KR101911515B1 - 단계별 면역거부반응 억제 다중유전자가 α-Gal 유전자에 적중된 복합형질전환 세포주 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이종장기 이식 시에 발생할 수 있는 단계별 면역거부반응을 억제하는 유전자들이 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase) 유전자에 적중된 복합형질전환 벡터가 형질전환된 복합 형질전환 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 이종 이식 시 발생하는 일련의 면역 거부반응을 한번에 조절 가능한 다중 유전자 형질전환된 세포주를 확인함으로써, 다양한 인공 장기 효율적인 생산 및 복합형질전환 복제돼지 생산에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 이종장기 이식 시에 발생할 수 있는 단계별 면역거부반응을 억제하는 유전자들이 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase) 유전자에 적중된 복합형질전환 벡터가 형질전환된 복합 형질전환 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이종 이식(Xenotransplantation)은 인간의 장기를 대체할 수 있는 여러 가지 방법 중 하나이며, 대체장기를 공급하는 동물로는 원숭이, 돼지 등 여러 동물이 시도되어 왔다. 최근까지 이종 이식은 장기이식 분야를 중심으로 발전하였다. 이종장기나 세포의 공급원으로는 이종 장기이식이 처음 시도되던 1963년경에는 바분 원숭이(Baboons)와 같은 영장류가 많이 사용되었다. 특히, 이종이식의 아버지라 불리는 Reemtsma는 침팬지의 신장을 신부전 환아에게 이식하여 최장 9개월의 생존을 유지하였으며(Reemtsma K, et al. Ann Surg 1964;160:384-410.), 1984년에는 Bailey에 의해서 선천성 심장질환이 있는 Baby Fae에게 바분 원숭이의 심장을 이식하여 20일간 유지한 바 있다(Bailey LL, et al. JAMA 1985;254:3321-9.). 그러나, 영장류는 멸종 위기종일 뿐만 아니라 번식이 어렵고, 이종장기 공급원으로 활용하기에는 사회적 거부감이 높으며, 높은 감염의 위험성을 갖고 있어서, 영장류 이외의 동물을 검토한 결과 미니돼지가 적절한 이종장기 공급원으로 선정되었다. 미니돼지는 사람과 같은 크기의 돼지로서 장기의 크기가 사람과 매우 유사하고, 임신 기간이 127일로 짧아서 번식이 용이하며, 한꺼번에 많은 수의 새끼(6 내지 12 마리)를 낳을 수 있는 장점이 있으며, 사람과 오랜 시간을 같이 지낸 동물이어서 사람에게 치명적인 감염원을 보유할 가능성이 낮다. 또한, 형질전환 무균사육이 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 돼지의 장기를 인체에 이식할 경우, 동종이식보다 훨씬 심각한 이종이식 거부반응(xenograft rejection)이 일어난다. 이러한, 이종이식 거부반응을 극복하고 이식 초기의 급격한 이종장기 손상을 방지하여 안정적인 이식 기능을 유지하도록 하기 위하여, 면역거부반응을 조절하여 면역관용을 유도하거나 장기의 생존율 증가를 유도할 수 있는 유전자를 삽입 또는 제거한 형질전환돼지의 개발이 필수적이다.
이종장기이식을 하는 경우에는 동종이식보다 강하고 빠른 거부반응이 일어나는데, 이종장기이식 거부반응은 발생 순서 또는 단계에 따라 초급성 거부반응(hyperacute rejection, HAR), 급성혈관성 거부반응(acute vascular rejection, AVR), 급성세포매개성 거부반응(cell mediated rejection, CMR)으로 분류한다.
초급성 거부반응은 돼지에 존재하는 항원에 대해 인간이 이미 가지고 있는 자연항체(xenoreactive natural antibody; XNR)가 반응함에 따라 발생하는 거부반응이다. 이 거부반응은 ABO 혈액형 부적합 장기이식에서 관찰되는 급격한 초급성 거부반응과 유사해서 이식 후 수분 또는 수 시간 내에 이식된 장기 혈관에 혈전이 생성되고 괴사에 이르는 심한 손상이 발생한다. 이러한 초급성 거부반응의 주원인은 (1) 돼지 내피세포에 다량 존재하는 알파갈(Galactose-α1,3-Galactose,α-Gal)에 대한 자연항체 반응 및 (2) 혈청 보체 조절인자(complement regulatory proteins, CRPs)의 분자호환성 결여에 따른 과도한 혈청보체 활성화에 의한 손상이다. 인간은 돼지가 가지고 있는 알파갈 갈락토실트렌스퍼라제(α-1,3-galactocyltransferase)가 없기 때문에 돼지에 존재하는 당단백질인 알파갈에 대한 자연항체를 가지고 있어서, 돼지의 장기가 인간에게 이식되었을 경우 격렬한 항원-항체 반응이 일어난다. 이 항원-항체 반응이 일어나면 혈청보체가 활성화되면서 2차적인 조직 손상이 일어나는데, 혈청 보체 활성화를 조절하는 혈청 보체 조절인자가 인간과 돼지 사이에 종간 호환성이 없기 때문에 혈청 보체 활성화가 지속적으로 발생하여 조직 손상이 가속화된다. 초급성 거부반응을 극복하기 위해 인간 디코이 가속 인자(human decay accelerating factor; hDAF) 유전자 등의 인간 혈청 보체 억제 유전자를 발현시키거나(Pruitt SK, et al. Transplantation 1994;57:363-70.), 알파갈 항원을 결손 시킨 돼지가 제작되었다(Tseng YL, et al. Transplantation 2005;80:1493-500.). 초급성 거부반응은 혈관 접합이 이루어지는 고형 장기 이종이식에서는 격렬하게 나타난다.
