KR102040203B1 - 돼지 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 결손된 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 - Google Patents
돼지 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 결손된 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 GGTA1(α1,3-galactosyltransferase), CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase), iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 및 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2)가 제거된 형질전환 복제돼지 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 유전자 가위인 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 등 네 개 유전자의 두 좌위가 모두 제거되어 있으며, 이종장기이식에서 발생하는 초급성 및 급성 면역거부반응을 극복할 수 있는바, 이를 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 GGTA1(α1,3-galactosyltransferase), CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase), iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 및 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2)가 제거된 형질전환 복제돼지 및 이의 용도에 관한 것이다.
2017년 기준 국내 장기이식 대기자는 32,867명인데 비해 장기 기증자수는 1,695명에 불과하다. 국가적으로 장기기증의 필요성에 대해 적극적으로 알리고 유가족에 대한 예우를 통해 장기기증 문화를 활성화해나가고 있지만, 공급과 수요의 차이는 해마다 증가하는 추세이다. 이는 비단 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로도 큰 문제가 되어 왔으며, 불법 장기매매가 성행할 정도로 인류가 해결해야 할 과제 중 하나이다.
이종장기이식(Xenotransplantation)은 이종의 장기가 생체장기를 완전히 대체함으로써, 활성화될 경우 장기 공급의 문제를 근절할 수 있을 것으로 기대되는 해결책 중 하나이다. 이종장기 중 하나인 미니돼지의 장기는 인간과 형태학적, 유전학적으로 비슷하고 여러 문헌에서 검증된 바 있다. 하지만 현재까지의 기술로는 미니돼지의 장기를 사람에게 이식하게 될 경우 자가, 동종이식 보다 훨씬 심각한 면역거부반응이 나타날 수 있는 문제점들이 다수 존재한다.
면역거부반응을 일으키는 인자 중, α-gal(α-galactosyltransferase)은 GGTA1 유전자에 의해 합성되는 항원으로 영장류를 제외한 포유류, 설치류 등 모든 동물세포의 표면에 존재한다. 이에 따라 α-gal을 보유하고 있는 돼지의 장기를 α-gal이 없는 사람에게 이식을 하게 될 경우 항원-항체반응이 일어나게 되고 초급성 면역거부반응(Hyperacture rejection)이 유발되어 이식 후 수 분만에 괴사 및 사망하게 된다. 따라서 돼지의 α-gal이 존재하지 않는 형질전환 복제돼지 생산 연구가 진행되었으며, 2005년에 동형접합적으로 GGTA1 유전자가 제거된 형질전환 복제돼지의 장기를 원숭이에게 이식한 결과 초급성 면역거부반응이 나타나지 않고 생존하는 것으로 보고되었다(Kenji et al., Nature medicine, 2005).
GGTA1 결손을 통한 초급성 면역거부반응은 제어가 됐으나, 이후 급성 면역거부반응에 의해 공여자의 생존 기간이 길지 않았다. 그 중, CMAH는 Neu5Ac를 Neu5Gc로 합성시키는 유전자로써, 인간은 진화를 통하여 CMAH 유전자가 변형되어 Neu5Gc를 합성하지 않고, Neu5Gc를 가진 돼지의 장기가 인간에게 이식 될 경우 체내에서 Neu5Gc를 항원으로 인식하는 항체에 의해 면역 거부반응이 발생한다(Deug-Nam Kwon et al., Sci. Rep. 2013). 또한 iGb3s는 글리코실 전달효소로 락토실세라마이드에 갈락토오스를 더하여 복합 지질인 글리코스핑고리피드인 iGb3를 합성하며, α-gal 항원을 만들어내는 대체경로(Alternative pathway)로 알려졌다(Dale Christiansen et al.,Plos Biology, 2008).
한편, β4GalNT2는 당사슬(Glycan)을 생성하는 유전자로 GalNAcβ1-4, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Gal, Sd(a) (Sid blood group; CAD or CT) 항원을 만들어낸다. 돼지의 장기 및 내피세포에서 많은 발현을 보이는 β4GalNT2 유전자는 보체 활성에 의한 세포의 용해작용, non-gal에 의한 면역 거부반응을 일으키는 것으로 알려져 있다(Byrne GW et al., Xenotransplantation, 2014). 이러한 β4GalNT2 유전자가 결손된 형질전환 복제돼지를 생산 후 체외에서 영장류 및 사람의 혈청과 반응 실험을 한 결과 IgG, IgM binding이 현저히 감소하는 것으로 보고되었다(Estrada JL et al., Xenotransplantation, 2015).
