CN114980927A - Cd38抗体的配制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含与CD38结合的抗体的药物配制剂以及所述配制剂在治疗癌症和其他适应症中的用途。

Description

CD38抗体的配制剂及其用途
发明领域
包含抗CD38抗体的药物组合物及其作为药物，例如在治疗或预防癌症中的用途。
发明背景
CD38是一种II型跨膜糖蛋白，通常在造血细胞中发现，在实体组织中水平较低。CD38在造血细胞中的表达取决于细胞的分化和激活状态。谱系定型的造血细胞表达该蛋白质，而成熟细胞丢失该蛋白质并在活化的淋巴细胞上再次表达。CD38也在B细胞上表达，因此浆细胞表达特别高水平的CD38。约80％的静息NK细胞和单核细胞以较低水平表达CD38，其他各种血液细胞类型，包括***生发中心淋巴母细胞、滤泡内细胞、树突细胞、红细胞和血小板也如此(Lee and Aarhus 1993；Zocchi,Franco et al.1993；Malavasi,Funaroet al.1994；Ramaschi,Torti et al.1996)。对于实体组织，CD38在肠道中由上皮内细胞和固有层淋巴细胞、由脑中的浦肯野细胞和神经原纤维缠结、由***中的上皮细胞、胰腺中的β细胞、骨中的破骨细胞、眼中的视网膜细胞，以及平滑肌和横纹肌的肌膜中表达。
CD38在大量血液恶性肿瘤中表达。已经特别是在多发性骨髓瘤(MM)(Lin,Owenset al.2004)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(Damle 1999)的恶性细胞中观察到表达，并且在瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Konoplev,Medeiros et al.2005)、原发性***性淀粉样变性(Perfetti,Bellottietal.1994)、套细胞淋巴瘤(Parry-Jones,Matutes et al.2007)、急性淋巴母细胞性白血病(Keyhani,Huh et al.2000)、急性髓系白血病(Marinov,Koubeket al.1993；Keyhani,Huh et al.2000)、NK细胞白血病(Suzuki,Suzumiya et al.2004)、NK/T细胞淋巴瘤(Wang,Wang et al.2015)和浆细胞白血病(van de Donk,Lokhorst etal.2012)。
可能涉及CD38表达的其他疾病包括，例如，肺支气管上皮癌、乳腺癌(由乳腺导管和小叶中的上皮衬的恶性增殖演变而来)、从β细胞演变而来的胰腺肿瘤(胰岛素瘤)、从肠道上皮演变而来的肿瘤(例如腺癌和鳞状细胞癌)、***癌、睾丸***瘤、卵巢癌和神经母细胞瘤。其他公开也表明CD38在自身免疫中的作用，诸如Graves病和甲状腺炎(Antonelli,Fallahi et al.2001)、1型和2型糖尿病(Mallone and Perin 2006)以及哮喘期间气道平滑肌细胞的炎症(Deshpande,White et al.2005)。此外，CD38表达与HIV感染有关(Kestens,Vanham et al.1992；Ho,Hultin et al.1993)。
CD38是多功能蛋白。归因于CD38的功能包括在粘附和信号传导事件中的受体介导和(外)酶活性。作为外酶，CD38使用NAD+作为底物用于形成环状ADP-核糖(cADPR)和ADPR，但也形成烟酰胺和烟酸-腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)。已经显示cADPR充当Ca2+从内质网膜系动员的第二信使。
几种抗CD38抗体描述于文献中，例如在WO 2006/099875 A1、WO2008037257 A2、WO2011/154453 A1、WO 2007/042309 A1、WO 2008/047242 A1、WO2012/092612 A1、Cotner,Hemler et al.1981；Ausiello,Urbani et al.2000；Lande,Urbani et al.2002；deWeers,Tai et al.2011；Deckert,Wetzel et al.2014；Raab,Goldschmidt et al.2015；Eissler,Filosto et al.2018；Roepcke,Plock et al.2018；和Schooten 2018中。
CD38抗体可能通过以下一种或多种作用机制影响表达CD38的肿瘤细胞：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、程序性细胞死亡、胞啃作用、免疫抑制细胞的消除和酶活性的调节(van de Donk,Janmaat etal.2016；Krejcik,Casneuf et al.2016；Krejcik,Frerichs et al.2017；Chatterjee,Daenthanasanmak et al.2018；van de Donk 2018)。然而，在2014年，提出了尚未描述可以诱导有效CDC、ADCC、ADCP以及有效抑制CD38酶活性的CD38抗体(Lammerts van Bueren,Jakobs et al.2014)。
效应物功能的优化可以提高治疗性抗体用于治疗癌症或其他疾病的有效性，例如提高抗体引发对抗原表达细胞的免疫应答的能力。这些努力描述于，例如WO 2013/004842A2；WO 2014/108198 A1；WO 2018/031258 A1；Dall’Acqua,Cook et al.2006；Moore,Chenet al.2010；Desjarlais and Lazar 2011；Kaneko and Niwa 2011；Song,Myojo etal.2014；Brezski and Georgiou 2016；Sondermann and Szymkowski 2016；Zhang,Armstrong et al.2017；Wang,Mathieu et al.2018。
然而，尽管在本领域中做出了这些和其他努力，但仍需要具有调节的效力的CD38治疗性抗体，以及包含此抗体的配制剂。
发明内容
本发明涉及组合物，诸如药物组合物，其包含CD38抗体C，其包含选自对应于人IgG1重链中的E430、E345或S440的组的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区，其中氨基酸残基根据EU索引编号。
因此，在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含
a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包括
-抗原结合区，其包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3，和
-Fc区，其包含选自对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的组的一个或多个氨基酸残基中的突变，其中氨基酸残基根据EU索引编号；
b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
d)表面活性剂。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含
a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包括
-重链，其包括包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有如SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3的VH区和在E430、E345和S440中的一个或多个中具有突变的人IgG1 CH区，氨基酸残基根据EU索引编号，和
-轻链，其包括包含具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有AAS序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3的VL区；
b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
d)表面活性剂。
下面更详细地描述本发明的这些和其他方面和实施方案。
附图说明
图1显示了使用Clustal 2.1软件对对应于人IgG1重链中残基P247至K447的人IgG1m(a)、IgG1m(f)、IgG2、IgG3和IgG4 Fc区段的氨基酸序列比对，其中氨基酸残基根据Kabat中所示的EU索引编号。所示的氨基酸序列对应于指定为IgG1m(za)(SEQ ID NO:64；UniProt登录号P01857)、IgG1m(f)(SEQ ID NO:65)；IgG1m(z)(SEQ ID NO:66)；IgG1m(a)(SEQ ID NO:67)和IgG1m(x)(SEQ ID NO:68)的人IgG1的同种异型变体的重链恒定区中的残基130至330；IgG2重链恒定区的残基126至326(SEQ ID NO:79；UniProt登录号P01859)；IgG3重链恒定区的残基177至377(SEQ ID NO:80；UniProt登录号P01860)和IgG4重链恒定区的残基127至327(SEQ ID NO:81；UniProt登录号P01861)。
图2显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B、IgG1-C和同种型对照抗体相比，CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G与表达CD38的NALM16细胞的结合。有关更多详细信息，参见实施例2。
图3显示了与同种型对照抗体相比，CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G与食蟹猴(cynomolgus)PBMC(A)或表达高拷贝数人CD38的Daudi细胞(B)上表达的CD38的结合。有关更多详细信息，参见实施例2。
图4显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B和IgG1-C相比，在CDC测定法中Ramos(A)、Daudi(B)、Wien-133(C)、NALM-16(D)、REH(E)、RS4；11(F)、U266(G)和RC-K8(H)肿瘤细胞系的由CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G诱导的百分比裂解。有关更多详细信息，参见实施例3。
图5显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B和IgG1-C相比，在对全血进行的CDC测定法中CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G对活的NK细胞(A)、T细胞(B)和B细胞(C)数量的影响。有关更多详细信息，参见实施例3。
图6显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B、IgG1-C和同种型对照抗体相比，铬释放ADCC测定法中由CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G诱导的Daudi细胞的百分比裂解。有关详细信息，参见实施例4。
图7显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B、IgG1-C和同种型对照抗体相比，ADCC报告物测定法中CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G的剂量依赖性FcγRIIIa交联。有关详细信息，参见实施例4。
图8显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B、IgG1-C和同种型对照抗体相比，在ADCP测定法中CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G对PKH-29pos、CD14pos和CD19neg巨噬细胞百分比的影响。有关更多详细信息，参见实施例5。
图9显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B、IgG1-C和同种型对照抗体相比，在用(C、E、G)或不用(A、B、D、F)Fc交联抗体进行的凋亡测定法中Ramos(A)、Daudi(B、C)、Wien-133(D、E)和NALM-16(F、G)肿瘤细胞系的由CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G诱导的百分比裂解。有关更多详细信息，参见实施例6。
图10说明了CD38的酶活性。
图11显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B、IgG1-C和同种型对照抗体相比，如随时间的％NDG转化所反映的CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G对HisCD38(A)、Daudi细胞(B)和Wien-133细胞(C)的环化酶活性的影响。
图12显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B、IgG1-C和同种型对照抗体相比，CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G与巨噬细胞共培养45分钟后对Daudi细胞上CD38表达的影响。巨噬细胞来自供体A(A、B)或供体B(B、D)，并测试抗体调理细胞的CD38表达(A、B)或人IgG染色(C、D)。
图13显示了与IgG1-B相比，CD38抗体IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G在有或没有PBMC的情况下对T调节细胞上CD38表达的影响。
图14显示了与CD38抗体IgG1-B(空心圆形)和同种型对照抗体(空心菱形)相比，在CDC测定法中不同B细胞肿瘤细胞系的由CD38抗体IgG1-A-E430G(实心三角形)、IgG1-B-E430G(实心圆形)和IgG1-C-E430G(实心正方形)诱导的百分比裂解。有关更多详细信息，参见实施例3。
图15显示了表4中描绘的一些EC50值的汇总。显示了由抗体IgG1-B、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G在20种不同B细胞肿瘤细胞系上诱导的CDC的EC50值。每个正方形、三角形或圆形代表不同的B细胞肿瘤细胞系。不包括用AML细胞系获得的EC50值，因为没有在AML细胞系上测试IgG1-B-E430G。
图16显示了与CD38抗体IgG1-B(空心圆形)和同种型对照抗体(实心方块)相比，在CDC测定法中不同AML肿瘤细胞系的由CD38抗体IgG1-C-E430G(实心圆形)诱导的百分比裂解。有关更多详细信息，参见实施例3。
图17显示了与CD38抗体IgG1-B(空心圆形)相比，在CDC测定法中T调节细胞的由CD38抗体IgG1-B-E430G(实心圆形)和IgG1-C-E430G(实心正方形)诱导的百分比裂解。有关更多详细信息，参见实施例3。
图18显示了与CD38抗体IgG-B、IgG1-C和IgG1-b12-E430G相比，在铬释放ADCC测定法中由CD38抗体IgG1-B-E430G、IgG1-C-E430G诱导的Daudi、Wien-133、Granta 519和MEC-2细胞的百分比裂解。有关详细信息，参见实施例4。
图19显示了与CD38抗体IgG1-A、IgG1-B、IgG1-C和同种型对照抗体相比，在使用T调节细胞的ADCC报告物测定法中CD38抗体IgG1-A-E430G、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G的剂量依赖性FcγRIIIa交联。有关详细信息，参见实施例4。
图20显示了用CD38抗体IgG1-C-E430G或PBS(阴性对照)处理的小鼠中的肿瘤大小(mm3)。有关详细信息，参见实施例9。
图21说明了测量胞啃作用的测定法设置。1)Daudi细胞用PKH-26(膜染色)和细胞示踪紫(胞质溶胶染色)标记，并用CD38抗体调理。2)标记的Daudi细胞和巨噬细胞在37℃下共温育2小时，以允许巨噬细胞附着。3)从Daudi细胞到巨噬细胞的细胞膜转移或胞啃作用。4)巨噬细胞-Daudi相互作用的脱附和巨噬细胞中Daudi细胞膜的降解。有关详细信息，参见实施例8。
图22显示了来自3名新诊断的MM患者(A、B和D)和1名复发/难治性MM患者(C)的骨髓单个核细胞中IgG1-C-E430G或
Figure BDA0003747970340000061
的补体介导的细胞毒性。
图23显示了与CD38抗体IgG1-B(空心圆形)和同种型对照抗体(实心正方形)相比，在CDC测定法中不同MM肿瘤细胞系的由CD38抗体IgG1-C-E430G(实心圆形)诱导的百分比裂解。有关更多详细信息，参见实施例3。
发明详述
为了清楚起见，在描述本发明的实施方案时将使用特定术语。然而，本发明并不意在限于如此选择的特定术语，并且应当理解，每个特定术语包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等同物。
本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含抗体，其包括至少抗CD38抗体C的VHCDR1-3和VL CDR1-3，和包含选自对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的组的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区。