급성혈관성 거부반응은 혈관 내피세포가 2차적으로 활성화되어 선천성 면역세포의 침윤과 함께 혈액응고 현상이 나타나는 것이 특징이다. 알파갈이 결손된 상황이라고 해도 알파갈 이외의 돼지 특이 항원이 존재하므로 이에 대한 항체 반응이 미약하게 유발되고, 허혈성 손상, 분자 적합성의 결여 등에 의해서도 혈관 내피세포가 활성화되어 섬유소(fibrin)가 침착되고, 선천성 면역반응계 세포의 침윤이 일어난다. 이를 극복하기 위해서는 선천성 면역반응 조절과 함께 항응고 유전자를 과발현 시키거나, 섬유소 분해를 촉진하는 유전자를 도입한 형질전환 돼지의 개발이 필요하다. 이종이식의 급성혈관성 거부반응에서 관찰되는 선천성 면역거부반응의 주요 매개 기전을 효과적으로 차단하는 것이 이종이식 장기 생존에 중요한 역할을 할 것으로 추정된다.
가장 후기에 관찰되는 급성세포매개성 거부반응은 동종이식에서 흔하게 관찰되는 세포매개성 거부반응과 유사하며, 임파구 등 면역 세포에 의해 발생하는 거부반응으로 선천성 면역반응보다는 후천성 면역반응이 주로 관여하며, 이식 후부터 수개월까지 발생하는 거부반응이라고 알려져 있다. 그러나 이종이식 시의 급성세포매개성 거부반응은 동종이식보다 강력할 것으로 예상된다. 예를 들면, 혈관 연결이 필요 없고, 알파갈 항원이 모두 존재하는 래트에서 마우스 사이에서 이종피부 이식을 해 보면, 이종피부 이식의 생존기간이 주 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 부적합 마우스 사이에 동종피부이식에서 생존기간이 짧아짐을 볼 수 있다. 그 원인을 살펴보면, 이종이식에는 보다 심한 중성구와 단핵구의 침착이 관찰되며, IP-10, MCP-1, RANTES 등 케모카인(chemokine)의 발현이 동종이식에서보다 현저히 증가되어 있고(Lee EM, et al. Xenotransplantation. 2006;13:328-36.), 매우 심한 유도 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase; NOS)의 활성화가 관찰된다(Kim JY, et al. Transpl Immunol. 2003;12:63-72.). 그리고, 돼지의 RANTES, IP-10는 돼지와 사람 사이에 분자서열이 유사하여 염증반응 유도에 관여할 것으로 추정된다. 그뿐 아니라 pCD86-hCD28 차단만으로는 T-림프구 활성화를 충분히 차단할 수 없어서 이종이식에서의 T-림프구 활성화와 침윤 과정에도 역시 선천성 면역반응 세포나 케모카인, 항산화분자 같은 면역매개 반응이 추가적으로 관여할 것으로 추정되며, 이를 극복하기 위해서는 다른 차원의 면역 억제제 개발이 추가로 필요할 것이다.
이러한 거부반응을 극복하기 위하여 여러 방법들이 시도되었으며, 형질전환 복제돼지 제작과 면역조절 기술의 상호 보완적인 개발에 의해 초급성 및 급성혈관성 거부 반응에 대한 극복 방안이 상당히 밝혀지게 되었으며, 세포 매개성 거부반응 극복을 위해서 면역관용 유도가 시도되었다. 이러한 이종 장기이식에 있어서 기술적으로 가장 커다란 문제로 지적되고 있는 것이 이식되는 조직 표면 항원에 대하여 나타나는 초급성 거부반응이다. 인간의 장기를 이식할 때 나타나는 급성 및 만성 거부반응은 면역억제제의 사용으로 문제를 해결할 수 있으나 초급성 거부반응은 반응의 속도가 너무 빨라서(수 분 이내) 아무런 조치를 취할 수 없는 상태이다. 이러한 초급성 거부반응을 일으키는 원인으로는 대표적으로 보체반응(complement activation)에 의해 개시된다고 알려졌으며(Song, W. C. et al., Clin. Immunol., 118, 127-136, 2006), 이 보체반응은 보체반응 조절 단백질(complement regulatory protein)의 연속작용으로 억제될 수 있다고 보고되었다(Adam, D. et al., Xenotransplantation, 8, 36, 2001; Byrne, G. et al., Transplantation, 63, 149, 1997; 및 Cowan, P. et al., Xenotransplantation, 5, 184, 1998). 이들 보체반응은 종 특이적으로 행해지기 때문에 사람의 보체 반응 조절 단백질을 발현하는 형질전환 동물을 개발하게 되면 초급성 거부 반응을 막을 수 있는 형질전환 동물을 생산할 수 있을 것으로 사료된다.
보체반응 기작(Complement cascade)은 병원체 표면(pathogen surface)의 분자를 보체가 외부 물질로 인식하고 활성화되어 세포들을 파괴하는 기작이다. 이러한 보체반응은 이종 이식에서 중요한 작용을 하는데, 특히 사람 대 돼지의 이종 이식에서 보체반응의 활성은 이종 세포 표면의 항원에 수용체의 항체가 결합함으로써 개시되고 파괴하는 기작을 수행하게 된다(Dalmasso, et al., Transplantation, 52, 530, 1991). 이때, 보체반응의 활성에 의하여 일어나는 반응을 초급성 거부이식반응(heperacute rejection)이라고 하며, 이로 인해 장기 이식시 출혈과 혈전, 최종적으로 이종장기의 괴사가 발생하게 된다. 또한, 활성화된 보체반응 물질들은 다른 숙주세포에 결합하여 의도하지 않은 파괴기작을 수행할 수 있는데, 이를 막기 위해 숙주세포들은 보체반응 조절 단백질의 연속적인 작용을 통하여 보체반응 기작을 저해하게 된다. 이러한 보체 반응 조절 단백질(complement regulatory protein)에는 분해 가속화 요소(decay-accelerating factor, DAF), 막 보조인자 단백질(membrane cofactor protein, CD46) 및 프로텍틴(protectin, CD59) 등이 있다. 이러한 보체반응 조절 단백질 중에서 막 보조인자 단백질(MCP)과 붕괴 촉진 인자(DAF)는 보체반응 기작 중 C3, C5 전환효소의 양(convertase level)을 조절하여 보체반응 기작을 저해하며, 프로텍틴(CD59)은 C9의 중합반응(polymerization)을 억제함으로써 막 공격 복합체(membrane attack complex)의 형성을 억제하는 것으로 알려져 있다(Davis, et al., J. Exp. Med., 170, 637-654, 1989). 따라서, 이러한 보체반응 조절 단백질은 보체반응 연계 손상(complement-mediated injury)이나 활성화된 보체(activated complement)에 의한 세포파괴에서 숙주세포를 보호하는 중요한 기능을 하고 있다(Song, W. C., et al., Clin. Immunol., 118, 127-136, 2006).