이에 본 발명자들은 이종이식 거부반응을 극복하고 급성 면역 거부반응에 의한 다량의 면역 억제제 투여 및 이종장기 손상 방지를 위한 형질전환 체세포주를 개발하기 위해 노력한 결과, CRISPR-Cas9 시스템을 이용해 돼지의 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 등 4개의 유전자를 동시에 동형접합적으로 결손시킨 형질전환 체세포주를 구축하고, 이를 이용하여 형질전환 복제돼지를 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 GGTA1(Alpha 1,3-Galactosyltransferase), CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase), iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 및 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2)가 제거된 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 형질전환 세포주를 핵 이식하여 제조한 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA(small guideRNA)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 GGTA1 (Alpha 1,3-Galactosyltransferase) 넉아웃용 재조합 벡터; 서열번호 5 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) 넉아웃용 재조합 벡터; 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 넉아웃용 재조합 벡터; 및 서열번호 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2) 넉아웃용 재조합 벡터를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조를 위한 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 핵 이식하여 제조한 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 유전자 가위인 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 등 네 개 유전자의 두 좌위가 모두 제거되어 있다. 따라서 이종장기이식에서 발생하는 초급성 및 급성 면역거부반응을 극복할 수 있는바, 이를 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 돼지 GGTA1 액손 9번의 염기서열, 타겟 서열 및 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 돼지 GGTA1을 넉아웃 시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 돼지 GGTA1 타겟 벡터의 T7E1 어쎄이 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 돼지 CMAH 액손 8번의 염기서열, 타겟 서열 및 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 5는 돼지 CMAH 를 넉아웃 시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 6은 돼지 CMAH 타겟 벡터의 T7E1 어쎄이 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 돼지 iGb3s 엑손 3번의 염기서열, 타겟 서열 및 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 8은 돼지 iGb3s 를 넉아웃 시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 9는 돼지 iGb3s 타겟 벡터의 T7E1 어쎄이 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 돼지 β4GalNT2 액손 1번의 염기서열, 타겟 서열 및 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 11은 돼지 β4GalNT2를 넉아웃 시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 12는 돼지 β4GalNT2 타겟 벡터의 T7E1 어쎄이 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 형질전환 세포주 TA226의 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 형질전환 세포주 GTKO/iGb3sKO/CMAHKO의 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 GFP 형광이 태그된 β4GalNT2 타겟 벡터를 형질도입 시킨 후, 형질전환 세포 내 형광 발현을 확인하고, 이를 분리한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 형질전환 세포주 #3, #6, #24에서 β4GalNT2 유전자 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 사진이다.
도 18은 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 형질전환 복제돼지 유래 혈관내피세포에 인간 혈청을 처리하였을 때, 처리 시간에 따른 항체 결합율을 나타낸 도이다.
도 2는 돼지 GGTA1을 넉아웃 시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 돼지 GGTA1 타겟 벡터의 T7E1 어쎄이 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 돼지 CMAH 액손 8번의 염기서열, 타겟 서열 및 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 5는 돼지 CMAH 를 넉아웃 시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 6은 돼지 CMAH 타겟 벡터의 T7E1 어쎄이 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 돼지 iGb3s 엑손 3번의 염기서열, 타겟 서열 및 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 8은 돼지 iGb3s 를 넉아웃 시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 9는 돼지 iGb3s 타겟 벡터의 T7E1 어쎄이 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 돼지 β4GalNT2 액손 1번의 염기서열, 타겟 서열 및 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 11은 돼지 β4GalNT2를 넉아웃 시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 12는 돼지 β4GalNT2 타겟 벡터의 T7E1 어쎄이 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 형질전환 세포주 TA226의 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 형질전환 세포주 GTKO/iGb3sKO/CMAHKO의 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 GFP 형광이 태그된 β4GalNT2 타겟 벡터를 형질도입 시킨 후, 형질전환 세포 내 형광 발현을 확인하고, 이를 분리한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 형질전환 세포주 #3, #6, #24에서 β4GalNT2 유전자 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 사진이다.
도 18은 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 형질전환 복제돼지 유래 혈관내피세포에 인간 혈청을 처리하였을 때, 처리 시간에 따른 항체 결합율을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA(small guideRNA)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 GGTA1 (Alpha 1,3-Galactosyltransferase) 넉아웃용 재조합 벡터; 서열번호 5 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) 넉아웃용 재조합 벡터; 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 넉아웃용 재조합 벡터; 및 서열번호 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2) 넉아웃용 재조합 벡터를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조를 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조를 위한 재조합 벡터는 하나의 양태로서, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열; 서열번호 5 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열; 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열; 및 서열번호 12 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열이 하나의 벡터에 모두 포함된 형태일 수 있으며, 다른 양태로서, 상기 각 sgRNA를 암호화하는 염기서열이 별개의 벡터에 하나 이상 포함된 다수 개의 벡터의 군으로 이루어진 형태일 수 있다. 즉, 목적 서열을 포함할 수 있는 한 벡터의 형태 및 개수에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 'GGTA1 (알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제)' 유전자는 α-Gal의 생합성을 담당하는 것으로, 돼지의 경우 8개의 인트론과 9개의 엑손으로 구성되어 있다.