如实施例3所示，在引入E430G突变后，所有三种测试的CD38 IgG1抗体(A、B和C)的CDC均得到增强。然而，令人惊讶的是，CDC增强的幅度在测试的抗体克隆之间不同。在没有E430G突变的情况下，IgG1-B已经是CDC的良好诱导剂，而IgG1-C和IgG1-A分别诱导适度和无CDC。尽管如此，在引入E430G突变后，然而，与IgG1-B-E430G相比，IgG1-C-E430G诱导更有效的CDC。在CD38表达水平较低的肿瘤细胞和T调节细胞中，IgG1-C-E430G的EC50值低于IgG1-B-E430G的EC50值。
该抗体也可以演示ADCC。例如，如实施例4所示，IgG1-C实现了与IgG1-B相比，在51Cr释放测定法中更高的最大百分比裂解，并且与IgG1-B相比，在ADCC报告物测定法中增加的FcγRIIIa结合。E430G突变的引入降低了所有三种抗体在51Cr释放测定法中的最大百分比裂解和ADCC报告物测定法中的FcγRIIIa结合。IgG1-C-E430G在51Cr释放测定法中诱导与IgG1-B-E430G和IgG1-A-E430G相比相似的最大百分比裂解，以及在ADCC报告物测定法中相似的FcγRIIIa结合。
此外，可以保留抗CD38抗体抑制CD38环化酶活性的能力。例如，如实施例7所示，IgG1-C-E430G与IgG1-B-E430G相比表现出更强的CD38环化酶活性的抑制，前者导致约40％的抑制，而后者导致约25％的抑制。不受理论的限制，更强的CD38环化酶活性的抑制可以减少cADPR的产生，cADPR是有力的第二信使，可以调节胞质溶胶中的Ca2+动员，这反过来可能导致Ca2+动员减少和控制各种生物过程诸如增殖和胰岛素分泌的下游通路的信号传导降低。不受理论的限制，因此，更强的对CD38环化酶活性的抑制可以影响(例如，降低)免疫抑制细胞抑制免疫应答的能力。
可以受调节的其他功能包括胞啃作用。具体地，通过与巨噬细胞和CD38抗体共培养，Daudi细胞上的CD38表达显著降低；然而，在E430G突变抗体中CD38表达的降低最强(实施例8)。令人惊讶的是，仅在与E430G突变的CD38抗体温育后，与PBMC共培养的T调节细胞上的CD38表达才降低。当T调节细胞与抗体B一起温育时，未发现CD38表达降低。不受理论的限制，抗体诱导表达CD38的非癌性免疫细胞，特别是免疫抑制细胞的胞啃作用的能力可以在癌症患者中导致针对肿瘤细胞的免疫应答增加，无论肿瘤细胞是否表达CD38。
如实施例9所示，该抗体还能够在体内杀死肿瘤细胞，其中每周两次剂量的IgG1-C-E430G降低了具有最高CD38 mRNA表达的五个所测试DLBCL PDX模型中的两个中的肿瘤生长。
定义
如本文所用，术语“CD38”通常指具有SEQ ID NO:38中所示序列的人CD38(UniProtKB-P28907(CD38_HUMAN))，但除非与上下文相矛盾，否则也可以指其变体、同等型和直向同源物。具有S274、Q272R、T237A或D202G突变的人CD38变体描述于WO 2006/099875A1和WO 2011/154453 A1。
术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链、一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链组成，所有四对均可能通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已得到良好表征。参见例如基础免疫学(Fundamental Immunology)Ch.7(Paul,W.,ed.,2nded.Raven Press,N.Y.(1989))。简而言之，每条重链通常由重链可变(VH)区和重链恒定(CH)区组成。CH区通常由三个域CH1、CH2和CH3组成。重链通常通过所谓的“铰链区”中的二硫键相互连接。每条轻链通常由轻链可变(VL)区和轻链恒定区组成，后者通常由一个域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变的区域(或在序列和/或结构上定义的环形式中高变的高变区)，也称为互补决定区(CDR)，散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL区通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(另参见Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196,901 917(1987))。
除非另有说明或与上下文相矛盾，本文的CDR序列使用DomainGapAlign根据IMGT规则鉴定(Lefranc MP.,Nucleic Acids Research 1999；27:209-212和Ehrenmann F.,Kaas Q.and Lefranc M.-P.Nucleic Acids Res.,38,D301-307(2010)；另参见互联网http地址www.imgt.org/)。
除非另有说明或与上下文相矛盾，本发明中提及的CH或Fc区/Fc域中的氨基酸位置是根据EU编号(Edelman et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1969May；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest.第5版-1991 NIH出版号91-3242)。然而，除人IgG1外的另一种同种型的CH中的氨基酸残基可以替代地由野生型人IgG1重链中的相应氨基酸位置指代，其中氨基酸残基根据EU索引编号。具体地，相应的氨基酸位置可以如图1所例示，即通过(a)将非IgG1恒定区(或其区段)的氨基酸序列与人IgG1重链(或其区段)的氨基酸序列进行比对，其中氨基酸残基根据EU索引编号，和(b)鉴定氨基酸残基与IgG1重链中的哪个氨基酸位置对齐来确定。因此，此类氨基酸残基的位置在本文中可以称为“对应于……的位置处的氨基酸残基”，“对应于”后接根据EU索引编号的野生型人IgG1重链中的氨基酸位置。当提及多个不同氨基酸位置中的一个或多个时，本文可以将其称为“在选自由对应于……的位置组成的组处的一个或多个氨基酸残基中的突变”、“在对应于……位置处的一个或多个氨基酸残基中的突变”或简单地“在选自对应于……的组的一个或多个氨基酸残基中的突变”，“对应于”后接人野生型IgG1重链中的两个或多个氨基酸位置(例如E430、E345和S440)，其中氨基酸残基根据EU索引编号。
如本文所用，术语“铰链区”意指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如人IgG1抗体的铰链区对应于根据EU编号的氨基酸216-230。
如本文所用，术语“CH2区”或“CH2域”意指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如人IgG1抗体的CH2区对应于根据EU编号的氨基酸231-340。然而，CH2区也可以是本文所述的任何其他亚型。
如本文所用，术语“CH3区”或“CH3域”意指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如人IgG1抗体的CH3区对应于根据EU编号的氨基酸341-447。然而，CH3区也可以是本文所述的任何其他亚型。
本发明上下文中的术语“抗体”(Ab)是指具有与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一的衍生物。本发明的抗体包含免疫球蛋白的Fc区(在本文中也称为“Fc域”)和抗原结合区。抗体通常含有两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区，例如至少Fc域。因此，本发明的抗体可以包含Fc区和抗原结合区。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区或“Fc”区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫***的各种细胞(诸如效应细胞)和补体***的组分，诸如C1q，补体激活的经典途径中的第一组分。如本文所用，除非与上下文相矛盾，免疫球蛋白的Fc区通常包含至少免疫球蛋白CH的CH2域和CH3域，并且可以包含连接区，例如铰链区。Fc区通常通过例如连接两个铰链区的二硫桥和/或两个CH3区之间的非共价相互作用而呈二聚化形式。二聚体可以是同二聚体(其中两个Fc区单体氨基酸序列相同)或异二聚体(其中两个Fc区单体氨基酸序列在一个或多个氨基酸上不同)。优选地，二聚体是同二聚体。全长抗体的Fc区片段可以例如通过用木瓜蛋白酶消化全长抗体来生成，如本领域所公知的。除了Fc区和抗原结合区之外，如本文定义的抗体可以进一步包含免疫球蛋白CH1区和CL区中的一个或两个。抗体也可以是多特异性抗体，诸如双特异性抗体或类似分子。术语“双特异性抗体”是指对至少两个不同的、通常不重叠的表位具有特异性的抗体。此类表位可以在相同或不同的靶物上。如果表位在不同的靶物上，此类靶物可以在相同的细胞或不同的细胞或细胞类型上。如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，本文中的术语抗体包括抗体片段，其包含Fc区的至少部分并且保留与抗原特异性结合的能力。此类片段可以通过任何已知技术，诸如酶促切割、肽合成和重组表达技术提供。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。涵盖在术语“Ab”或“抗体”内的结合片段的实例包括但不限于单价抗体(在WO2007059782中由Genmab描述)；重链抗体，其仅由两条重链组成并在例如骆驼科中天然存在(例如，Hamers-Casterman(1993)Nature363:446)；ThioMabs(Roche，WO2011069104)，链交换工程化域(SEED或Seed-body)，其是不对称的和双特异性的抗体样分子(Merck，WO2007110205)；Triomab(Pharma/Fresenius Biotech,Lindhofer etal.(1995J Immunol 155:219；WO2002020039)；FcΔAdp(Regeneron，WO2010151792)，Azymetric Scaffold(Zymeworks/Merck，WO2012/058768)，mAb-Fv(Xencor，WO2011/028952)，Xmab(Xencor)，双可变域免疫球蛋白(Abbott，DVD-Ig，美国专利7,612,181)；双域双头抗体(Unilever；SanofiAventis，WO20100226923)，二双抗体(ImClone/Eli Lilly)，钮-入-孔(knob-into-holes)抗体形式(Genentech，WO9850431)；DuoBody(Genmab，WO2011/131746)；双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat,WO11143545)，DuetMab(MedImmune,US2014/0348839)，静电驾驭抗体形式(Amgen，EP1870459和WO 2009089004；Chugai，US201000155133；Oncomed，WO2010129304A2)；双特异性IgG1和IgG2(Rinat neurosciencesCorporation，WO11143545)，CrossMAbs(Roche，WO2011117329)，LUZ-Y(Genentech)，Biclonic(Merus，WO2013157953)，双靶向域抗体(GSK/Domantis)，识别两个靶物的二合一抗体或双重作用Fab(Genentech，Novlmmune，Adimab)，交联Mab(Karmanos CancerCenter)，共价融合mAb(AIMM)，CovX体(CovX/Pfizer)，FynomAb(Covagen/Janssenilag)，DutaMab(Dutalys/Roche)，iMab(MedImmune)，IgG样双特异性(ImClone/Eli Lilly，Shen,J.,et al.J Immunol Methods,2007.318(1-2):p.65-74)，TIG体，DIG体和PIG体(Pharmabcine)，双亲和性再靶向分子(Macrogenics的Fc-DART或Ig-DART，WO/2008/157379，WO/2010/080538)，Zybodies(Zyngenia)，普通轻链(Crucell/Merus，US7262028)或普通重链(Novlmmune的κλ体，WO2012023053)的方法，以及包含多肽序列的融合蛋白，所述多肽序列融合于含Fc区的抗体片段，像scFv融合体，像ZymoGenetics/BMS的BsAb，BiogenIdec的HERCULES(US007951918)，Emergent BioSolutions/Trubion和Zymogenetics/BMS的SCORPIONS，Ts2Ab(Medlmmune/AZ(Dimasi,N.,et al.J Mol Biol,2009.393(3):p.672-92))，Genentech/Roche的scFv融合体，Novartis的scFv融合体，Immunomedics的scFv融合体，Changzhou Adam Biotech Inc的scFv融合体(CN 102250246)，Roche的TvAb(WO2012025525、WO2012025530)，f-Star的mAb2(WO2008/003116)和双scFv-融合体。还应当理解，术语抗体，除非另有说明，包括单克隆抗体(诸如人单克隆抗体)、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单特异性抗体(诸如二价单特异性抗体)、双特异性抗体、任何同种型和/或同种异型的抗体；抗体混合物(重组多克隆)例如，通过Symphogen和Merus(Oligoclonics)开发的技术生成的，WO2015/158867中描述的多聚体Fc蛋白和WO2014/031646中描述的融合蛋白。虽然这些不同的抗体片段和形式通常包括在抗体的含义内，但它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。
如本文所述的“CD38抗体”或“抗CD38抗体”是与抗原CD38特异性结合的抗体。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或点特异突变或者通过体内体细胞突变引入的突变、***或缺失)，然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一哺乳动物种类，诸如小鼠的种系的CDR序列已经移植到人框架序列的抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”、“单克隆Ab”、“单克隆抗体组成”、“mAb”或类似是指具有单分子组成的Ab分子的制备物。单克隆抗体组成的Ab分子可以是单特异性的，显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力，或者是多特异性的，诸如双特异性的。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的单特异性或多特异性Ab。人mAb可以由杂交瘤生成，该杂交瘤包括从转基因或转染色体非人动物诸如转基因小鼠或大鼠中获得的B细胞，该B细胞具有包含人重链转基因库和轻链转基因库的基因组，其经重排以产生功能性人抗体并与永生化细胞融合。人单克隆Ab也可以通过重组方式生成。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别，包括例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgA2、IgE和IgM，以及任何其同种异型诸如IgG1m(z)、IgG1m(a)、IgG1m(x)、IgG1m(f)及其混合同种异型诸如IgG1m(za)、IgG1m(zax)、IgG1m(fa)等(参见，例如de Lange,Experimental and Clinical Immunogenetics 1989；6(1):7–17)。
此外，每种重链同种型均可以与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。本文使用的术语“混合同种型”是指通过将一种同种型的结构特征与来自另一种同种型的类似区域组合，从而生成杂合同种型而生成的免疫球蛋白的Fc区。混合同种型可以包含具有由两种或更多种同种型组成的序列的Fc区，所述同种型选自以下IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgGA2、IgE或IgM，从而生成组合，诸如IgG1/IgG3、IgG1/IgG4、IgG2/IgG3、IgG2/IgG4或IgG1/IgA。
术语“全长抗体”，在本文中使用时是指包含抗体，其含有对应于通常在所讨论的同种型的野生型抗体中发现的那些域的所有重链和轻链恒定和可变域，除了任何指示的突变。
当在本文中使用时，“全长二价单特异性单克隆抗体”是指由一对相同的HC和一对相同的LC形成的二价单特异性抗体，其恒定和可变域对应于通常在所讨论的特定同种型的抗体中发现的那些，除了任何指示的突变。
如本文所用，术语“抗原结合区”、“抗原结合区”、“结合区”或抗原结合域是指抗体的能够与抗原结合的区域。该结合区通常由抗体的VH和VL域定义，这些域可以进一步细分为高变的区域(或在序列和/或结构上定义的环形式中高变的高变区)，也称为互补决定区(CDR)，散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。抗原可以是任何分子，诸如多肽，例如存在于细胞上。
