JP4590629B2 - Psf1遺伝子欠損動物およびその利用方法 - Google Patents
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Description
1)Psf1遺伝子またはその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および/または他の配列の挿入を目的としたターゲッティングベクターを作製する;
2)上記ベクターをES細胞に導入し、該ベクターで相同組換えされたES細胞を得る;
3)上記組換えES細胞を初期胚に導入し、発生させてキメラ動物を得る;
4)上記キメラ動物を野生型動物と交配して得られるF1ヘテロ接合体動物同士を交配し、得られるF2動物またはその子孫から染色体上のPsf1遺伝子の機能が欠損している動物を得る。
本発明のPsf1遺伝子欠損動物は、Psf1遺伝子の機能研究はもとより、骨髄抑制疾患のモデル動物としても好適に利用することができる。そのような骨髄抑制疾患としては、例えば、再生不良性貧血、抗がん剤投与、放射線被爆(照射)による遷延性の骨髄機能抑制症、自己免疫疾患に伴う骨髄抑制、種々の細菌、ウイルス感染による骨髄抑制、医薬品による副作用としての骨髄抑制、原因不明の骨髄抑制等を挙げることができる。
本発明は、染色体上のPsf1遺伝子の機能が欠損している非ヒト哺乳動物に関する。
本発明にかかる「Psf1遺伝子」とは、出芽酵母Dpb11に関する研究で、SLD5に結合する因子(Partner of Sld Five)として見出された遺伝子である。Sld5、Psf1、Psf2、Psf3で形成される複合体は出芽酵母においてDNA複製に不可欠であることが報告されているが、その詳細な機能はわかっていない。
本発明のPsf1遺伝子欠損動物は、ジーンターゲッティング、Cre-loxPシステム、体細胞クローン等の技術を利用することにより作製することができる。
ジーンターゲッティングは、相同組換えを利用して染色体上の特定遺伝子に変異を導入する手法である(Capeccchi, M.R. Science, 244, 1288-1292, 1989, Thomas, K.R. & Cpeccchi, M.R. Cell, 44, 419-428, 1986)。
まず、Psf1遺伝子を欠損させるためのターゲッティングベクターを構築する。ターゲッティングベクターの構築に先立って、使用する動物のゲノムDNAライブラリーを調製する。このゲノムDNAライブラリーは、多型等による組換え頻度の低下が起こらないよう、使用する動物のES細胞、または当該細胞が由来する系統のゲノムDNAから作製したライブラリーを用いる必要がある。そのようなライブラリーとしては市販のもの(例えば、Stratagene社製 129Sv/Jゲノムライブラリー等)を用いてもよい。ゲノムライブラリーは、標的とするPsf1 cDNAまたはその部分配列をプローブとしてスクリーニングを行い、Psf1ゲノムDNAをクローニングする。
次に、構築されたターゲティングベクターを胚性幹細胞(ES細胞)等の全能性を有する細胞に導入する。ES細胞は、マウス、ハムスター、ブタ等では細胞株が樹立されており、特にマウスでは、129系マウス由来のK14株、E14株、D3株、AB-1株、J1株や、R1株、TT2株等、複数の細胞株が入手可能である。また、マウスではES細胞に代えて胚性ガン腫細胞(EC細胞)を利用することもできる。
ターゲッティングベクターが導入されたES細胞(組換えES細胞)は、ES細胞が由来する系統とはコートカラーが明らかな相違を有する別な系統由来の初期胚に導入し、キメラ動物として発生させる。例えば、マウスであれば、アグーチ色の毛色を有する129系由来のES細胞に対しては、黒色の毛色を有し、マーカーとして利用できる各種遺伝子座が129系マウスとは異なっているC57BL/6マウス等の初期胚を用いることが望ましい。これにより、キメラマウスはその毛色によって、キメラ率を判断することができる。
仮親から得られたキメラ動物は、さらに同系の野性型動物と交配する。得られる動物の約半分は、Psf1遺伝子欠失染色体をヘテロで有するはずである。各個体のジェノタイプは、毛色等の外見上の特徴で一時判定できるほか、前述したサザンブロッティングやPCR法を利用したジェノタイプ解析によって決定することができる。こうして、ヘテロ型のPsf1遺伝子欠損動物が同定されたら、このヘテロ型のPsf1遺伝子欠損動物同士を交配して、Psf1遺伝子の欠損をホモで有する動物を得ることができる。