상기 GGTA1 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 엑손 9번(GenBank accession no. AF221517)에 위치한 서열번호 1 내지 4로 표시되는 염기서열 부위, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열 부위, 즉 가이드 서열 부위를 인지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 'CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase)' 유전자는 Neu5Gc의 생합성을 담당하는 것이다.
상기 CMAH 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 엑손 8번 (GenBank accession no. NM_001113015.1)에 위치한 서열번호 5 내지 7로 표시되는 염기서열 부위, 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열 부위, 즉 가이드 서열 부위를 인지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 'iGb3s (Isoglobotrihexosylceramide synthase)' 유전자는 글리코스핑고리피드인 iGb3를 합성한다.
상기 iGb3s 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 엑손 3번 (Genbank accession No. XM_021095855)에 위치한 서열번호 8 내지 11로 표시되는 염기서열 부위, 바람직하게는 서열번호 11의 염기서열 부위, 즉 가이드 서열 부위를 인지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 'β4GalNT2(beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2)' 유전자는 SDa 항원을 합성한다.
상기 β4GalNT2 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 액손 1번(Genbank accession No. NM_001244330.1)에 위치한 서열번호 12 내지 15로 표시되는 염기서열 부위, 바람직하게는 서열번호 12의 염기서열 부위, 즉 가이드 서열 부위를 인지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 sgRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA로서, 서열번호 1 내지 15로 표시되는 DNA로부터 전사될 수 있다.
본 발명에 있어서, 'CRISPR-Cas9'은 유전자 가위의 한 종류로, 유전자 제거를 위한 클로닝에 이용된다.
본 발명에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (transactivating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)를 형성한다. Cas9 단백질을 암호화하는 유전자는 일반적으로 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)와 관련있으며, 40개 이상의 서로 다른 Cas 단백질 패밀리가 존재한다. 대표적으로 세 종류의 CRISPR-Cas 시스템이 존재하며 그 중 Cas9 단백질을 수반하는 타입 Ⅱ CRISPR/Cas 시스템이 대표적이다.
본 발명에 있어서, '유전자 가위'란 유전체에서 원하는 부위의 DNA를 잘라내는 기술로, 유전체에서 특정 염기서열을 인식한 후 해당 부위의 DNA를 정교하게 잘라내는 유전자 교정(genome editing) 기술을 의미한다.
본 발명의 넉아웃용 재조합 벡터에는 DNA 결합과 관련된 gRNA(guide RNA)와 DNA 절단을 위한 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래 SpCas9이 포함되며, 상기 gRNA domain 에는 DNA 내의 어떤 서열에도 결합할 수 있는 클로닝 부위가 있어 genomic DNA 중 원하는 특정서열에 결합할 수 있다. 특정부위에 결합한 gRNA의 유도 및 Cas9 단백질의 활성을 통해 DNA 절단을 유도한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 도 2, 도 5, 도 8 및 도 11에 개시된 벡터맵으로 표시된 벡터의 조합일 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 재조합 벡터가 도입된, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 플라스미드 또는 비플라스미드성 나출(naked DNA)에 의한 진핵세포의 형질전환을 세포의 종양화의 의미로서의 형질전환과 구분하기 위해, '형질감염(transfection)'이라고 부르기도 하는데, 본 발명에서는 동일한 의미로 사용된다.
상기 체세포는 바람직하게는 섬유아세포이며, 보다 바람직하게는 돼지의 섬유아세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환을 위한 재조합 벡터는 1개 이상의 sgRNA를 암호화하는 염기서열이 포함된 벡터가 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 형질전환 세포는 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 모두 제거된 것으로, 바람직하게는 2017년 10월 31일에 한국세포주은행에 기탁한 수탁번호 KCLRF-BP-00412의 세포일 수 있다.
또 다른 양태로서 본 발명은 상기 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조방법 및 상기 방법에 의해 생산된 이종장기이식용 형질전환 복제돼지를 제공한다.
본 발명에서 용어 '핵 이식'은 핵이 없는 세포에 다른 세포의 핵 DNA를 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말하며, 당 분야에서 공지된 방법을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에서 용어 '핵 이식란'은 공여핵원세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
본 발명에서 용어 '탈핵 난자'는 난자의 핵이 제거된 것을 말한다.
