及实时聚合酶链式反应的结果如图8所示。
表5
如图8所示，转化细胞株#18在DNA及RNA水平上都确认到包膜C为阴性。
4-3.在筛选的转化细胞株中分析蛋白质表达
为了在实施例4-1中筛选的#18集落中分析蛋白质表达，进行了免疫荧光染色。更具体地，分别将1×104个野生型(wildtype；WT)和#18集落细胞放入盛有圆玻璃(roundglass)的4孔培养盘中进行培养。使用杜氏磷酸盐缓冲溶液(DPBS)洗涤后，分别将人类CD46抗体、接合有FITC荧光的抗-小鼠抗体、接合有PE荧光的人类血栓调节蛋白抗体以1∶100的浓度在常温下反应1小时。使用1％的***溶液固定染色的细胞后，只分离出圆玻璃来利用荧光显微镜进行分析。其结果如图9所示。
如图9所示，确认相对于野生型，在转化细胞株#18(TG)中很好地表达了人类CD46及人类血栓调节蛋白。
为了在通过如上所述的免疫荧光染色分析的#18集落中进一步分析细胞水平的蛋白质表达，进行了流式细胞荧光分选分析。更具体地，使用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤野生型(wildtype；WT)和#18集落细胞(TG)后，使用0.25％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液处理3分钟后获得细胞。利用胎牛血清(FBS)灭活胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)后，使用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤后利用人类CD46抗体和人类血栓调节蛋白抗体进行染色。使用1％的***溶液固定染色的细胞后，利用FACS caliber II进行分析，其结果如图10所示。
如图10所示，确认相对于野生型，在转化细胞株#18(TG)中很好地表达了人类CD46及人类血栓调节蛋白。
为了进一步确认蛋白质表达，进行了蛋白印迹分析。更具体地，使用包含蛋白酶灭活剂的RIPA缓冲液分别处理野生型(wild-type；WT)和#18集落细胞(TG)后，利用超声波粉碎机进行粉碎。通过离心分离获得上清液后，上样到SDS-PAGE凝胶后移动到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，利用5％的脱脂牛奶进行封闭(blocking)。使用包含人类CD46抗体和人类血栓调节蛋白抗体的5％的脱脂牛奶处理封闭的膜，使用第二抗体处理上述膜后进行反应。反应结束后，使用ECL溶液处理后利用chemiDoc imaging system(BioRAD公司)进行分析。其结果如图11所示。
如图11所示，确认相对于野生型，在转化细胞株#18(TG)中很好地表达了人类CD46及人类血栓调节蛋白。
通过以上实验确认的转化细胞株#18以H-01的名称于2019年1月16日保藏于韩国细胞系研究基金会(KCLRF)，保藏编号为KCLRF-BP-00464。
实施例5.制备α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因被去除并表达人类CD46及血栓调节蛋白基因的转基因猪
5-1.准备***(oocyte)
获得未成熟的母猪的卵巢后，放入35℃的0.9％的NaCl溶液中运输到实验室。使用固定有18-gauge的针头的10mL的一次性注射器从直径为2mm-6mm的窦卵泡(antralfollicle)吸取卵丘-***复合体(COCs，Cumulus-oocyte complexes)。使用包含0.1％的聚乙烯醇、3.05mM的D-葡萄糖、0.91mM的丙酮酸钠、0.57mM的半胱氨酸、0.5μg/mL的促***(LH)(L-5269，Sigma-Aldrich Corp.公司，圣路易斯，密苏里州，美国)、0.5μg/mL的***(FSH)(F-2293，Sigma-Aldrich Corp.公司)、10ng/mL的表皮生长因子(E-4127，Sigma-Aldrich Corp.公司)、75μg/mL的青霉素G及50μg/mL的链霉素的TCM 199(31100-035，Gibco Grand Island公司，纽约，美国)洗涤卵丘-***复合体3次。将约50-60的卵丘-***复合体移到覆盖有矿物油的4孔多用培养皿(Nunc公司，罗斯基勒，丹麦)后，加入500mL的相同的培养基，在5％的CO2及39℃的条件下培养。
5-2.细胞核移植
细胞核移植(nuclear transfer)是稍微修正Park等(Biol.Reprod.66:1001-1005，2002)的方法后进行的。更具体地，培养42小时至44小时后，在包含0.1％的聚乙烯醇(PVA)及0.2％的透明质酸酶的TL-HEPES中强烈涡旋4分钟来从卵丘细胞(cumulus cell)中分离出***。在包含0.3％的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich Corp.公司，A-8022)及7.5μg/mL的细胞松弛素B的TCM 199中利用毛细玻璃移液管吸入第一极体及相邻细胞质来从无-卵丘细胞的***中去除细胞核。在体细胞核移植(SCNT)之前，为了血清饥饿(serum starvation)，在包含0.5％的胎牛血清的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM)中培养上述实施例4中制备的供体细胞3天。将单一供体细胞放在细胞与***膜接触的***的围卵腔(perivitelline space)中。在由0.3M的甘露醇、1.0mM的CaCl2H2O、0.1mM的MgCl26H2O及0.5mM的HEPES组成的培养基中，将接种的***配置于直径为0.2mm的间隔1mm的铂电极之间。融合/激活(Fusion/activation)是在30微妙(μs)(BTX公司，美国)内通过连续施加两次1.1kV/cm的直流(DC)脉冲来诱导的。之后，将20个至30个重构胚胎(reconstructed embryos)移到覆盖有矿物油的4孔用培养皿后，放入补充500mL的0.4％的牛血清白蛋白的北卡罗来纳州立大学(NCSU，North Carolina State University)-23培养基。培养1天或者2天后，通过外科手术的方式将NT胚胎移植到处于发情期(standingestrus)第一天的母猪的输卵管。妊娠状态是通过超声波扫描仪(Mysono 201，MedisonCo.，LTD公司，首尔，韩国)确认的。