최근 유전 공학 기술을 통해 새롭게 개발된 징크 핑커 뉴클레아제(zinc finger nuclease; ZFN) 기술은 genomic DNA 특정 부위를 인식하여 이중 나선 ㅅ손상(double strand break; DSB)를 유도하며, 세포의 복구 시스템(repair system)을 통하여 유전자 결손(gene deletion), 삽입(insertion) 및 편집(edition)이 가능한 기술이다. 세포의 repair system이 작동할 때 다중유전자를 갖는 상동적 벡터(Homologous vector)가 존재하면, 높은 효율로 적중(Knock-in)이 가능하다. 체세포는 노화 때문에 오랜 시간 배양이 어려워 초급성, 급성 및 세포성 면역거부 반응을 동시에 제거하기 위해서는 현재까지 하나를 먼저 제거하고 돼지를 탄생시킨 후에 그 돼지로부터 세포를 얻어 남은 하나를 제거하여야 하는 번거로움이 있었다. 하지만, ZFN을 적용한다면 초급성, 급성 및 세포성 면역거부 반응을 동시에 세포수준에서 제거가 가능할 뿐만 아니라 높은 효율로 원하는 체세포를 수립하여 복제돼지 생산의 시간을 크게 단축할 수 있을 것으로 예상된다.
이에, 본 발명자들은 면역거부반응이 일어나지 않는 이종 장기의 생산방법을 연구하던 중, 이종장기 이식 시에 발생할 수 있는 단계별 면역거부반응을 억제할 수 있는 유전자들을 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase) 유전자에 적중(knock in)시켜, 면역거부반응을 억제할 수 있는 유전자들을 과발현시킬 수 있는 벡터를 제작하였으며, 이를 이용하여 복합 형질전환 세포주의 제작하였으며, 효율적인 이종장기 이식용 복합형질전환 복제돼지 생산에 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 알파갈 유전자를 제거하고 동시에 면역 억제 단백질을 암호화하는 유전자를 적중(knock in)시킬 수 있는 복합형질전환 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합형질전환 벡터로 돼지 체세포의 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합형질전환 체세포주의 핵 이식을 통해 제조되는 복합형질전환 복제돼지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비인간 복제동물을 사육한 후, 장기를 적출하는 단계를 포함하는 면역거부반응을 제거한 형질전환 복제돼지의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 알파갈 유전자를 제거하고 동시에 면역 억제 단백질을 암호화하는 유전자를 적중(knock in)시킨 복합형질전환 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 복합형질전환 벡터를 돼지 체세포에 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 복합형질전환 체세포주의 핵 이식을 통해 제조되는 복합형질전환 복제돼지를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 비인간 복제동물을 사육한 후, 장기를 적출하는 단계를 포함하는 면역거부반응을 제거한 형질전환 복제돼지의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 이종장기 이식 시에 발생할 수 있는 단계별 면역거부반응을 억제할 수 있는 유전자들을 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase) 유전자에 적중(knock in)시켜, 상기 유전자들을 과발현하는 벡터를 제작한 후, 이를 돼지 체세포의 형질전환시켜 제조된 복합 형질전환 세포주에 관한 것으로, 상기 복합 형질전환 세포주는 이종장기이식용 복제돼지 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 ZFN(zinc finger nuclease) 기술을 이용한 유전자 적중의 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2A는 α-gal의 특정위치의 genomic DNA를 인식하여 Double strand break를 유도하는 모식도를 나타낸 도이고, 도 2B는 ZFN 기술을 작동하기 위한 두 개의 벡터의 작용을 나타낸 도이며, 도 2C는 Niemann 그룹에서 사용된 zinc finger를 이용한 발현벡터 모식도 나타낸 도이고, 도 2D는 제한효소 XbaI/BamHI으로 DNA-Binding Domain이 FokI에 연결됨을 확인을 나타낸 도이다.
도 3A는 적중 벡터의 모식도를 나타낸 도이고, 도 3B는 pGEM-TA 벡터에 클로닝된 Left arm 및 Right arm을 제한 효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이며, 도 3C는 클로닝된 Left arm을 제한효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이고, 도 3D는 카세트 벡터(cassette vector)의 모식도를 나타낸 도이며, 도 3E는 클로닝된 Right arm을 제한효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4A는 본 발명에 사용된 단계별 면역 억제 유전자를 PCR로 증폭한 결과를 나타낸 도이고, 도 4B는 pGEM-TA 벡터에 클로닝된 단계별 면역 억제 유전자를 제한 효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5A는 클로닝된 ICAM-2 프로모터를 제한 효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이고, 도 5B는 ICAM-2 프로모터를 500 bp 단위로 절단한 결과를 나타낸 도이며, 도 5C는 각 절단된 ICAM-2 프로모터를 가지고 루시퍼라제 분석(luciferase assay)을 수행한 결과를 나타낸 도이고, 도 5D는 pGEM-TA 벡터에 클로닝된 ICAM-2 프로모터를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6A는 본 발명에 사용된 2A 펩티드(peptide) 시스템을 나타낸 도이고, 도 6B는 2A 펩티드(peptide) 시스템 벡터의 지도를 나타낸 도이며, 도 6C는 2A 펩티드(peptide) 시스템 벡터를 제한효소를 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7A는 2A 펩티드(peptide) 시스템에 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자의 모식도를 나타낸 도이고, 도 7B는 2A 펩티드(peptide) 시스템을 사용하여 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자의 벡터 지도를 나타낸 도이며, 도 7C는 2A 펩티드(peptide) 시스템을 사용하여 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자를 각각의 제한효소를 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8A는 복합형질전환 벡터에 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자의 모식도를 나타낸 도이고, 도 8B는 복합형질전환 벡터에 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자의 벡터 지도를 나타낸 도이며, 도 8C는 복합형질전환 벡터에 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자를 각각의 제한효소를 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9A는 복합형질전환 세포주를 선별하는 모식도를 나타낸 도이고, 도 9B는 선별된 복합형질전환 세포주를 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2A는 α-gal의 특정위치의 genomic DNA를 인식하여 Double strand break를 유도하는 모식도를 나타낸 도이고, 도 2B는 ZFN 기술을 작동하기 위한 두 개의 벡터의 작용을 나타낸 도이며, 도 2C는 Niemann 그룹에서 사용된 zinc finger를 이용한 발현벡터 모식도 나타낸 도이고, 도 2D는 제한효소 XbaI/BamHI으로 DNA-Binding Domain이 FokI에 연결됨을 확인을 나타낸 도이다.