본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 유전자 가위인 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자의 두 좌위가 모두 제거되어 있는바, 이종장기이식에서 발생하는 초급성 및 급성 면역거부반응을 극복할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
GGTA1
,
CMAH
,
iGb3s
및
β4GalNT2
유전자
타겟팅
벡터 제조
1-1.
GGTA1
유전자를 제거하기 위한 재조합 벡터의 제조
돼지 GGTA1 유전자를 넉아웃하기 위하여, 타겟 부위를 GGTA1의 엑손 9번으로 선택하였다. 돼지 GGTA1 엑손 9의 염기서열 (GenBank accession no. AF221517)을 분석하여 guide RNA가 결합할 수 있는 엑손의 염기서열 부위를 결정하였고, 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 보다 구체적으로, 도 1에 표시한 돼지 GGTA1 엑손 9의 염기서열 중 선별한 4개의 gRNA 염기서열을 각각 포함하도록, 도 1에 개시된 두 프라이머를 혼성화한 후, 그 산물을 Cas9 벡터에 삽입하였다. gRNA 서열을 표 1에 나타내었으며, 완성된 벡터의 서열 분석을 수행하여 가이드 서열 도입 유무를 확인하였다 (제노텍). 도 2는 서열번호 2의 gRNA를 포함하는 플라스미드 벡터의 벡터맵을 일례로 나타낸 것이다.
다음으로, 각 gRNA 위치에 따른 타겟팅 효율 검증을 하기 위하여 4개의 gRNA를 각각 포함하도록 제조된 재조합 벡터 4종을 돼지 섬유아세포주에 전기천공법 키트(amaxa)를 이용하여 형질전환하였으며, T7E1 어쎄이를 실시하였다. 보다 구체적으로, 형질전환을 실시하고 48시간 후 Dneasy blood & tissue kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 각각의 형질전환 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 50ng 게놈 DNA 및 프라이머(276F : 5'-CACCTGCAAATACATACTTCATGGT-3', 277R : 5'-AAACACCATGAAGTATGTATTTGCA-3')를 이용하여 PCR 산물을 수득하였다. PCR 산물을 정제 가열한 후 95℃에서 59℃까지는 0.4℃씩, 59℃에서 26℃까지는 0.3℃씩 천천히 온도를 내린 후, 0.5 ㎕, T7E1 (NEW England BioLabs) 효소와 37℃에서 1시간동안 반응시키고 2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 서열번호 2의 gRNA를 포함하는 2번 재조합 벡터가 표적 유전자 부위인 GGTA1 유전자의 발현을 가장 높은 효율로 변화시키는 것을 확인하였으며, 이후 실험에서는 GGTA1 KO 2번 재조합 벡터를 이용하였다.
1-2.
CMAH
유전자를 제거하기 위한 재조합 벡터의 제조
돼지 CMAH 유전자가 넉아웃된 돼지를 생산하기 위하여, 타겟 부위를 CMAH의 엑손 8번으로 선택하였다. 돼지 CMAH 엑손 8의 염기서열(GenBank accession no. NM_001113015.1)을 분석하여, guideRNA가 결합할 수 있는 엑손의 염기서열 부위를 결정하였고, 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 보다 구체적으로, 도 4에 표시한 돼지 CMAH 엑손 8의 염기서열 중 선별한 3개의 gRNA 염기서열을 각각 포함하도록, 도 4에 개시된 두 프라이머를 혼성화한 후, 그 산물을 Cas9-GFP 벡터에 삽입하였다. 완성된 벡터의 서열 분석을 수행하여 가이드 서열 도입 유무를 확인하였다. gRNA 서열을 표 2에 나타내었으며, 완성된 벡터의 서열 분석을 수행하여 가이드 서열 도입 유무를 확인하였다 (제노텍). 도 5는 서열번호 5의 gRNA를 포함하는 플라스미드 벡터의 벡터맵을 일례로 나타낸 것이다.
다음으로, 각 gRNA 위치에 따른 타겟팅 효율 검증을 하기 위하여 3개의 gRNA를 각각 포함하도록 제조된 재조합 벡터 3종을 돼지 섬유아세포에 lipofectamine 3000 (Invitrogen)을 이용하여 형질전환하고, T7E1 어쎄이를 실시하였다. 보다 구체적으로, 형질전환을 실시한 후 48시간 뒤 Dneasy blood & tissue kit (QIAGEN)를 이용하여 각각의 형질전환된 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 100ng 게놈 DNA 및 프라이머 (414F : 5’-ATGAAGGCAGCTGCTACTGGT-3’, 415R : 5’-CTCCAGTTCCTAAAGAGACCA-3’)를 이용하여 증폭된 산물을 수득하였으며, 산물을 정제 가열한 후 95℃에서 59℃까지는 0.4℃씩, 59℃에서 26℃까지는 0.3℃씩 천천히 온도를 내린 후 0.5 μl T7E1 (NEW England BioLabs) 효소와 37℃에서 1시간동안 반응시키고, 2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 서열번호 5의 gRNA를 포함하는 1번 재조합 벡터가 표적 유전자 부위인 CMAH 유전자의 발현을 가장 높은 효율로 변화시키는 것을 확인하였으며, 이후 실험에서는 CMAH KO 1번 재조합 벡터를 이용하였다.