如本文所用，术语“靶物”是指抗体的抗原结合区所结合的分子。靶物包括所提出抗体所针对的任何抗原。关于抗体的术语“抗原”和“靶物”可以互换使用，并且对于本发明的任何方面或实施方案构成相同的含义和目的。
术语“表位”是指能够与抗体可变域特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子诸如氨基酸、糖侧链或其组合的表面分组组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者而不是与后者的结合丢失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基。
如本文所用，“变体”是指与参考序列在一个或多个氨基酸残基上不同的蛋白质或多肽序列。例如，变体可以与参考序列具有至少80％，诸如90％、或95％、或97％、或98％、或99％的序列同一性。另外或可替代地，变体可以与参考序列相差12个或更少，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，诸如氨基酸残基的取代、***或缺失。
在本发明的上下文中，保守取代可以定义为以下氨基酸类别中的取代：
-酸性残基：Asp(D)和Glu(E)
-碱性残基：Lys(K)、Arg(R)和His(H)
-亲水不带电残基：Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)和Gln(Q)
-脂肪族不带电残基：Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)
-非极性不带电残基：Cys(C)、Met(M)和Pro(P)
-芳香族残基：Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)
替代的保守氨基酸残基取代类别：
1.A S T
2.D E
3.N Q
4.R K
5.I L M
6.F Y W
氨基酸残基的替代物理和功能分类：
-含醇基的残基：S和T
-脂肪族残基：I、L、V、和M
-环烯基相关残基：F、H、W和Y
-疏水残基：A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y
-带负电荷的残基：D和E
-极性残基：C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T
-带正电荷的残基：H、K和R
-小残基：A、C、D、G、N、P、S、T和V
-极小残基：A、G和S
-参与转角形成的残基：A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和T
-柔性残基：Q、T、K、S、G、N、D、E和R
如本文所用，“序列同一性”是指两个序列之间的百分比同一性，作为序列共享的相同位置的数量的函数(即，百分比同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x100)，考虑到需要引入的空位数量和每个空位的长度，以实现两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可以例如使用已并入ALIGN程序(2.0版本)的E.Meyers andW.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11-17(1988)的算法、使用PAM 120重量残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定。此外，可以使用Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。用于序列比对的其他工具可在互联网上公开获得，并且包括但不限于EMBL-EBI网站www.ebi.ac.uk上的Clustal Omega和EMBOSS Needle。通常，可以使用默认设置。
在本发明的上下文中，除非另有说明，使用以下符号以描述突变；发生突变的氨基酸名称，随后是发生突变的位置编号，随后是突变所涵盖的内容。因此，如果突变是取代，则包括替换先前氨基酸的氨基酸名称，如果删除氨基酸，则用“*”表示，如果突变是添加，则将添加的氨基酸包括在原始氨基酸之后。氨基酸名称可以是一个或三个字母的代码。因此，例如；用甘氨酸取代430位谷氨酸称为E430G，用任何氨基酸取代430位谷氨酸称为E430X，430位谷氨酸的缺失称为E430*并且在E430位谷氨酸后添加脯氨酸称为E430EP。
如本文所用，“免疫抑制细胞”是指可以抑制受试者的免疫应答的免疫细胞，诸如通过抑制效应T细胞的活性和/或抑制T细胞增殖。这种免疫抑制细胞的实例包括但不限于调节性T细胞(Treg)、调节性B细胞(Breg)和髓系衍生抑制细胞(MDSC)。还有免疫抑制性NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞(APC)。免疫抑制性NK细胞的表型的实例是CD56brightCD16-。
“调节性T细胞”或“‘Tregs”或“Treg”是指通常通过抑制其他T细胞和/或其他免疫细胞活性来调节其活性的T淋巴细胞。Treg表型的实例是CD3+CD4+CD25+CD127dim。Treg可以进一步表达Foxp3。可以理解，Treg可以不完全限于这种表型。
“效应T细胞”或“Teffs”或“Teff”是指执行免疫应答功能的T淋巴细胞，诸如杀伤肿瘤细胞和/或激活抗肿瘤免疫应答，这可以导致肿瘤细胞从体内清除。Teff表型的实例包括CD3+CD4+和CD3+CD8+。Teff可以分泌、含有或表达标志物，诸如IFNγ、颗粒酶B和ICOS。可以理解，Teff可以不完全限于这些表型。
“髓系衍生抑制细胞”或“MDSCs”或“MDSC”是指表达巨噬细胞/单核细胞标志物CD11b和粒细胞标志物Gr-1/Ly-6G的造血谱系的特定细胞群。MDSC表型的实例是CD11b+HLA-DR-CD14-CD33+CD15+。MDSC通常还表现出成熟抗原呈递细胞标志物MHC II类和F480的低表达或不可检测的表达。MDSC是髓系谱系的未成熟细胞，并且可以进一步分化成其他细胞类型，诸如巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、单核细胞或粒细胞。MDSC可以天然存在于人和动物的正常成人骨髓或正常造血部位，诸如脾脏。
“调节性B细胞”或“Breg”或“Bregs”是指抑制免疫应答的B淋巴细胞。Breg表型的实例是CD19+CD24+CD38+。Breg可以通过抑制由Breg分泌的IL-10介导的T细胞增殖来抑制免疫应答。可以理解，存在其他Breg亚集，并且描述于例如Ding et al.,(2015)HumanImmunology 76:615-621中。
如本文所用，术语“效应细胞”是指参与免疫应答的效应期的免疫细胞。示例性免疫细胞包括髓系或淋巴样来源的细胞，例如淋巴细胞(诸如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞，诸如中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达Fc受体(FcR)或补体受体并执行特定的免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞诸如，例如自然杀伤细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞和库普弗细胞(Kupffer cell)参与靶细胞的特异性杀伤和/或将抗原呈递给免疫***的其他组分，和/或与呈递抗原的细胞结合。在一些实施方案中，ADCC可以通过导致活化的C3片段沉积在靶细胞上的抗体驱动的经典补体活化进一步增强。C3裂解产物是在髓系细胞上表达的补体受体(CR)诸如CR3的配体。效应细胞上CR对补体片段的识别可能促进增强的Fc受体介导的ADCC。在一些实施方案中，抗体驱动的经典补体激活导致在靶细胞上的C3片段。这些C3裂解产物可以促进直接补体依赖性细胞毒性(CDCC)。在一些实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原、靶颗粒或靶细胞，这可能依赖于抗体结合并由效应细胞表达的FcγR介导。效应细胞上特定FcR或补体受体的表达可能受体液因子诸如细胞因子的调节。例如，已发现FcγRI的表达由干扰素γ(IFNγ)和/或G-CSF上调。这种增强的表达增加携带FcγRI的细胞针对靶物的细胞毒活性。效应细胞可以吞噬靶抗原或吞噬或裂解靶细胞。在一些实施方案中，抗体驱动的经典补体激活导致靶细胞上的C3片段。这些C3裂解产物可以促进效应细胞的直接吞噬作用或通过增强抗体介导的吞噬作用间接促进。
如本文所用，术语“Fc效应物功能”旨在指作为多肽或抗体与其在细胞膜上的靶物诸如抗原结合的结果的功能，其中Fc效应物功能归因于多肽或抗体的Fc区。Fc效应物功能的实例包括(i)C1q结合，(ii)补体激活，(iii)补体依赖性细胞毒性(CDC)，(iv)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(v)Fc-γ受体结合，(vi)抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，(vii)补体依赖性细胞毒性(CDCC)，(viii)补体增强的细胞毒性，(ix)与抗体介导的调理抗体的补体受体结合，(x)调理作用，(xi)胞啃作用，和(xii)(i)至(xi)中任一项的组合。
如本文所用，术语“补体激活”是指经典补体途径的激活，其由称为C1的大分子复合物与表面上的抗体-抗原复合物结合引发。C1是由6个识别蛋白C1q和丝氨酸蛋白酶的异四聚体C1r2C1s2组成的复合物。C1是经典补体级联的早期事件中的第一个蛋白质复合物，它涉及一系列裂解反应，从C4裂解为C4a和C4b以及C2裂解为C2a和C2b开始。C4b沉积并与C2a一起形成称为C3转化酶的酶活性转化酶，它将补体组分C3裂解成C3b和C3a，形成C5转化酶。C5转化酶将C5***为C5a和C5b，并且最后一个组分沉积在膜上，这反过来触发补体激活的晚期事件，其中末端补体组分C5b、C6、C7、C8和C9组装成膜攻击复合物(MAC)。补体级联导致在细胞膜上创建孔，导致细胞裂解，也称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。补体激活可以通过使用C1q功效、CDC动力学CDC测定法(如WO2013/004842、WO2014/108198中所述)或通过Beurskens et al.,J Immunol April 1,2012vol.188no.7,3532-3541中描述的C3b和C4b的细胞沉积方法来评估。
如本文所用，术语“补体依赖性细胞毒性”(CDC)旨在指抗体介导的补体活化导致抗体所结合的细胞裂解的过程，不受理论约束，该过程是被认为是由所谓的膜攻击复合物(MAC)组装创建的膜中孔的结果。用于评估CDC的合适测定法是本领域已知的并且包括例如体外测定法，其中正常人血清用作补体来源，如实施例3中所述。用于确定由CD38抗体介导的CD38表达细胞的最大裂解或EC50值的测定法的非限制性实例可以包括以下步骤：
(a)在多孔板中将约100,000个CD38表达细胞铺板在每孔补充有0.2％BSA的40μL培养基中；
(b)用40μL连续稀释的CD38抗体(0.0002-10μg/mL)预温育细胞20分钟；
(c)用20％的合并正常人血清在37℃下温育每个孔45分钟；
(d)添加存活力染料并在流式细胞仪上测量细胞裂解的百分比；
(e)使用非线性回归确定最大裂解和/或计算EC50值。
如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(“ADCC”)意指通过表达识别所结合抗体恒定区的Fc受体的细胞杀伤抗体包被的靶细胞的机制。用于评估ADCC的合适测定法是本领域已知的并且包括例如实施例4中描述的测定法。用于确定由CD38抗体介导的CD38表达细胞的ADCC的测定法的非限制性实例可以包括以下列出的51Cr释放测定法或报告物测定法的步骤。
用51Cr释放测定法进行的ADCC
(a)在多孔板中将约5,000个51Cr标记的CD38表达细胞(例如Daudi细胞)铺板在每孔补充有0.2％BSA的50μL培养基中；
(b)用50μL连续稀释的CD38抗体(0.0002-10μg/mL)预温育细胞15分钟；
(c)用每孔500,000个新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC)在37℃下温育每个孔4小时；
(d)在伽马计数器上测量75μL上清液中51Cr的释放量；
(e)将细胞裂解的百分比计算为(cpm样品-cpm自发裂解)/(cpm最大裂解-cpm自发裂解)，其中cpm是每分钟的计数。
报告物测定法进行的ADCC
(a)在适用于光学读数的多孔板(例如，来自Perkin Elmer Inc.的384孔OptiPlates)中将在10μL中的约5,000个CD38表达细胞(例如Daudi细胞)铺板补充有25％低IgG血清的标准培养基(例如RPMI 1640)中；
(b)用10μL作为效应细胞的工程化Jurkat细胞和10μL连续稀释的CD38抗体(0.0002-10μg/mL)在37℃下温育每个孔6小时，该细胞稳定表达FcγRIIIa受体、V158(高亲和力)变体和驱动萤火虫萤光素酶表达的NFAT反应元件；
(c)用30μL萤光素酶底物在RT下温育每个孔5分钟并测量发光。
如本文所用，术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)意指通过吞噬细胞内化消除抗体包被的靶细胞的机制。内化抗体包被的靶细胞包含在称为吞噬体的囊泡中，然后与一个或多个溶酶体融合形成吞噬溶酶体。用于评估ADCP的合适测定法在本领域中是已知的并且包括例如用巨噬细胞作为效应细胞的体外细胞毒性测定法和如van Bij et al.inJournal of Hepatology Volume 53,Issue 4,October 2010,Pages 677–685所述的视频显微术，以及实施例5中描述的体外细胞毒性测定法。用于确定由CD38抗体介导的表达CD38的细胞的ADCP的测定法的非限制性实例可以包括以下步骤：
(a)在含GM-CSF的培养基中温育5天使新鲜分离的单核细胞分化为巨噬细胞；
(b)在多孔板中将每孔约100,000个巨噬细胞铺板在具有GM-CSF的树突细胞培养基中；
(c)每孔添加20,000个用通用荧光膜染料标记的CD38抗体调理的CD38表达细胞(例如Daudi细胞)，在37℃下持续45分钟；
(d)在流式细胞仪上测量CD14阳性、CD19阴性、膜染料阳性的巨噬细胞的百分比。
如本文所用，“胞啃作用”是指表征为细胞表面分子从供体细胞转移到接受者细胞，诸如效应细胞的过程。典型的接受者细胞包括T细胞和B细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞和NK细胞。胞啃作用介导的细胞表面分子(诸如CD38)从供体细胞到接受者细胞的转移也可能导致抗体-抗原复合物从供体细胞转移到接受者细胞，即在抗体与细胞表面分子结合的地方的抗体-抗原复合物。特别是，当接受者细胞是表达Fc-γ-受体(FcγR)的效应细胞时，可能发生特化形式的胞啃作用；这些接受者细胞可以摄取和内化供体细胞相关的免疫复合物，该复合物由与供体细胞上的靶抗原结合的特异性抗体组成，通常是在FcγR与抗体的Fc区结合之后。用于评估胞啃作用的合适测定法是本领域已知的并且包括例如实施例8中的测定法。用于确定由CD38抗体介导的CD38表达细胞的胞啃作用的测定法的非限制性实例包括以下：
胞啃作用(Daudi细胞)：
(a’)用5天的GM-CSF将新鲜分离的单核细胞分化为巨噬细胞；
(b’)将每孔约100,000个巨噬细胞铺板在具有GM-CSF的树突细胞培养基中；
(c’)每孔添加约20,000个用通用荧光膜染料标记的CD38抗体调理的Daudi细胞，在37℃下持续45分钟；
(d’)在流式细胞仪上测量Daudi细胞上的CD38表达，其中与对照相比，CD38抗体调理的Daudi细胞上的CD38减少，表明胞啃作用。
胞啃作用(Treg)：
(a)将每孔约500,000个新鲜分离的PBMC铺板在细胞培养基中在37℃下O/N；
(b)每孔添加约100,000个用通用荧光细胞内胺染料标记的CD38抗体调理的Treg，在37℃下过夜(O/N)；和
(c)在流式细胞仪上测量Treg上的CD38表达，其中与对照相比，CD38抗体调理的Treg上的CD38减少，表明胞啃作用。
对照可以由技术人员基于所讨论的研究或测定法的特定目的来选择。然而，对照的非限制性实例包括(i)不存在任何抗体和(ii)同种型对照抗体。同种型对照抗体的一个实例是抗体b12，其具有表1中描述的VH和VL序列。在期望评估本文所述抗体的胞啃作用的一些实施方案中，对照可以是(iii)具有不同抗原结合区和/或不同Fc区的参考抗体。
在一些实施方案中，在步骤(b)中，作为荧光细胞内胺染料的另外或替代，用通用荧光膜染料标记Treg。
在一些实施方案中，在上述胞啃作用测定法的步骤(d’)和(c)中，还可以测量供体细胞上CD38抗体的减少。例如，在CD38抗体是人IgG(huIgG)抗体的情况下，可以使用二抗来检测huIgG。
除了Daudi细胞(ATCC CCL-213)，适用于第一种测定法的肿瘤细胞包括但不限于表2中列出的那些，特别是具有高CD38表达的那些。
除了Treg，用于第二种测定法的合适的CD38表达细胞包括免疫细胞诸如，例如NK细胞、B细胞、T细胞和单核细胞，以及表2中列出的肿瘤细胞，特别是具有低CD38表达水平的那些。