도 3A는 적중 벡터의 모식도를 나타낸 도이고, 도 3B는 pGEM-TA 벡터에 클로닝된 Left arm 및 Right arm을 제한 효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이며, 도 3C는 클로닝된 Left arm을 제한효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이고, 도 3D는 카세트 벡터(cassette vector)의 모식도를 나타낸 도이며, 도 3E는 클로닝된 Right arm을 제한효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4A는 본 발명에 사용된 단계별 면역 억제 유전자를 PCR로 증폭한 결과를 나타낸 도이고, 도 4B는 pGEM-TA 벡터에 클로닝된 단계별 면역 억제 유전자를 제한 효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5A는 클로닝된 ICAM-2 프로모터를 제한 효소를 가지고 확인한 결과를 나타낸 도이고, 도 5B는 ICAM-2 프로모터를 500 bp 단위로 절단한 결과를 나타낸 도이며, 도 5C는 각 절단된 ICAM-2 프로모터를 가지고 루시퍼라제 분석(luciferase assay)을 수행한 결과를 나타낸 도이고, 도 5D는 pGEM-TA 벡터에 클로닝된 ICAM-2 프로모터를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6A는 본 발명에 사용된 2A 펩티드(peptide) 시스템을 나타낸 도이고, 도 6B는 2A 펩티드(peptide) 시스템 벡터의 지도를 나타낸 도이며, 도 6C는 2A 펩티드(peptide) 시스템 벡터를 제한효소를 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7A는 2A 펩티드(peptide) 시스템에 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자의 모식도를 나타낸 도이고, 도 7B는 2A 펩티드(peptide) 시스템을 사용하여 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자의 벡터 지도를 나타낸 도이며, 도 7C는 2A 펩티드(peptide) 시스템을 사용하여 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자를 각각의 제한효소를 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8A는 복합형질전환 벡터에 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자의 모식도를 나타낸 도이고, 도 8B는 복합형질전환 벡터에 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자의 벡터 지도를 나타낸 도이며, 도 8C는 복합형질전환 벡터에 클로닝된 ICAM-2 프로모터 및 단계별 면역 억제 유전자를 각각의 제한효소를 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9A는 복합형질전환 세포주를 선별하는 모식도를 나타낸 도이고, 도 9B는 선별된 복합형질전환 세포주를 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명에서 사용되는 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에서 사용되는 '적중(Knock-in)'은 다른 종 또는 원래부터 해당 생명체에 존재하지 않았던 외래의 염기서열을 해당 생명체의 게놈 또는 해당 생명체로부터 유래한 DNA 염기서열에 유전자 재조합 기술을 이용하여 삽입하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 '타겟팅(targeting)'은 원하는 게놈상의 특정 유전자 또는 특정 유전자의 특정염기서열 부위에 재조합 유전자를 삽입하거나 변형(modify)하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 알파갈(α- Gal)는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 상동 재조합에서의 "상동"은 각 영역과 이에 해당하는 유전자의 핵산 서열과의 동일성 정도를 나타내는 것으로, 적어도 90% 이상 동일하고, 바람직하게는 95% 이상 동일하다.
본 발명에서 사용되는 "선별 마커(selection marker)"란 세포로 유전자 타겟팅 중적 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있고, 양성 선별마커와 음성 선별마커가 있다.
상기 "양성 선별 마커"는 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 당해 특정 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 양성 선택을 가능하게 하는 마커를 의미하며, "양성 선별 마커 유전자"는 상기 양성 선별 마커를 암호화하는 유전자를 의미하는데, 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(이하,'neo'라 약칭함)는 항생제 네오마이신이 첨가된 배지에서 진핵세포가 생존할 수 있도록 하는 항생제 내성을 부여함으로써, 진핵 세포에 있어서 안정적 형질감염 세포를 선별하는데 사용된다.
본 발명에서 사용되는 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질 전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 플라스미드 또는 비플라스미드성 나출(naked DNA)에 의한 진핵세포의 형질전환을 세포의 종양화의 의미로서의 형질전환과 구분하기 위해, '형질감염(transfection)'이라고 부르기도 하는데, 본 문서에서는 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 "과발현"은 정상 상태의 카피수보다 많은 전사체가 생산된 상태를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "프로모터"에는 전사에 필요한 기본인자(Basal element) 뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)가 더 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "포유류"는 소, 양, 염소, 돼지, 말, 토끼, 개 또는 원숭이일 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 알파갈 유전자를 제거하고 동시에 면역 억제 단백질을 암호화하는 유전자가 적중된 복합형질전환 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은,
프로모터; 분해 가속화 요소(Decay accelerating factor; DAF), CD39, 조직 인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor; TFPI), C1-억제제(C1-inhibitor) 및 TNF-알파-유도 단백질 3(TNF-α-induced protein 3; TNFAIP3)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 및 자가 절단 펩티드를 암호화하는 유전자를 순차적으로 포함하는 벡터가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase; 이하, 알파갈(α-gal)이라고 함) 유전자에 적중된(knock-in) 복합형질전환 벡터를 제공한다.
상기 프로모터는 ICAM-2 프로모터, CMV 프로모터, EF1a 프로모터 및 SV40 초기 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, ICAM-2 프로모터가 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 벡터는 DAF, CD39, TFPI, C1 - inhibitor 및 TNFAIP3 유전자 모두가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하고, 상기 자가 절단 펩티드는 2A 펩티드(peptide)인 것을 포함한다.