ジーンターゲッティングにバクテリオファージP1由来のCre-loxPシステムを利用して、部位特異的、時期特異的に標的遺伝子を欠損させる方法(Kuhn R. et al., Science, 269, 1427-1429, 1995)もある。loxP(locus of X-ing-over)配列は34塩基対からなるDNA配列でCre(Causes recombination)組換え酵素の認識配列である。遺伝子上の2つのloxP配列はCre蛋白の存在下で特異的組換えを起こす。すなわち、欠損させたい標的遺伝子をloxPで挟んだものに置換し、さらにCre発現ベクターを組み込めば、部位特異的・時期特異的なCre蛋白の産生により、loxPで挟まれた標的遺伝子を欠失させることができる。
ES細胞が利用できない動物の場合、体細胞クローン(I. Wilmut et al, Nature, Vol.385, 810-813, 1997、A. E. Schnieke et al, Science, Vol.278, 2130-2133, 1997)を利用してPsf1遺伝子欠損動物を作製することも可能である。体細胞クローンとは、体細胞から取り出した核を、脱核した未受精卵に移植してクローン胚を作製し、このクローン胚を仮親の子宮に移植して発生させたクローンである。この体細胞クローンに遺伝子導入技術を組み合わせれば、所望の組換え動物クローンを得ることができる。すなわち、予めPsf1遺伝子を欠損させる組換え操作を行った体細胞から核を取り出し、これを脱核した未受精卵に移植して、クローン胚を作製する。このクローン胚を仮親(偽妊娠動物)の子宮に移植して、体細胞クローン動物を得れば、この動物はPsf1遺伝子の欠損を有することになる。
本発明のPsf1遺伝子欠損動物において、同腹の野生型動物とは異なる表現型が現れた場合、それはPsf1遺伝子の欠損に起因することが予測される。例えば、Psf1遺伝子欠損マウスでは、以下に代表される変化が認められた。
1)ホモ欠損による着床後の早期致死
2)ヘテロ欠損マウスにみられる骨髄抑制(少量の5-FU投与で骨髄機能抑制で致死となる)
(1)骨髄抑制モデル動物
従来より造血幹細胞移植には致死量放射線照射し骨髄機能を抑制する手段が一般的に使われてきたが、本発明のPsf1遺伝子欠損マウスでは少量の5-FU投与で骨髄機能抑制により致死となるため、放射線照射をしなくても造血機能を観察する実験系に使用することができる。
本発明のPsf1欠損マウスに5-FUを投与すると、相対的に造血幹細胞が骨髄中に増加するため、細胞をソートすることなく簡単に造血幹細胞が高頻度に含まれる細胞集団を得ることができる。得られる造血幹細胞は、種々の実験や薬剤スクリーニングに有用である。
Psf1遺伝子はいわゆる幹細胞レベルの細胞に広く発現しており、様々な幹細胞のDNA複製を制御していると予測される。したがって、Psf1遺伝子の制御(Psf1遺伝子の強制的高発現など)により、幹細胞の自己複製/増殖を誘導できる可能性がある。すなわち、Psf1遺伝子は、造血幹細胞をはじめ種々の幹細胞の試験管内増幅技術にも応用できる。特に、近年、がんはがん幹細胞による幹細胞システムの異常によると考えられているが、Psf1遺伝子の機能抑制によって、がん幹細胞の細胞死誘導法も開発することができる。
本発明のPsf1遺伝子欠損動物は、個体レベルでのPsf1の機能や作用メカニズムの解明に有用である。こうした個体レベルでの機能解明には、恒常的なPsf1の発現抑制に加えて、前述したCre-loxPシステム等を利用した、部位特異的、時期特異的Psf1の発現抑制が有用である。
1.試験方法
(1)RT-PCR法によるマウスPsf1の発現解析