如本文所用，术语“载体”意指能诱导连接入载体的核酸片段转录的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其为环形双链DNA环形式。载体的另一种类型是病毒载体，其中核酸片段可以被连接入病毒基因组。某些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(诸如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时被整合入宿主基因组，并由此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体本文中被称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般来说，用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，由于质粒是最常用的载体形式，“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，本发明旨在包括发挥等同功能的表达载体的这样其他形式，诸如病毒载体(诸如复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指已引入一种或多种表达载体的细胞。例如，如本文所述的CD38抗体的HC和LC均可以由相同的表达载体和用该表达载体转染的宿主细胞编码。可替代地，如本文所述的CD38抗体的HC和LC可以由不同的表达载体和用该表达载体共转染的宿主细胞编码。应当理解，术语“宿主细胞”不仅意指特定的受试细胞，也指这种细胞的子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在子代中发生，所以这种子代实际上可能不与亲代细胞相同，但仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如转染瘤，诸如CHO细胞、HEK-293细胞、PER.C6、NS0细胞和淋巴细胞，以及原核细胞诸如大肠杆菌和其他真核宿主诸如植物细胞和真菌。
如本文所用，术语“转染瘤”包括表达Ab或靶抗原的重组真核宿主细胞，诸如CHO细胞、PER.C6、NS0细胞、HEK-293细胞、植物细胞或真菌，包括酵母细胞。
术语“治疗”是指施用有效量的本发明的药物组合物，目的是减轻、改善、阻滞或根除(治愈)症状或疾病状态。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效达到期望治疗结果的量。抗体的治疗有效量可以根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望响应的能力而变化。治疗有效量也是其中药物组合物的治疗有益作用超过任何毒性或不利作用的量。
本发明的具体实施方案
在一个方面，提供了药物组合物，其包含
(a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包括
-抗原结合区，其包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3在所示序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3，和
-Fc区，其包含选自对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的组的一个或多个氨基酸残基中的突变，其中氨基酸残基根据EU索引编号；
(b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
(c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
(d)表面活性剂。
在一个方面，提供了药物组合物，其基本上由以下组成：
(a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包括
-抗原结合区，其包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3在所示序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3，和
-Fc区，其包含选自对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的组的一个或多个氨基酸残基中的突变，其中氨基酸残基根据EU索引编号；
(b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
(c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
(d)表面活性剂。
在一个方面，提供了药物组合物，其由在水溶液中的以下组成：
(a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包括
-抗原结合区，其包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3在所示序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3，和
-Fc区，其包含选自对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的组的一个或多个氨基酸残基中的突变，其中氨基酸残基根据EU索引编号；
(b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
(c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
(d)表面活性剂。
在一个方面，提供了药物组合物，其包含
a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包括
-重链，其包括包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有如SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3的VH区和在E430、E345和S440中的一个或多个中具有突变的人IgG1 CH区，氨基酸残基根据EU索引编号，和
-轻链，其包括包含具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VLCDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3的VL区；
b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
d)表面活性剂。
在一个方面，提供了药物组合物，其基本上由以下组成：
a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包括
-重链，其包括包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有如SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3的VH区和在E430、E345和S440中的一个或多个中具有突变的人IgG1 CH区，氨基酸残基根据EU索引编号，和
-轻链，其包括包含具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VLCDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3的VL区；
b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
d)表面活性剂。
在一个方面，提供了药物组合物，其由在水溶液中的以下组成：
a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包括
-重链，其包括包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有如SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3的VH区和在E430、E345和S440中的一个或多个中具有突变的人IgG1 CH区，氨基酸残基根据EU索引编号，和
-轻链，其包括包含具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VLCDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3的VL区；
b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
d)表面活性剂。
在本发明的药物组合物的一些实施方案中，a)可以为1至80mg/mL、诸如1至60mg/ml、1至40mg/mL、1至30mg/ml或1至25mg/ml；2至80mg/mL、诸如2至40mg/mL或2至30mg/ml；或10至80mg/mL、诸如10至40mg/mL或10至30mg/ml；或15至80mg/ml、诸如15至40mg/ml、诸如15至25mg/ml、诸如2mg/ml、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、22mg/mL、24mg/mL、26mg/mL、28mg/mL、30mg/mL、32mg/mL、34mg/mL、36mg/mL、38mg/mL、40mg/mL或50mg/mL的抗体。在一个实施方案中，a)是约20mg/mL的抗体。在特别考虑的实施方案中，a)是20mg/mL的抗体。
在本发明的药物组合物的一些实施方案中，b)可以为5至30mM，诸如5至25mM，诸如10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM或30mM的组氨酸或乙酸盐。在一个实施方案中，b)是约20mM，诸如20mM的组氨酸或乙酸盐。在一个具体实施方案中，b)是乙酸盐。在特别考虑的实施方案中，b)是组氨酸。
在本发明的药物组合物的一些实施方案中，c)可以为100至350mM，诸如100至300mM、100至260mM、100至200mM、150至350mM、200至300mM、200至260mM、200至350mM、200至300mM、200至260mM、230至350mM、230至300mM、230至260mM或240至260mM；诸如245mM、246mM、247mM、248mM、249mM、250mM、251mM、252mM、253mM、254mM或255mM的山梨糖醇或蔗糖。在一个实施方案中，c)是约250mM，诸如250mM的山梨糖醇或蔗糖。在一个实施方案中，c)是蔗糖。在特别考虑的实施方案中，c)是山梨糖醇。
药物组合物可以例如，具有5.0至6.5，诸如5.5至6.5，诸如5.6至6.5、5.7至6.5、5.8至6.5、5.9至6.5、6.0至6.5、5.5至6.4、5.5至6.3、5.5至6.2、5.5至6.1、5.5至6.0、5.7至6.3、5.8至6.2、5.9至6.1的pH。在一个实施方案中，pH为约6。在一种实施方式中，pH为6，诸如6.0。
适用于药物组合物的表面活性剂是本领域已知的并且可以例如选自下组：甘油单油酸酯、苄索氯铵、多库酯钠(sodium docusate)、磷脂、聚乙烯烷基醚(polyethylenealkyl ethers)、月桂基硫酸钠(sodium lauryl sulfate)和三辛精(tricaprylin)、苯扎氯铵、溴棕三甲胺(citrimide)、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)和磷脂、α生育酚、甘油单油酸酯、肉豆蔻醇、磷脂、泊洛沙姆(poloxamers)、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbintan fatty acidesters)、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙二醇羟基硬脂酸酯(polyoxyl hydroxystearate)、聚乙二醇甘油酯(polyoxylglycerides)、聚山梨酯(polysorbates)、丙二醇二月桂酸酯(propylene glycol dilaurate)、丙二醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇酯蔗糖棕榈酸酯(sorbitan esters sucrose palmitate)、蔗糖硬脂酸酯、三辛精和TPGS。在一个特定的实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯。优选地，表面活性剂是聚山梨酯20或80。在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯20(PS20)。在特别考虑的实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80(PS80)。
表面活性剂的浓度通常为约0.005％至0.5％w/v，诸如约0.01至0.1％w/v，诸如约0.01至0.09％w/v，诸如约0.01至0.06％w/v，诸如约0.01至0.05％w/v，诸如0.02％w/v或0.03％w/v或0.04％w/v或0.05％w/v，或0.06％w/v。在一个实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.04％w/v，诸如0.04％w/v。
在一个实施方案中，药物组合物具有5.9至6.1，诸如约6或6.0的pH，并且包含或基本上由以下组成：
a)1至80mg/mL抗体
b)15至40mM组氨酸
c)200至300mM山梨糖醇
d)0.01％至0.1％w/v的表面活性剂。
在一个实施方案中，药物组合物具有5.9至6.1，诸如约6或6.0的pH，并且包含或基本上由以下组成：
a)10至40mg/mL抗体
b)15至40mM组氨酸
c)200至300mM山梨糖醇
d)0.02％至0.06％w/v的表面活性剂。
在一个实施方案中，该药物组合物具有5.9至6.1，诸如约6或6.0的pH，并且包含或基本上由以下组成：
a)10至40mg/mL抗体
b)15至25mM组氨酸
c)240至260mM山梨糖醇
d)0.02％至0.06％w/v的表面活性剂。
在特定的实施方案中，d)中的表面活性剂是聚山梨酯，诸如聚山梨酯20或聚山梨酯80。在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯20。在一个特别考虑的实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。
根据本发明的药物组合物可以在延长的时间段是稳定的，诸如至少8周的时段，诸如1-60个月、1-48个月、1-36个月、1-30个月、1-24个月、1-18个月、1-12个月或1-6个月的时段；诸如2-60个月、2-48个月、2-36个月、2-30个月、2-24个月、2-18个月、2-12个月或2-6个月；诸如3-60个月、3-48个月、3-36个月、3-30个月、3-24个月、3-18个月、3-12个月或3-6个月，诸如48个月、36个月、30个月、24个月、18个月、12个月或6个月。优选地，当组合物保持在5℃±3℃、25℃±5℃或40℃±10℃，诸如在5℃±3℃、约25℃±5℃或约40℃，诸如在5℃±3℃时，药物组合物在此类延长的时间段是稳定的。
通常也在组合物保持在5℃±3℃、25℃±5℃或40℃±10℃，诸如在5℃±3℃、约25℃±5℃或约40℃，诸如在5℃±3℃时测定药物组合物的稳定性。然而，当贮存在25℃/60％相对湿度(RH)下和/或当贮存在40℃/75％RH下时，也可以或可替代地测定药物组合物的稳定性。
用于测定包含抗体的药物组合物的稳定性的方法是本领域众所周知的，通常测定一个或多个稳定性参数从初始时间点到一个或多个后来的预定时间点的变化。然而，优选地，通过以下一项或多项来评估稳定性：
(a)亚可见颗粒计数；
(b)pH；
(c)蛋白质浓度；
(d)尺寸排阻色谱法；
(e)等电聚焦；
(f)还原条件下的电泳；
(g)非还原条件下的电泳；和/或
(h)目视检查。
例如，可以通过测定以下来评估稳定性：
(a)使用微流成像(MFI)显微镜进行亚可见颗粒计数，任选地如实施例12中提供的；
(b)pH，任选地如实施例11中提供的；
(c)使用280nm处吸光度(A280)的蛋白质浓度，任选地如实施例11中提供的；
(d)使用尺寸排阻色谱法的与组合物中存在的抗体单体、高分子量(HMW)种类和低分子量(LMW)种类的总和相比的抗体单体的相对量，任选地如实施例11中提供的；
(e)通过成像毛细管等电聚焦(icIEF)的与抗体、抗体的酸性变体和抗体的碱性变体的总和相比的抗体的相对量，任选地如实施例11中提供的；
(f)通过还原毛细管电泳的与轻链、重链和非糖基化重链的总和相比的轻链和重链的总和的相对量，任选地如实施例11中提供的；
(g)通过非还原毛细管电泳的与抗体、分子量低于抗体峰的峰和分子量高于抗体峰的峰的总和相比的抗体峰的相对量，任选地如实施例11中提供的；和/或
(h)视觉外观，任选地如实施例11中提供的。
一个特定的实例是具有约6的pH并且包含或基本上由以下组成的药物组合物：
a)约20mg/mL的抗体，
b)约20mM组氨酸，
c)约250mM山梨糖醇，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯80。
另一个特定实例是具有6的pH并且包含、由或基本上由在水溶液中的以下组成的药物组合物：
a)20mg/mL的抗体，
b)20mM组氨酸，
c)250mM山梨糖醇，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯80。
另一个特定实例是具有约6的pH并且包含或基本上由以下组成的药物组合物：