实施例6.验证α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因被去除并表达人类CD46及血栓调节蛋白基因的转基因猪
6-1.转基因克隆猪的确认
上述实施例5中制备的转基因猪(#1)的外形如图12所示。
并且，为了确认上述转基因猪的碱基序列，获得产仔的成纤维细胞后，分析猪内源性逆转录病毒包膜C及是否转基因。其结果如图13所示。
如图13所示，确认在上述实施例5中制备的转基因猪(#1)的成纤维细胞中正常实现了人类CD46及血栓调节蛋白基因的导入，并且猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性。
6-2.验证转基因克隆猪
分离源自上述实施例6-1中确认的转基因克隆猪#1的血液的外周血单核细胞后，对各缺失的基因进行了流式细胞荧光分选分析。更具体地，使用注射器分别从野生型、TKO(α-1,3半乳糖基转移酶/胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶/异球三己糖神经酰胺合酶三敲除(triple knock-out))、QKO(猪内源性逆转录病毒包膜C(PERVc)+α-1,3半乳糖基转移酶/胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶/异球三己糖神经酰胺合酶/β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2四敲除(quadra knock-out))及本发明的C-QKO(猪内源性逆转录病毒包膜C-α-1,3半乳糖基转移酶/胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶/异球三己糖神经酰胺合酶/β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2四敲除(quadra knock-out)，hCD46/h血栓调节蛋白)等个体中采血后，在杜氏磷酸盐缓冲溶液中以1∶1的比例稀释。以1∶1(体积/体积)的比例将稀释的血液放入ficoll-paque(GE healthcar公司)后，以500g离心分离40分钟。分离中间的血沉棕黄层后，使用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤后，利用各基因的抗体进行流式细胞荧光分选分析。其结果如图14所示。
如图14所示，确认到与对照组比较来看，在源自本发明的转基因克隆猪(C-QKO)的外周血单核细胞中，基因(α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2)都正常地缺失，没有生成蛋白质。
并且，获得源自野生型和转基因克隆猪#1的耳成纤维细胞后，利用其进行了用于确认人类CD46及血栓调节蛋白表达的蛋白印迹分析。其结果如图15所示。
如图15所示，确认在源自本发明的转基因克隆猪#1的耳成纤维细胞(TG)中很好地生成了人类CD46及血栓调节蛋白基因。
进一步地，为了确认各不同组织的蛋白质表达，分离了源自转基因克隆猪#1的角膜内皮细胞，利用人类CD46及血栓调节蛋白抗体进行了流式细胞荧光分选分析。具体地，使用70％的酒精处理源自野生型和转基因克隆猪的眼球5分钟来去除外皮后，去除角膜缘和角膜后，只将内侧的内皮层切割为5mm的大小。使用0.25％的胰蛋白酶(trypsin)-乙二胺四乙酸溶液处理30分钟后，在显微镜观察下使用玻璃针刮后弹力层(Emebraan vanDescemet)来分离内皮细胞，以1500rpm的转速离心分离3分钟后只获取颗粒来进行培养。利用人类CD46及人类血栓调节蛋白抗体对培养的细胞进行细胞免疫染色及流式细胞荧光分选分析。其结果如图16所示。
如图16所示，确认到相对于野生型，在源自本发明的转基因克隆猪#1的角膜内皮细胞(TG)中检测到由人类CD46及血栓调节蛋白基因发出的荧光信号。
然后，将从同一母腹中出生的具有相同基因性状的个体安乐死后进行组织免疫染色，具体地，将野生型和转基因个体的心脏和肾脏制备为石蜡块后，进行脱蜡。将其封闭后，利用人类CD46及人类血栓调节蛋白抗体进行免疫荧光染色后，利用DAB试剂在显微镜下分析图像。其结果如图17。
如图17所示，确认到相对于野生型，在具有与本发明的转基因克隆猪#1相同的基因性状的转基因克隆猪中，人类CD46及血栓调节蛋白呈DAB阳性。尤其在心脏内血管、心肌、肾脏内肾小球中确认到强阳性，基于本结果确认人类CD46及血栓调节蛋白在肌肉及血管中很好地表达了。
实施例7.分析α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、异球三己糖神经酰胺合酶及β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因被去除并表达人类CD46及血栓调节蛋白基因的转基因猪的功能
7-1.验证活化蛋白C(Activated Protein C；APC)