또한, 상기 알파갈(α-gal) 유전자는 포유류 유래 유전자인 것이 바람직하고, 상기 포유류는 소, 양, 염소, 돼지, 말, 토끼, 개 또는 원숭이인 것이 바람직하며, 돼지 유래인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 복합형질전환 벡터는 레프트 암(left arm) 영역은 5' 비번역 지역을 포함하는 레프트 암이고, 라이트 암(right arm) 영역은 알파갈(α-gal)의 개방 판독 틀(open reading frame; ORF)을 포함하는 라이트 암인 것이 바람직하다.
또한, 상기 복합형질전환 벡터는 양성 선별 마커를 포함할 수 있고, 양성 선별 마커는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(neomycin phosphotransferase; Neo), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hygromycin phosphotransferase; Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase; hisD), 퓨로마이신 (puromycin; Puro) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine phosphosribosyltransferase; Gpt) 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 Neo이지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기 양성 선별마커 유전자는 프로모터 트랩 방식에 의해, 즉, 프로모터 없이 내생적 항원 결정기 합성 유전자의 개시 코돈을 이용하여 번역될 수 있도록 넉-인(knock-in)될 수 있고, 아니면, 통상적으로 사용되는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터와 같은 항상성 프로모터에 작동 가능하도록 연결될 수 있다.
아울러, 본 발명의 상기 벡터는 적중(knock-in)되는 유전자로 면역 억제 단백질은 보체 억제 단백질, 혈전증 억제 단백질 또는 세포매개성 면역 억제 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화하는 유전자이며, 상기 보체 억제 단백질은 (decay acceleration factor; DAF), C1-inhibitor, MCP, CD59 또는 CD46을 포함하고, 상기 혈전증 억제 단백질은 TFPI, CD39를 포함하며, 상기 세포성 면역 억제 단백질은 TNFAIP3인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 벡터는 음성 선별마커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 음성 선별마커로는 허피스 심플렉스 바이러스-티미딘 키나아제(Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제(hypoxanthine phosphoribosyl transferase: Hprt), 싸이토신 디아미나아제(cytosine deaminase) 및 디프테리아 톡신(Diphtheria toxin, DT) 등이 있으며 바람직하게는 티미딘 키나제 또는 디프테리아 톡신이지만, 이에 제한되지 않는다. 음성 선별마커는 Left arm 영역의 5' 말단 쪽 또는 Right arm 영역의 3' 말단 쪽에 위치할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 복합형질전환 벡터로 형질전환되어, 알파갈 유전자에 적중(knock-in)되는 상기 알파갈 유전자가 존재하는 좌위에 상기 면역 억제 유전자가 삽입되어 과발현되는 것을 특징으로 하는 복합형질전환 세포주를 제공한다.
본 발명의 복합형질전환 벡터가 숙주 세포 내로 형질전환되면, 징크 핑거 뉴클레아제에 의해서 숙주 세포 게놈 상의 내생적(endogeneous) 알파갈 유전자와 타겟팅 벡터 사이에 상동 재조합이 일어나면서, 염기 서열이 교체된다. 벡터 상의 양성 선별 마커 유전자 및 보체 억제 단백질, 혈전증 억제 단백질 도는 세포 매개성 면역 억제 단백질을 암호화하는 유전자는 내생적 항원 결정기 합성 유전자의 프로모터 또는 양성 선별 마커 유전자의 발현을 위해 상기 양성 선별 마커 유전자의 5'-말단에 삽입한 프로모터에 의해 발현되는데, 전자의 경우에는 일종의 프로모터 트랩 벡터라 할 수 있다. 세포 내에서 전사되어 기능하는 유전자(발현유전자)를 망라적으로 포착(트랩)하는 방법으로는 프로모터 트랩 이외에도 인핸서 트랩, 엑손 트랩 등이 있다.
상기 벡터 제작은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 제작된 복합형질전환 벡터를 미니어쳐 돼지 귀조직 유래 섬유아세포(pESF)로 도입하여 형질전환 세포주를 제조조하였다.
또한, 본 발명은 상기 복합형질전환 벡터를 돼지의 체세포에 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제공한다.
상기 돼지 체세포는 돼지 섬유 아세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 복합형질전환 세포주의 핵 이식을 통해 제조되는 형질전환 복제돼지를 제공한다.
상기 형질전환 복제돼지는 미니어쳐(miniature) 돼지인 것이 가장 바람직하다.
상기 복제동물의 제조에 이용되는 핵이식 방법은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하는 것이 가능하나, 보다 바람직하게는 US6,781,030B, US6,603,059B, US6,235,969B, US7,355,094B, US7,071,372B, KR862298B, KR500412B, KR807644B, JP4153878B, US6,700,037B, US7,291,764B, US6,258,998B, US6,548,741B, WO03/089632A, US7,371,922B 등이 사용될 수 있고, 특히 돼지의 경우에는 KR500412B, KR807644, JP4153878B, US6,700,037B, US7,291,764B, US6,258,998B, US6,548,741B, WO03/089632A 또는 US7,371,922B에 기재된 방법을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은
1) 본 발명의 복합형질전환 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 복합형질전환 벡터를 돼지 체세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 알파갈(α-gal) 유전자 적중 세포주의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 본 발명의 복합형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식한 후, 융합시켜 핵이식란을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 핵 이식란을 대리모에게 산자를 출산하는 단계를 포함하는 형질전환 복제돼지의 생산방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 형질전환 복제돼지를 사육한 후, 이식에 필요한 장기를 적출하는 단계를 포함하는 이식용 이종 장기의 생산방법을 제공한다. 상기 장기는 수용 대상의 성별, 나이, 체중, 신장 등을 고려하여, 사육시기를 조절하여 공여체 복제돼지를 사육한 다음, 통상의 외과적 수술을 통해 적출할 수 있으며, 적출 후 수용 대상에게 바로 이식되거나, 신속하게 냉장보관될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 이중 나선 손상(
Double
strand
break
;
DSB
) 유도
ZFN
벡터의 제조
징크 핑커 뉴클레아제(Zinc-finger nucleases; ZFNs)가 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase; α-gal, 이하 '알파갈'이라고 함)의 특정 위치의 게놈 상의(genomic) DNA를 인식하여 이중 나선 손상(Double strand break)을 유도하고, ZFN는 제한효소 FokI 및 DNA-결합 도매인(DNA-Binding Domain)을 갖는 두 개의 발현벡터(pST1374-Page9 Left 및 pST1374-Page9 Right로 Genotech에서 합성한 후, 합성된 유전자를 제한효소인 XbaI 및 BamH I로 잘라서 600 bp 가량의 단편을 수득한 후, 상기 단편을 pST1374 벡터에 XbaI 및 BamH I로 잘라서 접하시켰다)가 필요하며(도 2B), ZFN 발현 벡터는 Niemann 그룹에서 사용된 징크 핑거(zinc finger)를 이용한 발현벡터 모식도는 도 2C와 같고, 클로닝 후, 제한효소 처리를 하여 클로닝 여부를 판단하였다.