a)约20mg/mL的抗体，
b)约20mM组氨酸，
c)约250mM山梨糖醇，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯20。
另一个特定实例是具有6的pH并且包含、由或基本上由在水溶液中的以下组成的药物组合物：
a)20mg/mL的抗体，
b)20mM组氨酸，
c)250mM山梨糖醇，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯20。
另一个特定实例是具有约6的pH并且包含或基本上由以下组成的药物组合物：
a)约20mg/mL的抗体，
b)约20mM组氨酸，
c)约250mM蔗糖，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯80。
另一个特定实例是具有6的pH并且包含、由或基本上由在水溶液中的以下组成的药物组合物：
a)20mg/mL的抗体，
b)20mM组氨酸，
c)250mM蔗糖，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯80。
另一个特定实例是具有约5.5的pH并且包含或基本上由以下组成的药物组合物：
a)约20mg/mL的抗体，
b)约20mM乙酸盐，
c)约250mM山梨糖醇，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯80。
另一个特定实例是具有约5.5的pH并且包含、由或基本上由在水溶液中的以下组成的药物组合物：
a)20mg/mL的抗体，
b)20mM乙酸盐，
c)250mM山梨糖醇，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯80。
另一个特定实例是具有约6的pH并且包含或基本上由以下组成的药物组合物：
a)约20mg/mL的抗体，
b)约20mM组氨酸，
c)约250mM蔗糖，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯20。
另一个特定实例是具有6的pH并且包含、由或基本上由在水溶液中的以下组成的药物组合物：
a)20mg/mL的抗体，
b)20mM组氨酸，
c)250mM蔗糖，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯20。
另一个特定实例是具有约5.5的pH并且包含或基本上由以下组成的药物组合物：
a)约20mg/mL的抗体，
b)约20mM乙酸盐，
c)约250mM山梨糖醇，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯20。
另一个特定实例是具有5.5的pH并且包含、由或基本上由在水溶液中的以下组成的药物组合物：
a)20mg/mL的抗体，
b)20mM乙酸盐，
c)250mM山梨糖醇，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯20。
另一个特定实例是具有约5.5的pH并且包含或基本上由以下组成的药物组合物：
a)约20mg/mL的抗体，
b)约20mM乙酸盐，
c)约250mM蔗糖，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯80。
另一个特定实例是具有5.5的pH并且包含在水溶液中的以下各项、由或基本上由在水溶液中的以下组成的药物组合物：
a)20mg/mL的抗体，
b)20mM乙酸盐，
c)250mM蔗糖，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯80。
另一个特定实例是具有约5.5的pH并且包含以下各项或基本上由以下组成的药物组合物：
a)约20mg/mL的抗体，
b)约20mM乙酸盐，
c)约250mM蔗糖，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯20。
另一个特定实例是具有5.5的pH并且包含以下各项、由或基本上由在水溶液中的以下组成的药物组合物：
a)20mg/mL的抗体，
b)20mM乙酸盐，
c)250mM蔗糖，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯20。
本发明还提供了药物组合物，其具有约6的pH并且包含以下各项或基本上由以下组成：
a)约20mg/mL的与人CD38结合的抗体，
b)约20mM组氨酸，
c)约250mM山梨糖醇，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯80，
其中所述抗体是全长二价抗体，其包含两条重链和两条轻链、由或基本上由两条重链和两条轻链组成，其中
-每条重链包含VH区和CH区，其中VH区包含SEQ ID NO:1并且CH区包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:46，并且
-每条轻链包含VL区和CL区，其中VL区包含SEQ ID NO:5并且CL区包含SEQ ID NO:37。
在一个实施方案中，药物组合物具有约6的pH并且包含在水溶液中的以下各项、由或基本上由在水溶液中的以下组成：
a)20mg/mL的抗体，
b)20mM组氨酸，
c)250mM山梨糖醇，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯80。
药物组合物可以通过任何合适的途径和方式施用于受试者或患者。在一个实施方案中，本发明的药物组合物是胃肠外施用的。如本文所用，“胃肠外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、哦皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸腔内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一个实施方案中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注施用。在特定的实施方案中，药物组合物通过静脉内注射或输注施用。
在一些实施方案中，通常在施用于受试者或患者之前或与其相关时，根据本发明的药物组合物是待稀释的浓缩物。合适的稀释剂是本领域已知的。优选的稀释剂包括但不限于盐水(0.9％NaCl)和在水溶液中的右旋糖(例如，5％w/v)。
本发明还涉及用于在治疗中同时、单独或顺次使用的试剂盒(kit-of-part)，其包含根据本发明的药物组合物，任选地其中试剂盒包含多于一个剂量的药物组合物。
在一个实施方案中，试剂盒包含在一个或多个容器，优选小瓶中的根据本发明的药物组合物。
在一个实施方案中，试剂盒包含多于一种根据本发明的药物组合物，其用于在治疗中同时、单独或顺次使用。
根据本文任何方面或实施方案的药物组合物可以包含进一步以其他或附加特征表征的CD38抗体，如下所述。
CD38抗体
抗原结合区和可变区
抗原结合区包含允许与CD38特异性结合的一个或多个抗体可变域，诸如VH区和VL区。类似地，重链和轻链分别包含VH和VL区。在下文中，提及抗原结合区中的序列可以类似地适用于根据本发明的抗体的重链和/或轻链的序列。
有利地，CDR、VH区和/或VL区与抗体C的那些相似或相同，如表1中所示。优选地，抗原结合区和/或重链和/或轻链包含抗体C的CDR，如SEQ ID NO:2(VH-3003-C_CDR1)、SEQ IDNO:3(VH-3003-C_CDR2)、SEQ ID NO:4(VH-3003-C_CDR3)、SEQ ID NO:6(VL-3003-C_CDR1)、AAS(VL-3003-C_CDR2)和SEQ ID NO:7(VL-3003-C_CDR3)中所示。
因此，在一些实施方案中，抗体包含抗原结合区，该抗原结合区包含包含具有SEQID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3在所示序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，抗体包括包含VH区的重链，该VH区包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有如SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3，以及包含VL区的轻链，该VL区包含具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3。
在优选的实施方案中，抗体包含抗体C的VH和VL区氨基酸序列，即，VH区包含SEQID NO:1的序列(VH-3003-C)并且VL区包含SEQ ID NO:5的序列(VL-3003-C)。
然而，本领域众所周知的是，可以在抗体的VH和VL中进行突变以例如增加抗体对其靶抗原的亲和力、降低其潜在免疫原性和/或增加由宿主细胞表达的抗体的产量。因此，在一些实施方案中，还考虑了包含抗体C的CDR、VH和/或VL序列中的突变的抗体。特别地，与抗体C的VH和/或VL序列相比，这样的抗体可能在一个或多个氨基酸，例如在一个或多个CDR上不同，但其抗原结合区优选保留抗体C的亲和力和/或特异性的至少相当大部分(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)。通常，此类抗体的VH和/或VL序列保留与抗体C的VH和/或VL序列的显著序列同一性。例如，抗体的VH和/或VL区序列可以与相应的抗体C的VH和/或VL区序列相差12个或更少，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，诸如氨基酸残基的取代、***或缺失。在一些实施方案中，此类抗体的VH和/或VL和/或CDR区序列与相应的抗体C的VH和/或VL和/或CDR区序列的不同主要在于保守氨基酸取代；例如，变体中的12个，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代可以是保守的。在一些情况下，包含抗体C的VH和/或VL中的突变的抗体可能与抗体C相比具有更高的亲和力和/或特异性。为了本发明的目的，特别优选包含抗体C的VH和/或VL区中的突变的抗体，其与抗体C相比允许抗体保留或改善在其与CD38结合中的亲和力和特异性。
例如，WO 2011/154453 A1公开了在CDR、VH和VL区氨基酸序列中包含合适突变的CD38抗体，其中在某些位置的氨基酸残基不同于如表1所示的抗体C的CDR、VH和VL中的残基。因此，这些位置代表候选位置，其中可以在CDR、VH和VL序列中进行突变，同时保留或改善抗体在与CD38结合中的亲和力和特异性。特别地，抗体C的VH和VL中可以突变的VH和VLCDR中的位置在SEQ ID NO:40至43中指示。
因此，在一些实施方案中，在如SEQ ID NO:40至43中所示的CDR中进行一种或多种特异性突变，即，VH和/或VL区包含如SEQ ID NO:40(VH CDR1)、SEQ ID NO:41(VH CDR2)、SEQ ID NO:42(VH CDR3)和SEQ ID NO:44(VL CDR3)的一种或多种中所示的CDR中的突变。这种抗体的VH和VL区可以任选地维持抗体C的原始框架区。在一个具体实施方案中，抗原结合区包含如以下中所示的CDR：SEQ ID NO:40其中X1是S(VH CDR1)，SEQ ID NO:41其中X1是R、X2是K、X3是A(VH CDR2)，SEQ ID NO:42其中X1是A、X2是D和X3是V(VH CDR3)，SEQ ID NO:43(VL CDR1)，AAS(VL CDR2)和SEQ ID NO:44其中X1是S(VL CDR3)。在一个具体实施方案中，抗原结合区包含如以下中所示的CDR：SEQ ID NO:40其中X1是R(VH CDR1)，SEQ ID NO:41其中X1是V、X2是K、X3是T(VH CDR2)，SEQ ID NO:42其中X1是T、X2是A和X3是F(VH CDR3)，SEQ IDNO:43(VL CDR1)，AAS(VL CDR2)和SEQ ID NO:44其中X1是N(VL CDR3)。在一个具体实施方案中，抗原结合区包含如以下中所示的CDR：SEQ ID NO:40其中X1是S(VH CDR1)，SEQ IDNO:41其中X1是R、X2是K、X3是T(VH CDR2)，SEQ ID NO:42其中X1是A、X2是D和X3是V(VHCDR3)，SEQ ID NO:43(VL CDR1)，AAS(VL CDR2)和SEQ ID NO:44其中X1是S(VL CDR3)。在一个具体实施方案中，抗原结合区包含如以下中所示的CDR：SEQ ID NO:40其中X1是R(VHCDR1)，SEQ ID NO:41其中X1是V、X2是K、X3是V(VH CDR2)，SEQ ID NO:42其中X1是T、X2是A和X3是F(VH CDR3)，SEQ ID NO:43(VL CDR1)，AAS(VL CDR2)和SEQ ID NO:44其中X1是N(VLCDR3)。
氨基酸取代可以例如是如本文别处所述的保守氨基酸取代。
对于其中VH和/或VL区序列与抗体C的那些不同的实施方案，特别考虑的是其中VH和/或VL区氨基酸序列与抗体C的氨基酸序列仅在一个或多个框架区(FR)氨基酸序列上不同的抗体。在此类实施方案中，抗体保留SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4中所示的VH CDR序列和SEQ ID NO:6、AAS和SEQ ID NO:7中所示的VL CDR序列。
因此，在一些实施方案中，抗原结合区可以包含VH区，其包含具有如SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有如SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有如SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3，以及VL区，其包含具有如SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有如SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3，其中VH区与SEQ ID NO:1具有至少80％的同一性，VL区与SEQ ID NO:5具有至少80％的同一性。
在一个具体实施方案中，该抗体包括
-VH区，其包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，诸如90％、或95％、或97％、或98％、或99％的氨基酸序列；和/或
-VL区，其包含SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性，诸如90％、或95％、或97％、或98％、或99％的氨基酸序列。在另一个具体实施方案中，在抗体中，
-VH与SEQ ID NO:1相差12个或更少，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，诸如氨基酸残基的取代、***或缺失；和/或
-VL与SEQ ID NO:5相差12个或更少，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，诸如氨基酸残基的取代、***或缺失。
在一个具体实施方案中，该抗体包括
-重链，其包括包含SEQ ID NO:1的VH区和在E430、E345和S440中的一个或多个中具有突变的人IgG1 CH区，其中氨基酸残基编号是根据EU索引，和
-轻链，其包括包含SEQ ID NO:5的VL。
在另一个具体实施方案中，该抗体是全长二价抗体，其包含、由或基本上由两条重链和两条轻链组成，其中
-每条重链包含VH区和CH区，其中VH区包含SEQ ID NO:1并且CH区包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:46，和
-每条轻链包含VL区和CL区，其中VL区包含SEQ ID NO:5并且CL区包含SEQ ID NO:37。
Fc区和CH区
在对应于人IgG1重链中E430、E345和S440的位置处的氨基酸残基中的突变，其中氨基酸残基根据EU索引编号，可以提高抗体诱导CDC的能力(参见例如实施例3)。不受理论的束缚，人们认为通过在这些位置取代一个或多个氨基酸，可以刺激抗体的寡聚化，从而调节效应物功能，从而例如增加Clq结合、补体激活、CDC、ADCP、内化或其他可能提供体内功效的相关功能。
本发明的药物组合物包括包含Fc区或人IgG1 CH区的抗体，所述Fc区或人IgG1 CH区包含在E430、E345和S440中的一个或多个中的突变，其中氨基酸残基根据EU索引编号。在下文中，提及Fc区中的突变可能同样适用于人IgG1 CH区中的突变，反之亦然。
如本文所述，当根据EU索引编号时，在Fc或人IgG1 CH区中待突变氨基酸的位置可以相对于(即，“对应于”)其在天然存在的(野生型)人IgG1重链中的位置给出。因此，如果Fc区已经包含一个或多个突变和/或如果Fc区是例如IgG2、IgG3或IgG4 Fc区，则对应于氨基酸残基诸如，例如根据EU索引编号的人IgG1重链中的E430的氨基酸的位置可以通过比对确定。具体地，将Fc区与野生型人IgG1重链序列进行比对，从而鉴定对应于人IgG1重链序列中的E430的位置中的残基。任何野生型人IgG1恒定区氨基酸序列均可用于此目的，包括表1中所列的不同的人IgG1同种异型中的任一种。这在图1中例示，其显示了两种不同的人IgG1同种异型-IgG1m(f)和IgG1m(a)-和野生型人IgG2、IgG3和IgG4，特别是对应于人IgG1重链中残基P247至K447的区段之间的比对，其中氨基酸残基根据EU编号指数。
因此，在本节的其余段落和本文其他地方，除非另有说明或与上下文相矛盾，所指的氨基酸位置是对应于野生型人IgG1重链中的氨基酸残基的位置，其中氨基酸残基根据EU索引编号。