マウスの種々の組織(脳、心臓、肺、胸腺、肝臓、脾臓、骨髄、精巣、卵巣)から全RNAを抽出し、SuperscriptII逆転写酵素とoligo d(T) (共にInvitrogen製)を用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型にしてExTaq DNAポリメラーゼ(TaKaRa製)を用いてPCRを行った。GAPDHの増幅には5’-acc aca gtc cat gcc atc ac-3’(配列番号3)と5’-tcc acc acc ctg ttg ctg ta-3’(配列番号4)を、Psf1の増幅には5’-tta aga aat aga cgc tgc acg a-3’ (配列番号5)と5’-tgc cat cat caa ctt caa att c-3’ (配列番号6)をプライマーに用いた。
胎生11日のマウスのパラフィン包埋切片を作成し、抗Psf1抗体を用いて免疫染色法を行った。図3(A)の実験には2次抗体にビオチンで標識された抗ウサギIgG抗体を、3次試薬にABC-HRP複合体(Dako製)を用いた。発色にはDAB (Sigma製)を用いた。図3(B)ではCy3で標識された抗ウサギIgG抗体を2次抗体に用いた。
NIH3T3細胞について図3(B)と同様に蛍光免疫染色を行った。染色体DNAはDAPI(ナカライ製)を用いて染色した。
(1)マウスPsf1の発現解析結果
図2にマウスPsf1の発現解析結果を示す。マウスの成体組織ではPsf1転写産物は骨髄、胸腺、精巣、卵巣で確認された。骨髄細胞では分化・成熟した細胞群(Lin+)ではPsf1の発現は検出されなかったが、未分化な細胞群(Lin+KIT+、Lin-KIT+Sca-1-、Lin-KIT+SCA-1+)のうち特にLin+KIT+おおびLin-KIT+Sca-1-の細胞群でPsf1の高い発現を検出した。一方、腫瘍細胞株では恒常的にPsf1の発現が検出された。
図3にPsf1の胎児組織内局在を示す。胎児組織では間葉系細胞、AER領域、心臓、背側大動脈に特異的にPsf1が発現していた。
図4にNIH3T3細胞におけるPsf1の細胞内局在を示す。Psf1の細胞内局在は細胞周期に依存して変化していた。すなわちPsf1は、間期では細胞核に局在し、M期では細胞質に局在していた。
1.試験方法
(1)Psf1遺伝子欠損マウスの作製
ジーンターゲッティングにより、以下のようにしてPsf1遺伝子欠損マウスを作製した。まず、129SV/Jマウスのゲノムライブラリー(Stratagene製)を、前述のmouse Psf1 cDNA配列(配列番号1)をプローブとしてスクリーニングを行い、マウスPsf1ゲノムクローンを複数個同定した。得られたクローンよりDNAを抽出し、pBluescriptII(Stratagene製)にサブクローニングした。配列決定、制限酵素消化、サザンブロット法等を行いPsf1遺伝子の制限酵素マップを作製した。得られたPsf1のゲノム断片を用いて以下のようにターゲッティングベクターを作製した。LacZ遺伝子(レポーター;pCMVb(Stratagene製)に由来)とpGKneo(ポジティブセレクションマーカー;金沢大、浅野雅秀より分与)をつないだLacZ-Neoカセットに、得られたゲノム断片を鋳型にてPCR法で増幅したShort Arm(イントロン5の5’末端領域)およびLA2(イントロン4の3’末端領域)をそれぞれ3’、5’側つないだ。さらにLA2の5’側にイントロン4の一部配列とネガティブセレクションマーカーとしてジフテリア毒素フラグメントA遺伝子(DT)を組換えた。このターゲティングベクターによりエクソン5のほぼ全てがLacZ-Neoカセットに置き換わり全長の約20%のアミノ酸が欠失することになる(図5)。
野生型アリル:
Forward primer: 5’-ggaattcggccccccaaaagcctatatat-3’ (配列番号7)
ReversPsf1imer: 5’-catcccagatcgttcttgttaacc-3’ (配列番号8)
変異アリル:
Forward primer: 5’-ccgaacgcgtataacttcgtatagc-3’ (配列番号9)
ReversPsf1imer: 5’-catcccagatcgttcttgttaacc-3’ (配列番号10)
表1にジェノタイピングの結果を示す。
・ 試験方法
(1)ブラストシストの試験管内培養(図7)
妊娠3.5日目に子宮を還流しブラストシストを採取する。これを0.1%ゼラチンでコートしたプラスチック皿上にES培地中で6日間培養した。BrdU(5-bromo-2'deoxy-Uridine)(Sigma製)の取込み実験では培地中に最終濃度が10mMになるようにBrdUを添加し12時間培養した。取り込まれたBrdUの検出は抗BrdU抗体(Zymed製)を用いた。