그 결과, 도 2D에 나타낸 바와 같이, 제한효소 XbaI/BamHI으로 DNA-Binding Domain이 FokI에 연결됨을 확인하였다(도 2D).
<
실시예
2> 상동 재조합(
Homologous
Recombination
)을 위한 카세트 벡터(
cassette
vector
)의 제작
ZFN가 알파갈(α-gal) 특정위치의 게놈 상의(genomic) DNA를 인식하여 이중 가닥 절단(Double strand break)을 유도하면 세포의 회복 시스템(repair system)을 가동되며, 이때 상동 재조합(Homologous Recombination) 벡터가 세포 속에 도입인식되면 높은 효율로 적중(Knock-in)이 일어난다.
유전자 적중 벡터는 약 800 bp의 크기로 레프트 암(left arm)과 라이트 암(right arm)이 필요하다(도 3A). 이를 위해 left arm과 right arm이 pGEM-TA 벡터(Promega, 미국)에 클로닝(도 3B)하여, 카세트 벡터(cassette vector)를 제작하였다(도 3D).
그 결과, 도 3C 및 도 3E에 나타낸 바와 같이, left arm(도 3C)과 right arm(도 3E)이 네오마이신 선별 마커(Neomycin selection marker)를 갖는 벡터에 클로닝하였다.
<
실시예
3> 단계별 면역억제 유전자
클로닝
단계별 면역억제 유전자는 분해 가속화 요소(Decay accelerating factor; DAF), CD39, 조직 인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor; TFPI), C1-억제제(C1-inhibitor) 및 TNF-알파-유도 단백질 3(TNF-α-induced protein 3; TNFAIP3)이며, 그 기능은 하기 [표 1]에 기재하였다. 각각의 유전자는 human cDNA로부터 서열번호 1 내지 10으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭 후(도 4A), pGEM-TA 벡터에 클로닝(도 4B) 하였으며, 염기서열을 확인 후 사용하였다.
유전자 이름 | 역할 | 효과 |
DAF | 보체활성을 조절하는 인자 | 보체의 C3-complex의 형성을 억제 |
CD39 | 혈소판의 활성을 촉진하는 ATP를 분해 | 혈소판의 응고를 방지 |
TFPI | tissue factor가 factor IX과 반응하여 thrombosis를 일이키는 기작을 저해 | 혈구와 혈소판의 응고를 방해 |
C1-inhibitor | protease inhibitor; 보체활성을 억제하는 기작을 수행하는데 보체의 C1 complex에 붙어 분해를 시키는 작용 |
정상적인 보체의 활성을 억제 |
TNFAIP3 | 염증반응을 억제하고 저해하는 역할 및 T-cell의 활성을 억제 | 세포성 면역거부반응을 억제 |
<
실시예
4> 다중유전자의 과발현을 조절하는
ICAM
-2 프로모터의
클로닝
단계별 면역억제 다중유전자의 과발현을 최적으로 유도할 수 있는 프로모터(promoter)를 탐색하기 위하여, 3.6 kb의 ICAM-2 프로모터를 클로닝(도 5A) 하였으며, 약 500 bp정도씩 결손(deletion) 시켰고(도 5B), 상기 각기 결손된 ICAM-2 프로모터를 루시퍼라제를 리포터 유전자를 갖는 벡터에 클로닝하였다. 상기 벡터를 이용하여 루시퍼라제 분석법(luciferase assay)을 수행하였다.
그 결과, 도 5C에 나타낸 바와 같이, ICAM-2 프로모터는 약 1kb size에서 강한 발현효과를 보임을 확인하였다(도 5C).
상기 확인된 1kb size의 ICAM-2 프로모터는 pGEM-TA 벡터에 클로닝하였다(도 5D).
<
실시예
5> 자가 절단(
self
cleaving
) 2A 펩티드 벡터의 제작
상기 <실시예 4>에서 선별된 ICAM-2 프로모터의 조절로 하나의 단백질로 만들어진 후, 단계별 면역억제 기능을 갖는 다중 단백질을 유도하기 위하여 'self cleaving' 2A 시스템(도 6A)을 이용하였다. 구체적으로, pBS 벡터를 사용하여 2A 펩티드(peptide)를 암호화하는 핵산 서열을 제한효소 PvuⅡ를 사용하여 클로닝 하였다(도 6B).
그 결과, 도 6C에 나타낸 바와 같이, 제한효소 PvuⅡ 부위 사이에 클로닝되었고, 상기 벡터를 사용하여 형질전환하면, self cleaving를 통해 5개의 단백질이 하나의 벡터로부터 만들어질 수 있다(도 6).
<
실시예
6> 다중(
multiple
) 유전자의 클
로닝
'self cleaving' 2A 벡터를 사용하여 돼지의 ICAM-2 프로모터와 hDAF, hCD39, hTFPI, hC1-inhibitor 및 hTNFAIP3을 연결한 복합형질전환 벡터를 제작(도 7A 및 도 7B)하였으며, 제한효소로 최종 점검하였다(도 7).
<
실시예
7> α-
Gal
유전자 적중(
Knock
-
in
) 복합형질전환 벡터의 제작
징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease; ZFN)가 Double strand break를 유도하는 α-gal 특정 genomic DNA 위치를 벗어난 left arm과 right arm 사이에, 위에서 제작된 돼지의 ICAM-2 프로모터와 hDAF, hCD39, hTFPI, hC1-inhibitor 및 hTNFAIP3을 연결한 복합형질전환 벡터를 삽입하여 α-Gal 유전자 적중(Knock-in) 복합형질전환 벡터를 제작하였다. 적중(Knock-in) 벡터로서 양성 선별 마커(positive selection marker)는 네오마이신(Neomycin)이며 음성 선별 마커(negative selection marker)는 DT-A를 사용하였다.