在单独和具体的实施方案中，Fc区和/或人IgG1 CH区包含仅在E430、E345和S440之一中；在E430和E345两者中；在E430和S440两者中；在E345和S440两者中；或在E430、E345和S440的所有中的突变。在一些实施方案中，Fc区和/或人IgG1 CH区包含仅在E430、E345和S440之一中；在E430和E345两者中；在E430和S440两者中；在E345和S440两者中；或在E430、E345和S440的所有中的突变，条件是S440中的任何突变是S440W或S440Y。在其他单独和具体的实施方案中，突变是氨基酸取代。在一个实施方案中，突变是仅在E430X、E345X和S440X之一中；在E430X和E345X两者中；在E430X和S440X两者中；在E345X和S440X两者中；或在E430X、E345X和S440X中的所有中的氨基酸取代，优选条件是S440X中的任何突变是S440Y或S440W。更优选地，E430X、E345X和S440X突变分别选自E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440Y和S440W。
在一些实施方案中，在抗体中，一个或多个氨基酸残基中的突变选自由E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440Y和S440W组成的组。
在一个实施方案中，在抗体中，一个或多个氨基酸残基中的突变选自对应于E430G、E345K、E430S和E345Q的组。
在一个实施方案中，突变在对应于E430的氨基酸残基中，诸如氨基酸取代E430X，例如选自对应于E430G、E430S、E430F或E430T的那些。在一个优选的实施方案中，一个或多个氨基酸残基中的突变包括E430G。在另一个优选的实施方案中，一个或多个氨基酸残基中的突变包括E430S，任选地其中在对应于E345和S440的氨基酸残基中没有进行突变。在特定的实施方案中，一个或多个氨基酸残基中的突变包括E430G或由E430G组成。在特定优选的实施方案中，一个或多个氨基酸残基中的突变由E430G组成，即在对应于E345和S440的氨基酸残基中没有进行突变。
在一个实施方案中，突变在对应于E345的氨基酸残基中，诸如氨基酸取代E345X，例如，选自对应于E345K、E345Q、E345R和E345Y的那些。在一个优选的实施方案中，一个或多个氨基酸残基中的突变包括E345K。在另一个优选的实施方案中，一个或多个氨基酸残基中的突变包括E345Q，任选地其中在对应于E430和S440的氨基酸残基中没有进行突变。在特定优选的实施方案中，一个或多个氨基酸残基中的突变由E345K组成，即在对应于E430和S440的氨基酸残基中没有进行突变。
在一个实施方案中，突变在对应于S440的氨基酸残基中，诸如氨基酸取代S440X，通常选自对应于S440Y和S440W的那些。在一个优选的实施方案中，一个或多个氨基酸残基中的突变包括S440W，任选其中在对应于E430和E345的氨基酸残基中没有进行突变。在一个优选的实施方案中，一个或多个氨基酸残基中的突变包括S440Y，任选地其中在对应于E430和E345的氨基酸残基中没有进行突变。
优选地，当根据EU索引编号时，包含对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区，除了任何指定的突变外，是选自由人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 Fc区组成的组的人IgG Fc区域。优选地，除了任何指定的突变外，Fc区是天然存在的(野生型)人IgG Fc区，诸如人野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区，或其混合同种型。在一个实施方案中，Fc区和/或人IgG1 CH区，除了任何指定的突变外，是野生型人IgG1同种型。
因此，包含对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区或CH区，除了任何指定的突变外，可以是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，或其混合同种型。在一个实施方案中，除了任何指定的突变外，Fc区或CH区是人IgG1 Fc区。
在具体的实施方案中，包含对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区和/或人IgG1 CH区，除了任何指定的突变外，是人野生型IgG1m(f)、IgG1m(z)、IgG1m(a)或IgG1m(x)同种型。在具体的实施方案中，除了任何指定的突变外，Fc区和/或人IgG1 CH区是混合同种异型的人野生型IgG1，诸如IgG1m(za)、IgG1m(zax)、IgG1m(fa)或类似。在具体的实施方案中，除了任何指定的突变外，Fc区和/或人IgG1CH区是人野生型IgG1m(za)同种型。
因此，包含对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区和/或人IgG1 CH区，除了任何指定的突变外，可以是人IgG1m(f)、IgG1m(a)、IgG1m(x)、IgG1m(z)同种异型或其任何两种或更多种的混合同种异型。
野生型人IgG同种型和IgG1同种异型的具体实例的CH区氨基酸序列列于表1。在一些实施方案中，包含对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区，除了任何指定的突变外，包括CH2-CH3，或任选地，此类野生型CH区氨基酸序列的铰链-CH2-CH3区段。
因此，在具体的实施方案中，包含对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区，除了任何指定的突变外，是人野生型IgG1同种型，其包含对应于根据EU编号的人IgG1重链中的231-447的氨基酸残基。例如，除了任何指定的突变外，Fc区可以包含选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQID NO:23组成的组。在具体的实施方案中，除了任何指定的突变外，Fc区是人野生型IgG1同种型，其包含对应于根据EU编号的人IgG1重链中的216-447的氨基酸残基。例如，除了任何指定的突变外，Fc区可以包含选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:23组成的组。如用于产生治疗性抗体的本文其他地方所述，C端氨基酸K447有时可以被删除(即，不存在)或除去。因此，除了任何指定的突变外，Fc区可以包含SEQID NO:45的氨基酸残基114至329(直接编号)或氨基酸残基99至329(直接编号)。
在具体的实施方案中，包含对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区，除了任何指定的突变外，是人野生型IgG1同种型，其包含对应于根据EU编号的人IgG1重链中的231-447或231-446的氨基酸残基。例如，Fc区可以包含选自由SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33组成的组的序列的氨基酸残基114至330(直接编号)。在另一个实施方案中，Fc区可以包含选自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:46组成的组的序列的氨基酸残基114至329(直接编号)。在又一个实施方案中，Fc区可以包含SEQ ID NO:46的氨基酸残基114至329(直接编号)。
在具体的实施方案中，包含对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区，除了任何指定的突变外，是人野生型IgG1同种型，其包含对应于根据EU编号的人IgG1重链中的216-447或216-446的氨基酸残基。例如，Fc区可以包含选自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33组成的组的序列的氨基酸残基99至330(直接编号)。在另一个实施方案中，Fc区可以包含选自由SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:46组成的组的序列的氨基酸残基99至329(直接编号)。在又一个实施方案中，Fc区可以包含SEQ ID NO:46的氨基酸残基99至329(直接编号)。
因此，本发明可以应用于具有人IgG1重链，诸如包括包含SEQ ID NO:19(IgGm(za))的人IgG1 CH区氨基酸序列的人IgG1重链的抗体分子。因此，除了任何指定的突变外，人IgG1 CH区可以包含SEQ ID NO:19的序列。
本发明还可以应用于具有人IgG1重链，诸如包括包含SEQ ID NO:20(IgGm(f))或SEQ ID NO:45的人IgG1 CH区氨基酸序列的人IgG1重链的抗体分子。因此，除了任何指定的突变外，人IgG1 CH区可以包含SEQ ID NO:20的序列。在另一个实施方案中，除了任何指定的突变外，人IgG1 CH区可以包含SEQ ID NO:45的序列。
本发明还可以应用于具有人IgG1重链，诸如包括包含SEQ ID NO:21(IgGm(z))的人IgG1 CH区氨基酸序列的人IgG1重链的抗体分子。因此，除了任何指定的突变外，人IgG1CH区可以包含SEQ ID NO:21的序列。
本发明还可以应用于具有人IgG1重链，诸如包括包含SEQ ID NO:22(IgGm(a))的人IgG1 CH区氨基酸序列的人IgG1重链的抗体分子。因此，除了任何指定的突变外，人IgG1CH区可以包含SEQ ID NO:22的序列。
本发明还可以应用于具有人IgG1重链，诸如包括包含SEQ ID NO:23(IgG1m(x))的人IgG1 CH区氨基酸序列的人IgG1重链的抗体分子。因此，除了任何指定的突变外，人IgG1CH区可以包含SEQ ID NO:23的序列。
在一个实施方案中，除了任何指定的突变外，人IgG1 CH区包含SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:45的序列。
在其他单独和具体的实施方案中，人IgG1 CH区包含选自由SEQ ID NO:24至SEQID NO:33和SEQ ID NO:46组成的组的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，人IgG1 CH区包含SEQ ID NO:24(IgG1m(f)-E430G)或SEQID NO:46(IgG1m(f)-E430G，没有K447)，任选地其中轻链包括包含SEQ ID NO:37的CL。
在具体的实施方案中，抗体是单特异性抗体，其包含氨基酸序列相同的两个HC和氨基酸序列相同的两个LC。
然而，对于本文公开的抗体，也考虑了，当根据EU索引编号时，包含一个或多个进一步突变，即在不同于对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的氨基酸残基的一个或多个其他氨基酸残基中的突变的Fc区或人IgG1CH区。因此，在一个实施方案中，包含对应于E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区或CH区还包含在不同于对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的氨基酸残基的氨基酸残基中的一个或多个进一步突变，其中氨基酸残基根据EU索引编号。此外或替代地，Fc区可以是混合同种型，例如，其中不同的CH区衍生自不同的IgG同种型。因此，如下文更详细描述的，除了对应于E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变外，与野生型(天然存在的)或混合同种型人IgG Fc区相比，Fc区可以包含一个或多个进一步的突变。
在一个实施方案中，包含对应于E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区是与野生型人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 Fc区相比包含一个或多个进一步突变的人IgG Fc区，例如，如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36之一中所示。以替代的方式表达，包含对应于E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变的Fc区也可以与野生型人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 Fc区在一个或多个进一步突变中不同，例如，如SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36之一中所示。例如，除了选自对应于E430、E345和S440的组中的一个或多个氨基酸残基中的突变之外，Fc区可以与野生型Fc区相差12个或更少，例如11、10个，9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，例如氨基酸残基的取代、***或缺失。
例如，447位(Eu编号)的C端氨基酸Lys(K)可能不存在。用于产生抗体的一些宿主细胞可能含有能够除去447位Lys的酶，并且这种除去可能不是同质的。因此，可以在没有C端Lys(K)的情况下生产治疗性抗体，以提高产物的同质性。生产不含C端Lys(K)的抗体的方法是本领域技术人员熟知的并且包括表达所述抗体的核酸的基因工程、酶方法和特定宿主细胞的使用。因此，例如，除了对应于E430、E345和S440的一个或多个氨基酸残基中的突变之外，Fc区可以包含如SEQ ID NO:45中所示的序列，使得抗体由编码缺少K447残基的重链的重组核酸表达。
优选地，任何此类一个或多个进一步突变不降低本文所公开的抗体诱导CDC和/或ADCC的能力，即抗体包含选自对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的组的一个或多个氨基酸残基中的突变。更优选地，任何此类一个或多个进一步的突变不降低抗体诱导CDC的能力。即，与没有一个或多个进一步突变的抗体相比，包括包含一个或多个进一步突变的Fc区的抗体不具有降低的CDC和/或ADCC。最优选地，任何此类一个或多个进一步突变不降低抗体诱导CDC和ADCC之一的能力。一个或多个进一步突变的候选物可以例如在，例如，如本文所公开的，诸如在实施例3和4中的CDC或ADCC测定法中进行测试。例如，如本文所述的抗体(例如IgG1-C-E430G)的CDC可以在有和没有一个或多个进一步突变的特定候选物的情况下，在实施例3的测定法或下一节所述的测定法(或类似测定法)中进行测试，以确定候选进一步突变对抗体诱导CDC能力的影响。同样，如本文所述的抗体(例如IgG1-C-E430G)的ADCC可以在有和没有进一步突变的特定候选物的情况下，在实施例4的测定法或下一节所述的测定法(或类似测定法)中进行测试，以确定候选进一步突变对抗体诱导ADCC能力的影响。
优选地，在包含两个HC和两个LC的抗体中，第一和第二HC中的Fc区在氨基酸序列上是相同的，因此二聚体形式的Fc区是同二聚体。
然而，在一些实施方案中，在包含两个HC和两个LC的抗体中，第一HC中的Fc区可以在一个或多个氨基酸上不同于第二个HC中的Fc区，使得二聚体形式的Fc区是异二聚体。例如，选自对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的组的一个或多个氨基酸残基的突变，其中氨基酸残基根据EU索引编号，可以仅存在于Fc区之一中。因此，在一些实施方案中，一个Fc区可以是SEQ ID NO:45或选自SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的人野生型IgG Fc区，而其他Fc区可以相同，除了选自对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的组的所述一个或多个氨基酸残基中的突变之外。
在一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体，除了任何指定的突变外，是人抗体。
在一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体，除了任何指定的突变外，是全长抗体，诸如人全长抗体。
在一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体，除了任何指定的突变外，是二价抗体，诸如人二价抗体，诸如人二价全长抗体。
在一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体，除了任何指定的突变外，是单克隆抗体，诸如人单克隆抗体，诸如人二价单克隆抗体，诸如人二价全长单克隆抗体。
在优选的实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体，除了任何指定的突变外，是IgG1抗体，诸如全长IgG1抗体，诸如人全长IgG1抗体，任选地人单克隆全长二价IgG1,κ抗体，例如人单克隆全长二价IgG1m(f),κ抗体。
根据本发明的抗体有利地是二价单特异性形式，包括与相同表位结合的两个抗原结合区。然而，也考虑了其中抗原结合区之一与不同表位结合的双特异性形式。因此，除非与上下文相矛盾，根据本文任何方面或实施方案的抗体可以是单特异性抗体或双特异性抗体。
在一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体是单特异性抗体，诸如人单特异性抗体，诸如人全长单特异性抗体，诸如人全长单特异性二价单克隆抗体。任选地，除了任何指定的突变外，抗体可以是人全长单特异性二价IgG1,κ单克隆抗体，例如人全长单特异性二价IgG1m(f),κ单克隆抗体。