野生型のあるいはPsf1遺伝子のヘテロ欠損体のブラストシストを培養するとICM (inner cell mass)が盛んに***し、トロフォブラスが培養皿の表面に接着して増殖するが、Psf1遺伝子のホモ欠損体のブラストシストではICMの盛んな細胞***が見られなかった(図7)。さらにICMのBrdUの取込みもほとんど検出されなかった(図8)。このことからPsf1は初期胚の細胞***に必須である事が解った。
1. 試験方法
実施例2で作製したPsf1遺伝子欠損(+/-)マウスと野性型マウス(6週齢、各N=5)に、150mg/kgの5-FU(Sigma製)を静脈投与し、その影響を比較した。結果を図9(A:生存、B:血中MNC、C:骨髄MNC)および図10に示す。
(1)生存率
野生型マウスはすべて生存していたが、Psf1遺伝子欠損マウスは1週間以内に全て死んだ。野生型マウスは、350mg/kg(LD50に対応する)の5-FUを投与した場合でも、半数が生存していた。
両マウスで血中MNC変化に大きな違いは認められなかったが、骨髄MNCについては、野生型マウスでは回復がみられたのに対し、Psf1遺伝子欠損マウスでは全く回復がみられなかった。
Psf1遺伝子欠損(+/-)マウスと野性型マウスの全骨髄細胞の形態をFACSで解析した。Psf1遺伝子へテロ欠損マウスでは5-FU投与後にFSCが高い細胞集団(リンパ球、単球、顆粒球などの白血球)の増加が殆ど見られなかった。野生型の場合はLin(Mac-1を除く)-Sca-1+KIT+の造血幹細胞は5-FU処理後はMac-1を中程度発現するようになるが、Psf1遺伝子へテロ欠損マウスではMac-1を発現する***中の幹細胞の出現がほとんど見られなかった。5-FU投与後5日に幹細胞集団(Lin(Mac-1を除く)-Sca-1+KIT+)のDNA含有率を解析するとPsf1遺伝子へテロ欠損マウスでは大部分の細胞でDNA合成が行われておらずG1期に留まっていることが解った。
配列番号4−プライマー
配列番号5−プライマー
配列番号6−プライマー
配列番号7−プライマー
配列番号8−プライマー
配列番号9−プライマー
配列番号10−プライマー
Claims (6)
- 染色体上の一方のアレルにおけるPsf1遺伝子の機能が欠損している骨髄抑制モデル非ヒト哺乳動物。
- Psf1遺伝子の機能が、Psf1遺伝子またはその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および/または他の配列の挿入によって染色体上の一方のアレルで欠損している、請求項1記載の骨髄抑制モデル非ヒト哺乳動物。
- 以下の工程で作製される、請求項1または2に記載の骨髄抑制モデル非ヒト哺乳動物:
1)Psf1遺伝子またはその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および/または他の配列の挿入を目的としたターゲッティングベクターを作製する;
2)上記ベクターをES細胞に導入し、該ベクターで相同組換えされたES細胞を得る;
3)上記組換えES細胞を初期胚に導入し、発生させてキメラ動物を得る;
4)上記キメラ動物を野生型動物と交配して得られるF1ヘテロ接合体動物同士を交配し、得られるF2動物またはその子孫から染色体上の一方のアレルにおけるPsf1遺伝子の機能が欠損している動物を得る。 - 非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の骨髄抑制モデル非ヒト哺乳動物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の骨髄抑制モデル非ヒト哺乳動物に、骨髄抑制剤を投与し、該動物の骨髄から造血幹細胞を取得する方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の骨髄抑制モデル非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、該動物における骨髄機能を改善する該被験物質の効果を評価することを含む、骨髄機能改善剤のスクリーニング方法。
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