1-3.
iGb3s
유전자를 제거하기 위한 재조합 벡터의 제조
돼지 iGb3s 유전자가 넉아웃된 돼지를 생산하기 위하여, 타겟 부위를 iGb3s의 액손 3번으로 선택하였다. 돼지 iGb3s 액손 3의 염기서열(GenBank accession no. XM_021095855.1)을 분석하여, guideRNA가 결합할 수 있는 액손의 염기서열 부위를 결정하였고, 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 보다 구체적으로, 도 7에 표시한 돼지 iGb3s 액손 3의 염기서열 중 선별한 4개의 gRNA 염기서열을 각각 포함하도록, 도 7에 개시된 두 프라이머를 혼성화한 후, 그 산물을 Cas9-GFP 벡터에 삽입하였다. 완성된 벡터의 서열 분석을 수행하여 가이드 서열 도입 유무를 확인하였다. gRNA 서열을 표 3에 나타내었으며, 완성된 벡터의 서열 분석을 수행하여 가이드 서열 도입 유무를 확인하였다 (제노텍). 도 8는 서열번호 11의 gRNA를 포함하는 플라스미드 벡터의 벡터맵을 일례로 나타낸 것이다.
다음으로, 각 gRNA 위치에 따른 타겟팅 효율 검증을 하기 위하여 4개의 gRNA를 각각 포함하도록 제조한 재조합 벡터 4종을 돼지 섬유아세포주에 Lipofectamine3000(Invitrogen)을 이용하여 형질전환하였으며, T7E1 어쎄이를 실시하였다. 보다 구체적으로 형질전환을 실시하고 48시간 후 Dneasy blood & tissue kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 각각의 형질전환 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 50ng 게놈 DNA 및 프라이머(F : 5'-GACAGCAGAGCAGCACTTCAT-3', R : 5'-TGTCACGCTCAAAGGGCAGCA -3')를 이용하여 PCR 산물을 수득하였다. PCR 산물을 정제 가열한 후 95℃에서 59℃까지는 0.4℃씩, 59℃에서 26℃까지는 0.3℃씩 천천히 온도를 내린 후, 0.5 ㎕, T7E1 (NEW England BioLabs) 효소와 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 서열번호 11의 gRNA를 포함하는 4번 재조합 벡터가 표적 유전자 부위인 iGb3s 유전자의 발현을 가장 높은 효율로 변화시키는 것을 확인하였으며, 이후 실험에서는 iGb3s KO 4번 재조합 벡터를 이용하였다.
1-4.
β4GalNT2
유전자를 제거하기 위한 재조합 벡터의 제조
돼지 β4GalNT2 유전자가 넉아웃된 돼지를 생산하기 위하여, 타겟 부위를 β4GalNT2 액손 1번으로 선택하였다. 돼지 β4GalNT2 액손 1의 염기서열(Genbank accession No. XM_021095855)을 분석하여, guideRNA가 결합할 수 있는 액손의 염기서열 부위를 결정하였고, 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 보다 구체적으로, 도 10에 표시한 돼지 β4GalNT2 액손 1의 염기서열 중 선별한 4개의 gRNA 염기서열을 각각 포함하도록, 도 10에 개시된 두 프라이머를 혼성화한 후, 그 산물을 Cas9-GFP 벡터에 삽입하였다. 완성된 벡터의 서열 분석을 수행하여 가이드 서열 도입 유무를 확인하였다. gRNA 서열을 표 4에 나타내었으며, 완성된 벡터의 서열 분석을 수행하여 가이드 서열 도입 유무를 확인하였다 (제노텍). 도 11은 서열번호 12의 gRNA를 포함하는 플라스미드 벡터의 벡터맵을 일례로 나타낸 것이다.