已知人类血栓调节蛋白基因与凝血酶结合生成凝血酶-血栓调节蛋白复合物后激活蛋白C来起到抗凝剂及抗炎剂的作用，因此将其判断为可以解决异种器官移植时发生的血液凝固的问题的方案。据此，对作为抗凝剂的标志物的活化蛋白C进行定量来确认转基因克隆猪中蛋白C的生成量。具体地，将野生型及具有与本发明的转基因克隆猪(#1)具有相同的基因性状的个体安乐死后，获取了106个脾脏细胞(splenocyte)。使用人凝血酶(Merck，Australia)和蛋白C(Merck公司，澳大利亚)处理获得的脾脏细胞30分钟后，使用水蛭素(Merck公司，澳大利亚)处理来使反应停止。以2000rpm的转速离心分离5分钟获得上清液后，分株于96孔培养板。向其处理1mM的Spectrozyme PCa1(American Diagnostica公司，美国)后使用NanoQuant(Tecan公司)设备在37℃的温度下以405nm的波长测定吸光度值。其结果如图18。
如图18所示，确认到相对于野生型，在本发明的转基因猪(TG)的脾脏细胞中生成更多的活化蛋白C。通过本结果预想，在利用本发明的转基因猪进行异种器官移植时，抑制因生成人类血栓调节蛋白引起的血液凝固，从而延长受供者的存活时间。
7-2.验证C3沉积(C3 deposition)
异种器官移植时超急性免疫排斥反应之后由补体活性引起的免疫反应是应该调节的问题之一。在补体活性抑制基因中，已知hCD46(膜辅因子蛋白)使Factor I在膜上与补体活性成分的C3b或者C4b结合，Factor I与CD46通过使C3b灭活(Inactivated C3b)来抑制补体的活性。
与此相关地，获得源自野生型和转基因克隆猪(#1)的耳成纤维细胞后，分别使用12.5％、25％、37.5％、50％的普通的人类血清(Normal Human Serum；NHS)处理2天后，利用C3抗体进行流式细胞荧光分选分析。其结果如图19所示。
如图19所示，确认到相对于野生型，在源自本发明的转基因猪(TG)的耳成纤维细胞中，C3沉积更少。通过本结果预想，在本发明的转基因猪中，因表达人类CD46基因而减少了C3沉积，因此在异种器官移植时抑制补体活性并减少免疫排斥反应，从而延长受供者的存活时间。
综上所述，通过上述实验确认本发明的转基因克隆猪具有如下特征：猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性，通过作为基因剪刀的CRISPR-Cas9敲除了α-1,3半乳糖基转移酶、胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶、β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2及异球三己糖神经酰胺合`等4个基因，表达人类CD46及血栓调节蛋白基因。由此，本发明的转基因克隆猪在不发生异种器官移植中发生的猪内源性逆转录病毒的转移的同时，还可以克服超急性及抗原-抗体介导的免疫排斥反应、由血液凝固引起的免疫排斥反应、由补体活性引起的免疫排斥反应，从而可以将其有效用作用于异种间器官及细胞移植的供体动物。
Claims (10)
1.一种转化细胞，用于制备异种器官移植用转基因克隆猪，其特征在于，
导入如下重组载体：
α-1,3半乳糖基转移酶敲除用重组载体；
胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶敲除用重组载体；
异球三己糖神经酰胺合酶敲除用重组载体；
β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2敲除用重组载体；
人类CD46表达用重组载体；以及
人类血栓调节蛋白表达用重组载体，
猪内源性逆转录病毒包膜C为阴性。
2.根据权利要求1所述的转化细胞，其特征在于，上述α-1,3半乳糖基转移酶敲除用重组载体识别猪1号染色体的4号外显子并敲除α-1,3半乳糖基转移酶基因。
3.根据权利要求1所述的转化细胞，其特征在于，上述胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶敲除用重组载体识别猪7号染色体的9号外显子并敲除胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶基因。
4.根据权利要求1所述的转化细胞，其特征在于，上述异球三己糖神经酰胺合酶敲除用重组载体识别猪6号染色体的4号外显子并敲除异球三己糖神经酰胺合酶基因。
5.根据权利要求1所述的转化细胞，其特征在于，上述β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2敲除用重组载体识别猪12号染色体的1号外显子并敲除β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺转移酶2基因。
6.根据权利要求1所述的转化细胞，其特征在于，人类CD46表达用重组载体由图2所示的载体图谱组成。
7.根据权利要求1所述的转化细胞，其特征在于，人类血栓调节蛋白表达用重组载体由图3所示的载体图谱组成。
8.根据权利要求1所述的转化细胞，其特征在于，上述转化细胞的保藏编号为KCLRF-BP-00464。
9.一种异种器官移植用转基因克隆猪的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1至8中任一项所述的转化细胞移植到脱核的***来形成核移植卵的步骤；以及
将上述核移植卵移植到***母的输卵管的步骤。
10.一种异种器官移植用转基因克隆猪，其特征在于，通过权利要求9所述的方法生产。
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