< 실시예 8> α- Gal 유전자 적중( Knock - in ) 세포주의 제조
<실시예 7>에서 제조한 복합형질전환 벡터 플라즈미드를 플라스미드 분리 키트(QIAfilter PlasmidMidi kits, Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후, 제한효소 Pml I로 선형화한 후, 미니어쳐 돼지 유래의 귀조직 섬유아세포(pESF)에 도입하였다. pESF 세포는 DMEM(Gibco, Invitrogen corporation, 미국), 10% FBS (Hyclone, 미국), 0.001% 젠타마이신(Gibco, Invitrogen corporation, 미국), 1% MEM 비필수 아미노산(Gibco, Invitrogen corporation, 미국) 조성의 배양액으로 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하고 배양액은 2 내지 3일 마다 교환하였다. 계대 횟수가 2 또는 3인 2×106 pESF 세포에 Nucleofector(Amaxa Biosystems, 미국) 방법으로 5 ㎍의 선형화된 DNA를 도입한 후, G418 300 ㎍/㎖(Gibco, USA)를 포함한 배양액에서 배양하였다. 배양 12 내지 14일이 지나면 직경 6 내지 10 ㎜ 가량 크기의 세포 주를 관찰할 수 있었으며, 이들은 96 웰 배양 용기로 계대 배양하였다. 배양 용기에서 85 내지 95% 정도로 자란 세포 주의 1/2은 다시 96 웰(well)로 계대배양 되었으며, 1/2은 타겟팅 여부 확인을 위해 사용되었다. 타겟팅 확인을 위한 세포들은 1 M KCl, 1 M Tris pH8.3, 1 M MgCl2, 0.45% NP40, 0.45% Tween 20 및 10 ㎍/㎖ Proteinase K로 구성된 용해 완충액(lysis buffer)에서 55℃, 1시간 동안 용해시킨 후, 100℃에서 5분간 처리한 후, 상기 <실시예 3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다. 총 132개의 세포주에 대하여 상동재조합을 시도하였으며, 그 결과 2개의 세포주가 적중되어져 있음을 확인하였다.
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, zinc finger nuclease 벡터와 다중 복합형질전환 벡터를 미니돼지의 섬유아세포(pESF)에 공동-형질전환(co-transfection)하였으며, 여러 단계의 선별을 통하여 α-Gal 유전자 적중(Knock-in) 세포주 확립하였다(도 9).
<
실시예
9> α-
Gal
유전자 적중(
Knock
-
in
) 복합형질전환 복제돼지의 생산
국립축산과학원 및 바이오신약장기사업단의 동물생산 시설을 이용하여 복합형질전환 복제돼지 생산하였다. 상기 <실시예 8>에서 선별된 복합형질전환 세포주를 대리모에 이식하여 복제돼지를 생산하였다.
<9-1> 배양액의 준비
성숙 배양액은 TCM199(31100035; Gibco, Grand Island, NY)에 0.1% 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 3.05 mM D-글루코스, 0.91 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 0.5 g/ml LH(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), 0.5 g/ml FSH(Sigma), 10 ng/ml 내피 성장 인자(epidermal growth factor, Sigma), 75 g/ml 페니실린 G, 및 50 g/ml 스트렙토마이신을 첨가했다.
미세 조작용 배양액은 TCM199에 0.3% BSA와 7.5 g/ml 사이토칼라신(cytochalasin B, CB)를 첨가하였다. 활성화 배양액은 0.3 M 만니톨에 1.0 mM CaCl2 ·H2O, 0.1 mM MgCl2 ·6H2O, 0.5 mM HEPES를 첨가하였다. 복제란의 발생 배양액은 NCSU(North Carolina State University)-23 배지에 0.4 % BSA를 첨가하였다.
<9-2> 난자의 채취 및 미세 조작(
Micromanipulation
)
도축장에서 미경산돈의 난소를 채취하여 35 ~ 39, 0.9% 생리적 식염수에 넣어 실험실까지 운반하였다. 난자는 일회용 10-ml 주사기에 18-게이지(gauge) 바늘을 연결하여 직경 2 ~ 6 mm 난포에서 난포액을 흡입하여 채취하였다. 난자를 성숙배양액에서 세척하고 500 l 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에 50 ~ 60개 넣어 42 ~ 44시간 배양하였다.
상기 난자를 미세조작용 배양액에서 5 ~ 10분간 배양한 후 체세포를 배양액에 첨가하였다. 직경 30 m의 미세 유리관으로 난자의 제 1극체와 그 주위의 세포질을 제거하고 이 유리관을 이용하여 체세포를 난자의 위란강에 주입시켰다.
<9-3> 세포융합 및 활성화
미세조작 후 간격이 1 mm 떨어진 플레티넘(platinum) 전기선 사이에 핵이식란을 위치시켰다. 세포융합 및 활성화는 2회의 DC 펄스 1.0 ~ 1.2 kV/cm, 30 sec을 융합기(BTX Electro-Cell Manipulation 2001)로 공급하여 유도한 다음 0.5 ~ 1시간 후 융합률을 검사하였다.
<9-4>
복제란의
배양
융합된 복제란만을 골라 500 l의 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에서20 ~ 30개의 복제란을 6일간 배양하였다. 배양이 끝나면 5 g/ml 비스벤지미드(bisbenzimide, Hoechst 33342)로 염색하여 형광현미경 하에서 복제란의 핵 수를 검사하였다.