在另一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体是多特异性抗体，诸如全长双特异性二价抗体，诸如人全长双特异性二价抗体，例如人全长双特异性二价抗体单克隆抗体。任选地，除了任何指定的突变外，抗体可以是人全长双特异性二价IgG1,κ单克隆抗体，例如人全长双特异性二价IgG1m(f),κ单克隆抗体。
在特定的实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的药物组合物包含抗体，该抗体包含、由或基本上由两个相同的重链(HC)氨基酸序列和两个相同的轻链(LC)氨基酸序列组成，其中每个HC氨基酸序列包括包含SEQ ID NO:1的VH区和包含SEQ ID NO:46的CH区，并且其中每个LC氨基酸序列包括包含SEQ ID NO:5的VL区和包含SEQ ID NO:37的CL区。
功能调节
根据本文任何方面或实施方案的抗体可以与人CD38结合并且通常诱导表达人CD38的靶细胞的CDC、ADCC、ADCP、在存在而不是不存在Fc交联剂的情况下的凋亡、胞啃作用或其任何组合的一种或多种，优选所有，这通常在补体和效应细胞存在的情况下。根据本文任何方面或实施方案的抗体通常还可以调节CD38的酶活性。
因此，在一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体可以诱导CD38的CDC、ADCC、ADCP、在存在而不是不存在Fc交联剂的情况下的凋亡、胞啃作用和调节酶活性中的一种或多种，或其任何组合。
在一个实施方案中，抗体能够结合带His标签的人CD38，如SEQ ID NO:39中所指定。
在一个实施方案中，抗体对人CD38的环化酶活性具有抑制作用。例如，抗体可以抑制人CD38的环化酶活性至少约40％，诸如至少约50％，诸如至少约60％。环化酶活性的抑制可以通过包括以下步骤的测定法来确定：
a)在多孔板中将200,000个Daudi或Wien133细胞接种在每孔100μL 20mM Tris-HCL中；或将0.6ug/mL带His标签的可溶性人CD38(SEQ ID NO:39)接种在每孔100μL 20mMTris-HCL中；
b)添加1μg/mL CD38抗体和80μM NGD至每个孔；
c)测量荧光直至达到平台期(例如，5、10或30分钟)；和
d)确定与对照，诸如用同种型对照抗体温育的孔相比的百分比抑制。
在一个实施方案中，抗体在存在而不是不存在Fc交联抗体的情况下诱导凋亡。
在一个实施方案中，抗体诱导表达人CD38的细胞的CDC、ADCC、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、胞啃作用或其任何组合。
在一个实施方案中，抗体诱导表达人CD38的细胞的CDC。例如，抗体可以诱导针对Daudi细胞(ATCC号CCL-213)或Ramos细胞(ATCC号CRL-1596)的CDC，导致最大裂解比用不同之处仅在于不存在Fc区中的一个或多个突变的参考抗体获得的最大裂解高至少50％，诸如至少60％，诸如至少70％。CDC可以通过包括以下步骤的测定法来确定：
a)在多孔板中将100,000个CD38表达细胞铺板在每孔补充有0.2％BSA的40μL培养基中；
b)用40μL连续稀释的CD38抗体(0.0002-10μg/mL)预温育细胞20分钟；
c)用20％的合并正常人血清在37℃下温育每个孔45分钟；
d)添加存活力染料并在流式细胞仪上测量细胞裂解的百分比；和
e)使用非线性回归确定最大裂解。
下面描述关于功能调节的更详细的实施方案。
补体依赖性细胞毒性(CDC)：
在一个实施方案中，本文公开的抗体诱导CDC。特别地，与对照相比，当与例如CD38表达细胞或细胞膜表面上的CD38结合时，抗体可以介导增加的CDC。对照可以是例如具有与抗体相同的氨基酸序列(通常是重链和轻链氨基酸序列)的参考抗体，除了在选自对应于人IgG1重链中E430、E345和S440的组中的一个或多个氨基酸残基中的突变。替代地，对照可以是具有与抗体相同的氨基酸序列(通常是重链和轻链氨基酸序列)的参考抗体，除了不同的VH和VL序列。例如，这样的参考抗体可以替代地具有抗体B或A的VH和VL序列，如表1所示。优选地，参考抗体的VH和VL序列是抗体B的序列。替代地，参考抗体可以是结合相同靶物但具有不同氨基酸序列的抗体。替代地，对照可以是同种型对照抗体，例如，使得VH和VL序列是如表1所示的抗体b12的序列。
因此，在一个实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高的针对表达CD38的靶细胞的CDC，其中参考抗体包含抗体C的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5，以及除了E430、E345和/或S440中的一个或多个突变，与抗体相同的CH和CL区序列。
在另一个实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高的针对表达CD38的靶细胞的CDC，其中参考抗体包含抗体C的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5，以及分别为SEQ ID NO:20(IgGm(f))和SEQ ID NO:37(κ)的CH和CL区序列。
在另一个实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高的针对表达CD38的靶细胞的CDC，其中参考抗体包含抗体B的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，以及与抗体相同的CH和CL区序列。
在另一个实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高的针对表达CD38的靶细胞的CDC，其中参考抗体包含抗体A的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，以及与抗体相同的CH和CL区序列。
在另一个实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高的针对表达CD38的靶细胞的CDC，其中参考抗体包含抗体b12的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16，以及与抗体相同的CH和CL区序列。
在一个具体实施方案中，CDC响应描述为最大裂解，其中较高的最大裂解反映增加的CDC。在一个具体实施方案中，CDC响应被描述为EC50(观察到半数最大裂解的浓度)，其中较低的EC50指示增加的CDC。在一个具体实施方案中，表达CD38的靶细胞是肿瘤细胞，诸如淋巴瘤细胞。淋巴瘤靶细胞的非限制性实例包括(在括号内指示商业来源)：
-Daudi细胞(ATCC CCL-213)；
-Ramos细胞(ATCC CRL-1596)；
-REH细胞(DSMZ ACC 22)；
-Wien-133细胞(BioAnaLab,Oxford,U.K.)；
-RS4；11细胞(DSMZ ACC 508)；
-NALM-16(DSMZ ACC 680)；
-U266(ATCC TIB-196)；
-RC-K8(DSMZ ACC 561)；
-SU-DHL-8；
-Oci-Ly-7；
-Oci-Ly-19；
-Oci-Ly-18；
-Raji；
-DOHH-2；
-SU-DHL-4；
-WSU-DLCL-2；
-Z-138；
-JVM-13；
-Jeko-1；
-697；
-Granta 519；
-DB；
-Pfeiffer。
表达CD38的靶细胞也可以是AML细胞，诸如选自但不限于下组中的一种：THP1、monomac6、Oci-AML3、KG-1、ML2、U937、Nomo-1、AML-193、MEGAL、MOLM13、HL-60、Oci-M1。
表达CD38的靶细胞也可以是MM细胞，诸如选自但不限于下组中的一种：LP-1、NCI-H929、OPM-2和ARH77。
在另一个具体实施方案中，表达CD38的靶细胞是肿瘤细胞，诸如淋巴瘤细胞、白血病细胞或骨髓瘤细胞，其中每个细胞的CD38分子的近似平均数在以下范围之一内，任选地当如实施例1中所述测定时：
-150,000-250,000，诸如约200,000；
-200,000-300,000，诸如约260,000；
-80,000-180,000，诸如约130,000；
-50,000-150,000，诸如约100,000；
-40,000-120,000，诸如约80,000；
-30,000-70,000，诸如约50,000；
-10,000-20,000，诸如约15,000；
-5,000-15,000，诸如约10,000。
在一个实施方案中，与参考抗体相比，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导针对表达CD38的靶细胞的CDC增加，其中参考抗体包含抗体B的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，以及与抗体相同的CH和CL区序列，其中CDC响应是EC50并且表达CD38的靶细胞选自NALM-16(DSMZ ACC 680)、U266(ATCC TIB-196)和RC-K8(DSMZACC 561)。
在优选实施方案中，与参考抗体相比，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导针对表达CD38的靶细胞的CDC增加，其中参考抗体包含抗体C的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5，以及SEQ ID NO:20(IgGm(f))和SEQ ID NO:37(κ)的CH和CL区序列，其中CDC响应是最大裂解并且表达CD38的靶细胞选自Daudi细胞(ATCC CCL-213)和Ramos细胞(ATCC CRL-1596)。抗体可以特别导致比参考抗体高至少50％，诸如至少60％或至少70％的最大裂解。
可以使用本领域技术人员已知并且适合于评估抗体(诸如IgG抗体)诱导针对表达CD38的靶细胞的CDC的能力的任何体外或体内方法或测定法。优选地，该测定法在相关部分包括实施例3中描述的CDC测定法的步骤。
用于确定由CD38抗体介导的CD38表达细胞的最大裂解或EC50值的测定法的非限制性实例可以包括以下步骤：
(a)在多孔板中将约100,000个CD38表达细胞铺板在每孔补充有0.2％BSA的40μL培养基中；
(b)用40μL连续稀释的CD38抗体(0.0002-10μg/mL)预温育细胞20分钟；
(c)用20％的合并正常人血清在37℃下温育每个孔45分钟；
(d)添加存活力染料并在流式细胞仪上测量细胞裂解的百分比；
(e)使用非线性回归确定最大裂解和/或计算EC50值。
适用于该测定法的肿瘤细胞包括但不限于表2中列出的那些，诸如Daudi细胞(ATCC CCL-213)。
在某些实施方案中，抗体诱导针对Daudi细胞(ATCC号CCL-213)或Ramos细胞(ATCC号CRL-1596)的CDC，导致最大裂解比用参考抗体获得的最大裂解高至少50％，诸如至少60％，诸如至少70％，所述参考抗体的不同之处仅在于选自对应于人IgG1重链中的E430、E435和S440的组中的一个或多个氨基酸残基不存在突变，其中氨基酸残基是根据EU索引编号。在一个实施方案中，参考抗体包含抗体C的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:1和SEQID NO:5，以及分别为SEQ ID NO:20(IgGm(f))和SEQ ID NO:37(κ)的CH和CL区域序列。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)：
在一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体诱导ADCC。在一些实施方案中，当与例如表达CD38的细胞或细胞膜表面上的CD38结合时，抗体可以介导ADCC。与没有E430G突变的相同抗体相比，发现包含E430G突变的抗CD38抗体诱导稍低水平的ADCC。当与例如表达CD38的细胞或细胞膜表面上的CD38结合时，抗体可以介导比对照更高的ADCC，其中对照可以是例如具有与抗体相同的氨基酸序列(通常是重链和轻链氨基酸序列)的参考抗体，除了不同的VH和VL序列。例如，这样的参考抗体可以替代地具有抗体B或A的VH和VL序列，如表1所示。优选地，参考抗体的VH和VL序列是抗体B的序列。替代地，对照可以是同种型对照抗体，例如，使得VH和VL序列是如表1所示的抗体b12的序列。
因此，在一个实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高的针对表达CD38的靶细胞的ADCC，其中参考抗体包含抗体B的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，以及与抗体相同的CH和CL区序列。在一个具体实施方案中，ADCC响应是最大裂解，其中较高的最大裂解反映较高的ADCC。在一个具体实施方案中，在确定FcγRIIIa结合的测定法中评估ADCC响应，其中更高的结合表明更高的ADCC。在一个具体实施方案中，表达CD38的靶细胞是肿瘤细胞。靶细胞的非限制性实例包括Daudi、Wien-133、Granta519、MEC-2和表2中列出的肿瘤细胞系。
在一个实施方案中，与参考抗体相比，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导更高的针对表达CD38的Daudi细胞的ADCC，其中参考抗体包含抗体B的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，以及与抗体相同的CH和CL区序列，任选地其中ADCC响应是最大裂解或FcγRIIIa结合。
在一个实施方案中，与参考抗体相比，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导更高的针对表达CD38的Daudi细胞的ADCC，其中参考抗体包含抗体b12的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16，以及与抗体相同的CH和CL区序列，任选地其中ADCC响应是最大裂解或FcγRIIIa结合。
可以使用本领域技术人员已知并且适合于评估抗体(诸如IgG抗体)诱导针对表达CD38的靶细胞的ADCC的能力的任何体外或体内方法或测定法。优选地，该测定法在相关部分包括实施例4中描述的51Cr释放抗体依赖性细胞毒性测定法或ADCC报告物生物测定法的步骤。用于确定由CD38抗体介导的CD38表达细胞的ADCC的测定法的非限制性实例可以包括以下列出的51Cr释放测定法或报告物测定法的步骤。
用51Cr释放进行的ADCC：
(a)在多孔板中将约5,000个51Cr标记的CD38表达细胞(例如Daudi细胞)铺板在每孔补充有0.2％BSA的50μL培养基中接种；
(b)用50μL连续稀释的CD38抗体(0.0002-10μg/mL)预温育细胞15分钟；
(c)用每孔500,000个新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC)在37℃下温育每个孔4小时，；
(d)在伽马计数器上测量75μL上清液中51Cr的释放量；
(e)将细胞裂解的百分比计算为(cpm样品-cpm自发裂解)/(cpm最大裂解-cpm自发裂解)，其中cpm是每分钟的计数。
用报告物测定法进行的ADCC：
(a)在适用于光学读数的多孔板(例如，来自Perkin Elmer Inc.的384孔OptiPlates)中将在10μL中的约5,000个Daudi细胞铺板在补充有25％低IgG血清的标准培养基(例如RPMI 1640)中；
(b)用10μL作为效应细胞的工程化Jurkat细胞和10μL连续稀释的CD38抗体(0.0002-10μg/mL)在37℃下温育每个孔6小时，该细胞稳定表达FcγRIIIa受体、V158(高亲和力)变体和驱动萤火虫萤光素酶表达的NFAT反应元件；
(c)用30μL萤光素酶底物在RT下温育每个孔5分钟并测量发光。
抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)：
在一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体诱导ADCP。在一些实施方案中，当与例如表达CD38的细胞或细胞膜表面上的CD38结合时，抗体可以介导ADCP。当与例如表达CD38的细胞或细胞膜表面上的CD38结合时，抗体可以介导比对照更高的ADCP，其中对照是同种型对照抗体，例如使得VH和VL序列是如表1所示的抗体b12的序列。
因此，在一个实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高的针对表达CD38的靶细胞的ADCP，其中参考抗体与抗体的不同之处仅在于抗体中E430、E345和/或S440中的一个或多个突变。在替代实施方案中，参考抗体包含抗体b12的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16，以及与抗体相同的CH和CL区序列。
在一个具体实施方案中，表达CD38的靶细胞是肿瘤细胞，诸如骨髓瘤或淋巴瘤细胞。为肿瘤细胞的靶细胞的非限制性实例包括表2中列出的那些。
可以使用技术人员已知并且适合于评估抗体(诸如IgG抗体)诱导针对表达CD38的靶细胞的ADCP的能力的任何体外或体内方法或测定法。优选地，该测定法在相关部分包括实施例5中描述的基于巨噬细胞的ADCP测定法的步骤。特别地，用于确定由CD38抗体介导的CD38表达细胞的ADCP的测定法可以包括以下列出的步骤：
ADCP：