다음으로, 각 gRNA 위치에 따른 타겟팅 효율 검증을 하기 위하여 4개의 gRNA를 각각 포함하도록 제조한 재조합 벡터 4종을 돼지 섬유아세포주에 Lipofectamine3000 (Invitrogen)을 이용하여 형질전환 하였으며, T7E1 어쎄이를 실시하였다. 보다 구체적으로 형질전환을 실시하고 48시간 후 Dneasy blood & tissue kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 각각의 형질전환 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 50ng 게놈 DNA 및 프라이머 (F : 5-GCTCAAGTTGCTATTCCCATC-3', R : 5'-GGCACAGTAAAGCCACAGGAGG-3')를 이용하여 PCR 산물을 수득하였다. PCR 산물을 정제 가열한 후 95℃에서 59℃까지는 0.4℃씩, 59℃에서 26℃까지는 0.3℃씩 천천히 온도를 내린 후, 0.5 ㎕, T7E1(NEW England BioLabs) 효소와 37℃에서 1시간동안 반응시키고 2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 서열번호 12의 gRNA를 포함하는 1번 재조합 벡터가 표적 유전자 부위인 β4GalNT2 유전자의 발현을 가장 높은 효율로 변화시키는 것을 확인하였으며, 이후 실험에서는 β4GalNT2 KO 1번 재조합 벡터를 이용하였다.
실시예
2.
GGTA1
,
CMAH
,
iGb3s
및
β4GalNT2
유전자가 제거된 형질전환 세포주의 구축
2-1.
GGTA1
유전자가 제거된 형질전환 세포주의 제조 및 이의 검증
돼지 섬유아세포주에 전기천공법 키트 (Amaxa)를 이용하여 상기 실시예 1에서 효율이 검증된 GGTA1 KO 2번 재조합 벡터 (gRNA 5'-GCAAATACATACTTCATGGT-3', 도 2 참조)를 도입하였으며, 콜로니 배양 및 분석을 통하여 GGTA1 유전자가 제거된 형질전환 세포주를 확인하였다. 보다 구체적으로, Dneasy Blood & tissue kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 각각의 형질전환 세포 콜로니로부터 게놈 DNA를 추출한 후, 276F, 277R 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 수득한 PCR 산물을 솔젠트사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 형질전환 세포주에서 표적 유전자 부위인 GGTA1 유전자가 잘 제거되었음을 확인하였다. 상기 실험을 통해 확립한 형질전환 세포주를 GTKO-226으로 명명하고, 2016년 11월 02일에 한국세포주은행에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00396을 부여받았다.
2-2.
GGTA1
,
CMAH
및
iGb3s
유전자가 제거된 형질전환 세포주의 제조 및 이의 검증
상기 실시예 2-1의 GGTA1 유전자가 제거된 형질전환 세포주에 상기 실시예 1-2 (도 5 참조) 및 1-3 (도 8 참조)에서 구축한 재조합 벡터(CMAH KO 1번 재조합 벡터 및 iGb3s KO 4번 재조합 벡터)를 lipofectamine3000을 이용하여 동시 형질전환하였다. CMAH 및 iGb3s 결손을 위한 Cas9-GFP 벡터는 GFP(Green Fluorescence Protein) 형광이 삽입되어 있는바, FACS AriaII 장비(BD bioscience)를 이용해 GFP 양성 세포만 분리하여 CMAH 및 iGb3s 타겟팅 벡터가 삽입된 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 콜로니 배양 및 분석을 통하여 CMAH 및 iGb3s 유전자가 제거된 형질전환 세포주를 확인하였다. 보다 구체적으로, Dneasy Blood & tissue kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 각각의 형질전환 세포 콜로니로부터 게놈 DNA를 추출한 후, 도 4, 도 7에 나타낸 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 수득한 PCR 산물을 솔젠트사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 형질전환 세포주에서 표적 유전자 부위인 GGTA1, CMAH, iGb3s 유전자가 모두 제거되었음을 확인하였다. 상기 실험을 통해 확립한 형질전환 세포주를 GTKO/iGb3sKO/CMAHKO라고 명명한 후, 2017년 03월 14일에 한국세포주은행에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00398을 부여받았다.
2-3.
GGTA1
,
CMAH
,
iGb3s
및
β4GalNT2
유전자가 제거된 형질전환 세포주의 구축
상기 실시예 2-2의 GGTA1, CMAH 및 iGb3s 유전자가 제거된 형질전환 세포주에 상기 실시예 1-4 (도 11 참조)에서 구축한 재조합 벡터(β4GalNT2 KO 1번 재조합 벡터)를 Lipofectamine3000을 이용하여 형질전환하였다. β4GalNT2 유전자 결손을 위한 Cas9-GFP 벡터는 GFP 형광이 삽입되어 있는바, FACS AriaII 장비를 이용해 GFP 양성 세포만 분리하여 β4GalNT2 타겟팅 벡터가 삽입된 세포를 분리하였다. 이 과정을 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 형광현미경 관찰 결과, GFP 형광이 나타나는 세포만 잘 분리되었음을 확인하였다.