<9-5>
핵이식란의
이식 및 형질전환 복제 미니돼지 생산
융합된 복제란은 500 ㎕의 배양액이 들어있는 4웰 플레이트에서 1 ~ 2일간 배양하였다. 이후 같은 배양액 2 ml이 들어있는 동결튜브에 복제란을 넣고 39로 가온되어있는 수정란 운송 장치(Embryo transfer kit)로 수정란 이식 장소까지 운송하였다. 복제란 이식을 위한 대리모는 발정이 시작된 개체를 선별하여 준비하였다. 형질전환 복제 미니돼지 생산효율 향상을 위하여 일반식용돼지와 미니돼지를 대리모로 이용하였다. 대리모는 세척 후 펜토탈소디움(중외제약) 0.5g을 귀정맥에 투여하여 일시 마취시켰다. 마취된 대리모를 수술대에 보정 한 후 5% 이소플로레인(Isoflurane)을 공급하여 흡입마취를 실시하였다. 마취된 대리모는 복중선을 따라 약 5 cm 가량 절개 후 자궁과 난소를 체외로 노출시켜 준비하였다. 이때 복제란을 카테타(Tom cat catheter)에 흡입하고 난관의 협부까지 밀어 넣어 복제란을 이식하였다. 복제란 이식이 완료된 대리모는 30일 초음파를 이용하여 임신검정을 실시하고 임신이 확인된 개체는 114일 후 분만을 유도하였다. 복합형질전환 복제돼지 생산을 위하여, 미니돼지 대리모 6마리를 이용하여 복제란을 이식하였다. 복제란 이식이 완료된 대리모는 30일째 초음파를 이용하여 임신 검정을 실시하고 임신이 확인된 개체는 114일 후 분만을 유도하여 형질전환 복제 돼지를 생산하였다.
이 중, 4마리의 대리모가 임신하여 3마리가 정상적으로 분만하였으며, 10마리의 형질전환 복제 돼지를 생산하였다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
Rural Development Administration
<120> Multi transgenic cell line expressing immunological rejection
inhibitory gene by alpha Gal gene targeting knock in vector and a
manufacturing method thereof
<130> 13p-04-23
<160> 10
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DAF F
<400> 1
agatatcgcg cggccgagcg tgcccgcgc 29
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DAF R
<400> 2
acctaggtct cttagcacga gtcaagccca tggttact 38
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD93 F
<400> 3
atacgtaaca aaggagtcta acgtgaaga 29
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD93 R
<400> 4
aactagttct cttagctcgt accatatctt tccagaaata t 41
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TFPI F
<400> 5
acccgggaca atgaagaaag tacatgcac 29
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TFPI R
<400> 6
acctaggtct cttagctcga cataggcatg aaatgctatc c 41
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C1 inhibitor F
<400> 7
aaggcctgcc tccaggctga ccctgctg 28
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C1 inhibitor R
<400> 8
agctagctct cttagctcgg gccctggggt catatactcg 40
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNFAIP3 F
<400> 9
atcgcgacaa gtccttcctc aggctttg 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNFAIP3 R
<400> 10
agtcgactta gccatacatc tgcttgaa 28
Claims (11)
1) 프로모터; 및
2) 순차적으로 연결된, 분해 가속화 요소(Decay accelerating factor; DAF) 유전자, 자가 절단 펩티드를 암호화하는 유전자, CD39 유전자, 자가 절단 펩티드를 암호화하는 유전자, 조직 인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor; TFPI) 유전자, 자가 절단 펩티드를 암호화하는 유전자, C1-억제제(C1-inhibitor) 유전자, 자가 절단 펩티드를 암호화하는 유전자 및 TNF-알파-유도 단백질 3(TNF-α-induced protein 3; TNFAIP3) 유전자;
를 순차적으로 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase) 유전자에 적중(knock-in)시키기 위한 복합형질전환 벡터.
2) 순차적으로 연결된, 분해 가속화 요소(Decay accelerating factor; DAF) 유전자, 자가 절단 펩티드를 암호화하는 유전자, CD39 유전자, 자가 절단 펩티드를 암호화하는 유전자, 조직 인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor; TFPI) 유전자, 자가 절단 펩티드를 암호화하는 유전자, C1-억제제(C1-inhibitor) 유전자, 자가 절단 펩티드를 암호화하는 유전자 및 TNF-알파-유도 단백질 3(TNF-α-induced protein 3; TNFAIP3) 유전자;
를 순차적으로 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase) 유전자에 적중(knock-in)시키기 위한 복합형질전환 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 ICAM-2 프로모터, CMV 프로모터, EF1a 프로모터 및 SV40 초기 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합형질전환 벡터.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 자가 절단 펩티드는 2A 펩티드(peptide)인 것을 특징으로 하는 복합형질전환 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제는 돼지 유래인 것을 특징으로 하는 복합형질전환 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 복합형질전환 벡터는 레프트 암(left arm) 영역은 5' 비번역 지역을 포함하는 레프트 암이고, 라이트 암(right arm) 영역은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 개방 판독 틀(open reading frame; ORF)을 포함하는 라이트 암인 것을 특징으로 하는 복합형질전환 벡터.
제 1항, 제 2항 및 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 복합형질전환 벡터를 돼지의 체세포에 형질전환시킨 형질전환 세포주.
제 7항에 있어서, 상기 돼지 체세포는 돼지 섬유 아세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
제 7항의 형질전환 세포주를 핵 이식을 통해 제조된 형질전환 복제돼지.
1) 제 1항, 제 2항 및 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 복합형질전환 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1의 복합형질전환 벡터를 돼지 체세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 적중 세포주의 제조 방법.
2) 상기 단계 1의 복합형질전환 벡터를 돼지 체세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 적중 세포주의 제조 방법.
1) 제 7항의 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식한 후, 융합시켜 핵이식란을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 핵 이식란을 대리모에게 산자를 출산하는 단계를 포함하는 형질전환 복제돼지의 생산방법.
2) 상기 단계 1)의 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식한 후, 융합시켜 핵이식란을 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 핵 이식란을 대리모에게 산자를 출산하는 단계를 포함하는 형질전환 복제돼지의 생산방법.
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WO2010041786A1 (en) | 2008-10-08 | 2010-04-15 | Industry Foundation Of Chonnam National University | Knock-in vectors for producing bioactive substances by using porcine beta-casein genomic dna, and processes for producing transgenic porcine somatic cells using the same |
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OROPEZA, "Production of hA20-transgenic pigs by somatic cell nuclear transfer for xenoplantation research", Thesis for Doctor of Philosophy, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany (2009)* |
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