다음으로, FACS AriaII 장비를 이용하여 분리된 세포의 단일 세포 콜로니 배양을 진행한 후, 콜로니의 유전자 분석을 수행하였다. 보다 구체적으로, Dneasy Blood & tissue kit를 이용하여 각각의 형질전환 세포 콜로니로부터 게놈 DNA를 추출한 후 β4GalNT2 타겟팅 부위가 포함되도록 PCR을 수행하였다. 수득한 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인한 후, 제노텍사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 형질전환 세포주 (#3, #6, #24)에서 표적 유전자 부위인 β4GalNT2 유전자가 잘 제거됐음을 확인하였다.
이상의 실험을 통해 확립한, GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 제거된 형질전환 세포주 #24를 QKO라고 명명한 후, 2017년 10월 31일에 한국세포주은행에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00412를 부여받았다.
실시예
3.
GGTA1
,
CMAH
,
iGb3s
및
β4GalNT2
유전자가 제거된
형질전환 돼지의
생산
3-1. 난모세포(
oocyte
)의 준비
미성숙 암돼지의 난소를 수득한 후, 35℃의 0.9 % NaCl 용액에 넣어 실험실로 운반하였다. COCs(Cumulus-oocyte complexes)는 10 mL 일회용 주사기에 고정된 18-게이지 바늘을 이용하여 2-6 mm 지름의 미성숙 난포(antral follicle)로부터 흡입되었다. COCs를 0.1 % 폴리비닐알코올, 3.05 mM D-글루코스, 0.91 mM 피루브산 나트륨, 0.57 mM cysteine, 0.5 ㎍/mL LH (L-5269, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), 0.5 ㎍/mL FSH (F-2293, Sigma-Aldrich Corp.), 10 ng/mL 표피생장인자(E-4127, Sigma-Aldrich Corp.), 75 ㎍/mL 페니실린 G 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신을 포함한 TCM 199 (31100-035, Gibco Grand Island, NY, USA)로 3회 세척하였다. 약 50-60 COCs를 미네랄 오일로 덮인 4-웰 멀티디쉬 (Nunc, Roskilde, Denmark)에 옮긴 후, 500 mL의 동일한 배지를 첨가하고, 5 %의 CO2 및 39℃의 조건에서 배양하였다.
3-2. 핵 이식
핵 이식(nuclear transfer)은 Park 등 (Biol. Reprod. 66:1001-1005, 2002)의 방법을 약간 수정하여 수행하였다. 보다 구체적으로, 배양 42 내지 44시간 후에, 0.1 % PVA 및 0.2 % 히알루로니다아제를 포함하는 TL-HEPES에서 4분 동안 강하게 볼텍싱하여 난구세포 (cumulus cell)로부터 난모세포를 분리하였다. 0.3 % BSA (Sigma-Aldrich Corp., A-8022) 및 7.5 ㎍/mL 시토칼라신 B를 포함하는 TCM 199에서 미세 유리 피펫을 이용하여 제1 극체 및 인접 세포질을 흡입함으로써 난구세포-없는 난모세포에서 세포핵을 제거하였다. SCNT에 앞서 혈청 기아(serum starvation)를 위하여, 상기 실시예 2에서 제조한 공여 세포를 0.5 % FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 3일 동안 배양하였다. 단일 공여 세포를 난모세포 막과 접촉하는 난모세포의 위란강 (perivitelline space)에 위치시켰다. 접종된 난모세포를 0.3 M 만니톨, 1.0 mM CaCl2 ·H2O, 0.1 mM MgCl2 ·6H2O 및 0.5 mM HEPES로 이루어진 배지에서 1 mm 간격으로 0.2 mm 직경의 두 백금 전극 사이에 배치하였다. 융합/활성화 (Fusion/activation)는 30 ㎲ (BTX, USA) 동안 1.1 kV/cm의 DC 펄스를 2회 연속적으로 가하여 유도하였다. 그 후, 20 내지 30개의 재구성된 배아 (reconstructed embryos)를 미네랄 오일이 덮인 4-웰 멀티디쉬에 옮기고, 500 mL의 0.4 % BSA를 보충한 NCSU (North Carolina State University)-23 배지를 첨가하였다. 배양 1 또는 2일 후, NT 배아를 승가 허용기(standing estrus)의 첫 날인 암돼지의 난관으로 외과적으로 이식하였다. 임신 상태는 초음파 스캐너 (Mysono 201, Medison Co., LTD, Seoul, Korea)로 확인하였다.
실시예
4.
GGTA1
,
CMAH
,
iGb3s
및
β4GalNT2
유전자가 제거된
형질전환 돼지의
검증
상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 돼지의 외형을 도 17에 나타내었다.
또한, 상기 형질전환 돼지의 염기서열을 확인하기 위하여, 산자의 섬유아세포를 수득한 후, 이의 염기서열을 분석하였다(솔젠트). 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 돼지의 섬유아세포에서 표적 유전자 부위인 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 모두 잘 제거되었음을 확인하였다.
실시예
5. 인간
보체
혈청-매개
IgG
,
IgM
결합 분석
상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 돼지가 항원-항체 매개 거부반응을 극복할 수 있는지를 확인하기 위하여, 인간 보체 혈청-매개 IgG, IgM 결합 분석을 수행하였다.
이를 위해 상기 실시예 3의 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 제거된 형질전환 돼지로부터 혈관내피세포를 수득하였다. 대조군으로 야생형 및 GTKO(GGTA1 결손) 또는 GTKO/iGb3sKO/CMAHKO (GGTA1/iGb3s/CMAH 유전자 결손) 형질전환 돼지를 이용하였다. 먼저, 각 개체로부터 1x106개의 혈관내피세포를 수집한 후, 인간 혈청 30%가 포함된 DPBS(Gibco) 용액으로 4℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후 DPBS로 세척하고, FITC가 결합되어있는 IgM(Sigma) 및 IgG(Invitrogen) 항체를각각 1:50의 비율로 희석하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 FACS Calibur(BD Biosciences) 장비를 이용하여 형광 세기의 값을 측정하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 GGTA1/CMAH/iGb3s/β4GalNT2 4개 유전자 결손 형질전환 돼지의 IgG 및 IgM 결합률이 야생형, GTKO(GGTA1 결손) 및 GTKO/iGb3sKO/CMAHKO (GGTA1/iGb3s/CMAH 유전자 결손) 형질전환 돼지에 비해 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 방법을 통해 제조한 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 제거된 형질전환 돼지는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제, Neu5Gc, 글리코스핑고리피드인 iGb3 및 Sda 생성이 제거되어, 이종장기이식에서 발생하는 항원-항체 매개 거부반응을 극복할 수 있음을 확인하였다.
<110> Optipharm.CO.,LTD
<120> Transgenic cloned piglets defecting porcine GGTA1, CMAH, iGb3s
and beta4GalNT2 gene for xenotransplantation, and producing
method thereof
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<170> KoPatentIn 3.0
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ccgtagaaat cgggtttctc 20
Claims (11)
- 서열번호 2로 표시되는 sgRNA(small guideRNA)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 GGTA1 (Alpha 1,3-Galactosyltransferase) 넉아웃용 재조합 벡터;
서열번호 5로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) 넉아웃용 재조합 벡터;
서열번호 11로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 넉아웃용 재조합 벡터; 및
서열번호 12로 표시되는 sgRNA를 암호화하는 염기서열을 포함하는 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2) 넉아웃용 재조합 벡터;를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조를 위한 재조합 벡터 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터 조성물은 돼지엑손 9번(GenBank accession no. AF221517)을 인지하여 GGTA1(Alpha 1,3-Galactosyltransferase) 유전자를 넉아웃시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터 조성물은 돼지엑손 8번(GenBank accession no. AF221517)을 인지하여 CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) 유전자를 넉아웃시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터 조성물은 돼지엑손 3번 (Genbank accession No. XM_021095855)을 인지하여 iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 유전자를 넉아웃시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터 조성물은 돼지엑손 1번(Genbank accession No. NM_001244330.1)을 인지하여 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2) 유전자를 넉아웃시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터 조성물.
- 삭제
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터 조성물이 도입된, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포.
- 제7항에 있어서, 상기 형질전환 세포는 수탁번호 KCLRF-BP-00412인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
- 제7항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
- 제7항의 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및
상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조방법. - 제10항의 방법으로 생산한 이종장기이식용 형질전환 복제돼지.
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| KR1020180034466A KR102040203B1 (ko) | 2018-03-26 | 2018-03-26 | 돼지 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 결손된 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Estrada, JL. et al., Xenotransplantation, 2015, vol.22, pp.194-202* |
| GAO, H. et al., Journal of Reproduction and Development, 2017, vol.63, no.1, pp.18-26 (2016.10.08. 온라인 공개)* |
| Li, P. et al., Xenotransplantation, 2015, vol.22, pp.20-31* |
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| KR102579434B1 (ko) * | 2021-03-10 | 2023-09-15 | 한국생명공학연구원 | Cmah, Ggta1, 및 iGb3s 유전자가 결손된 형질전환 마우스, 및 그의 용도 |
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