(a)在含GM-CSF的培养基中温育5天使新鲜分离的单核细胞分化为巨噬细胞；
(b)在多孔板中将每孔约100,000个巨噬细胞铺板在具有GM-CSF的树突细胞培养基中；
(c)每孔添加20,000个用通用荧光膜染料标记的CD38抗体调理的CD38表达细胞(例如Daudi细胞)，在37℃下持续45分钟；
(d)在流式细胞仪上测量CD14阳性、CD19阴性、膜染料阳性的巨噬细胞的百分比。
凋亡：
在一个实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的抗体在不存在Fc交联剂的情况下可能不诱导凋亡。在另一个实施方案中，抗体可以在存在Fc交联剂而不是不存在Fc交联剂的情况下诱导凋亡。
在一个实施方案中，Fc交联剂是抗体。
在一个实施方案中，可以如实施例6中所述确定凋亡。
胞啃作用：
在一个实施方案中，本文公开的抗体诱导胞啃作用，诸如CD38从供体CD38表达细胞到接受者细胞的胞啃作用。典型的接受者细胞包括T细胞和B细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞和NK细胞。优选地，接受者细胞是表达Fc-γ-(Fcγ)-受体的淋巴细胞，诸如，例如巨噬细胞或PBMC。特别地，与对照相比，抗体可以介导增加的胞啃作用。对照可以是，例如具有与抗体相同的氨基酸序列(通常是重链和轻链氨基酸序列)的参考抗体，除了抗体中的E430、E345和/或S440中的一个或多个突变。在另一个实施方案中，对照是具有与抗体相同的氨基酸序列(通常是重链和轻链氨基酸序列)的参考抗体，除了不同的VH和VL序列。例如，对照可以是同种型对照抗体，例如，使得VH和VL序列是如表1所示的抗体b12的序列。
用于评估胞啃作用的合适测定法是本领域已知的并且包括例如实施例8中的测定法。用于确定由CD38抗体介导的CD38表达细胞的胞啃作用的测定法的非限制性实例包括以下：
胞啃作用(Daudi细胞)：
(a’)用5天的GM-CSF将新鲜分离的单核细胞分化为巨噬细胞；
(b’)将每孔约100,000个巨噬细胞铺板在具有GM-CSF的树突细胞培养基中；
(c’)每孔添加约20,000个用通用荧光膜染料标记的CD38抗体调理的Daudi细胞，在37℃下持续45分钟；
(d’)在流式细胞仪上测量Daudi细胞上的CD38表达，其中与对照相比，CD38抗体调理的Daudi细胞上的CD38减少，表明胞啃作用。
胞啃作用(Treg)：
(a)将每孔约500,000个新鲜分离的PBMC铺板的细胞培养基中在37℃下O/N；
(b)每孔添加约100,000个用通用荧光细胞内胺染料标记的CD38抗体调理的Treg，在37℃下过夜(O/N)；和
(c)在流式细胞仪上测量Treg上的CD38表达，其中与对照相比，CD38抗体调理的Treg上的CD38减少，表明胞啃作用。
除了Daudi细胞(ATCC CCL-213)，适用于第一种测定法的肿瘤细胞包括但不限于表2中列出的那些，特别是具有高CD38表达的那些。此外，用于第二种测定法的合适的CD38表达细胞除Treg外，包括免疫细胞诸如，例如NK细胞、B细胞、T细胞和单核细胞，以及表2中列出的肿瘤细胞，特别是具有低CD38表达水平的那些。
因此，在一个实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高水平的表达CD38的靶细胞的胞啃作用，其中参考抗体包含抗体C的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5，以及除了E430、E345和/或S440中的一个或多个突变外，与抗体相同的CH和CL区序列。
在一些实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高水平的表达CD38的靶细胞的胞啃作用，其中参考抗体包含抗体B的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，以及与抗体相同的CH和CL区序列。
在一些实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高水平的表达CD38的靶细胞的胞啃作用，其中参考抗体包含抗体A的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，以及与抗体相同的CH和CL区序列。
在一些实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体诱导比参考抗体更高水平的表达CD38的靶细胞的胞啃作用，其中参考抗体包含抗体b12的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16，以及与抗体相同的CH和CL区序列。
CD38酶活性的调节：
根据本文任何方面或实施方案的抗体通常可以调节人CD38的一种或多种酶活性。在一个实施方案中，本文公开的抗体对CD38环化酶活性具有抑制作用，例如与对照，例如同种型对照抗体诸如抗体b12相比。例如，抗体可以对由细胞诸如肿瘤细胞表达的CD38的环化酶活性具有抑制作用，和/或对分离的CD38诸如CD38的可溶性片段(例如，SEQ ID NO:39)具有抑制作用。
可以使用本领域技术人员已知的并且适合于评估抗CD38抗体抑制CD38环化酶活性的能力的任何体外或体内方法或测定法。用于测试CD38环化酶活性的合适测定例如描述于WO 2006/099875 A1和WO 2011/154453 A1中。优选地，该方法在相关部分包括实施例6中描述的特定测定法的步骤，使用烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸钠盐(NGD)作为CD38的底物测试环化酶活性。NGD是非荧光的，由CD38环化为cADPR的荧光类似物，环GDP-核糖(参见，例如，Comb,Chem High Throughput Screen.2003Jun；6(4):367-79A)。测定法的非限制性实例包括用于确定CD38环化酶活性抑制的以下步骤：
(a)在多孔板中将200,000个Daudi或Wien133细胞接种在每孔100μL 20mM Tris-HCL中；或将0.6μg/mL带His标签的可溶性CD38(SEQ ID NO:39)接种在每孔100μL 20mMTris-HCL中；
(b)添加1μg/mL CD38抗体和80μM NGD至每个孔；
(c)测量荧光直至达到平台期(例如5、10或30分钟)；和
(d)确定与对照，诸如用同种型对照抗体温育的孔相比的百分比抑制。
在一个实施方案中，在这样的测定法中，与对照，通常在同种型对照抗体存在下的CD38环化酶活性相比，抗体能够抑制CD38的环化酶活性，具体是NGD转化的最大百分比，至少约40％，诸如至少约50％，诸如至少约60％％，诸如在约40％至约60％之间。例如，同种型对照抗体可以包含抗体b12的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16，以及与抗体相同的CH和CL区序列。在一个具体实施方案中，该测定法利用hisCD38(SEQ ID NO:39)来确定环化酶活性。
在一些实施方案中，与参考抗体相比，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体具有增加的(即更有效的)CD38环化酶活性的抑制，其中参考抗体包含抗体B的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，以及与抗体相同的CH和CL区序列。
在一些实施方案中，与参考抗体相比，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体具有增加的(即更有效的)CD38环化酶活性的抑制，其中参考抗体包含抗体A的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，以及与抗体相同的CH和CL区序列。
此外，在一些实施方案中，如本文所述的抗体在存在而不是不存在Fc交联抗体的情况下诱导表达CD38的凋亡。这些功能均可以在相关部分包括实施例6中描述的凋亡测定法的步骤的测定法中测量。在一个实施方案中，凋亡测定法可以包括以下步骤：
(a)将100,000个表达CD38的肿瘤细胞铺板在每孔补充有0.2％BSA的100μL培养基中；
(b)用连续稀释的CD38抗体(0.0002-10μg/mL)和10μg/mL山羊抗人IgG1在37℃下O/N温育每个孔；
(c)在流式细胞仪上测量死细胞的百分比。
亲和力：
用于评估抗体与CD38结合的亲和力的方法在本领域中是众所周知的并且可以用于评估本文所述的抗体的亲和力。用于评估如本文所述的抗体的结合亲和力的特别合适的测定法是实施例13中所述的测定法。例如，可以采用实施例13的测定法以确定根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体与参考抗体相比的亲和力。在一些实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体在与人CD38的结合上具有相比参考抗体增加的亲和力(即，较低的KD)。在一个实施方案中，参考抗体是IgG1-B。在一个实施方案中，参考抗体是IgG1-C。在一个实施方案中，参考抗体是IgG1-A。
在一些实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体在与人CD38的结合上具有相比参考抗体增加的亲和力(即，较低的KD)，其中参考抗体包含抗体B的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，以及IgG1 Fc区，即IgG1-B。
在一些实施方案中，根据本文公开的任何方面或实施方案的抗体是包含与SEQ IDNO:1相差一个或多个突变的VH和/或包含与SEQ ID NO:5相差一个或多个突变的VL的抗体，并且在与人CD38的结合上具有相比参考抗体增加的亲和力(即，较低的KD)，其中参考抗体包含抗体C的VH和VL区序列，即分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5，以及与抗体相同的CH和CL区序列。在优选实施方案中，该抗体包含具有如SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有如SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有如SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3、具有如SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有如SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3，因此VH和/或VL中的一个或多个突变位于一个或多个FR区。
抗体生产
如本文所公开的抗体通常在宿主细胞，诸如重组宿主细胞中产生。在大多数实施方案中，抗体将同时含有重链和轻链，并且宿主细胞因此通常在相同或不同载体上表达重链和轻链编码构建体。例如，宿主细胞可以包含稳定整合到细胞基因组中的第一和第二核酸构建体，其中第一编码本文公开的抗体的重链，并且第二编码轻链。在另一个实施方案中，本发明提供了包含非整合核酸，诸如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件的细胞，其包含如上指定的第一和第二核酸构建体。
因此，本发明提供了药物组合物，其中抗体通过包括在宿主细胞中表达重链和轻链的方法获得或可获得。用于生产抗体的宿主细胞系可以影响抗体的糖基化谱，因为不同的宿主细胞可能表达不同的糖基化酶和转运蛋白库，这有助于糖基化的特异性和异质性(Goh and Ng,Critical Reviews in Biotechnology,2018；38:851-67)。
要求保护的重组宿主细胞可以是例如真核细胞、原核细胞或微生物细胞，例如转染瘤。在特定的实施方案中，宿主细胞是真核细胞。宿主细胞的其他实例包括酵母、细菌和植物细胞。优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如CHO、CHO-S、HEK、HEK293、HEK-293F、Expi293F、PER.C6、NS0细胞、Sp2/0细胞或淋巴细胞。在特定的实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
宿主细胞可以是能够对蛋白质进行Asn连接的糖基化的细胞，例如蛋白质。真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如一个人体细胞。例如，宿主细胞可以是经过基因工程改造以产生具有类人或人糖基化的糖蛋白的非人细胞。此类细胞的实例是转基因毕赤酵母(Pichiapastoris)(Hamilton et al.,Science 301(2003)1244-1246；Potgieter et al.,J.Biotechnology 139(2009)318-325)和基因修饰的浮萍(Lemna minor)(Cox et al.,Nature Biotechnology 12(2006)1591-1597)。
宿主细胞也可以是具有改变的糖基化机制的细胞。此类细胞已在本领域中描述并且可以用作宿主细胞，在其中表达本发明的抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，参见Shields,R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740；Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17:176-1，以及EP1176195；WO03/035835；和WO99/54342。用于生成工程化糖型的其他方法是本领域已知的，并且包括但不限于在Davies et al.,2001,BiotechnolBioeng 74:288-294；Shields et al,2002,J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa etal.,2003,J Biol Chem 278:3466-3473)、US6602684、WO00/61739A1；WO01/292246A1；WO02/311140A1；WO 02/30954A1；PotelligentTM技术(Biowa,Inc.Princeton,N.J.)；GlycoMAbTM糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG,Zurich,Switzerland)；US20030115614；Okazaki et al.,2004,JMB,336:1239-49中描述的那些，以及在WO2018/114877、WO2018/114878和WO2018/114879中描述的那些。
宿主细胞也可以是不能从抗体重链高效除去C端赖氨酸残基的细胞。例如，Liu etal.(2008)J Pharm Sci 97:2426中的表2(通过引用并入本文)列出了许多这样的抗体生产***，例如Sp2/0、NS/0或转基因乳腺(山羊)，其中仅获得C端赖氨酸残基的部分除去。替代地，如本文别处所述，编码抗体重链的核酸序列可以缺少编码C端赖氨酸的密码子，例如对应于人IgG1重链中K447的赖氨酸残基，其中氨基酸残基根据EU索引编号。
在特定的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含全长二价抗体，其包含以下各项、由或基本上由以下各项组成：
-包含VH和CH的重链，其中VH包含SEQ ID NO:1并且CH包含SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:46，和
-和包含VL和CL的轻链，其中VL包含SEQ ID NO:5并且CL包含SEQ ID NO:37，
其中抗体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生。
在特定的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含全长二价抗体，其包含、由或基本上由以下组成：
-包含VH和CH的重链，其中VH包含SEQ ID NO:1并且CH包含SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:46，和
-和包含VL和CL的轻链，其中VL包含SEQ ID NO:5并且CL包含SEQ ID NO:37，
其中抗体通过包括在CHO细胞中表达重链和轻链的方法获得或可获得。
治疗性应用
本发明的药物组合物具有许多治疗性用途，包括治疗涉及表达CD38的细胞，例如表达CD38的肿瘤细胞或免疫细胞的疾病和病症。例如，可以将药物组合物施用于培养物中的细胞，例如体外或离体，或施用于人受试者，例如体内，以治疗或预防多种病症和疾病。如本文所用，术语“受试者”旨在包括可能受益或响应于抗体的人和非人动物。受试者可以例如包括患有可以通过调节CD38功能诸如酶活性和/或诱导裂解和/或消除/减少表达CD38的细胞的数量和/或减少细胞膜上CD38的量来纠正或改善的疾病或病症的人患者。因此，药物组合物可以用于在体内或体外引发以下一种或多种生物活性：在补体存在下表达CD38的细胞的CDC；CD38环化酶活性的抑制；在人效应细胞存在下表达CD38的细胞的吞噬作用或ADCC；和CD38表达细胞，诸如肿瘤细胞或免疫细胞的胞啃作用。
因此，在一个方面，本发明涉及用作药物的根据本发明的药物组合物。
在一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。
在一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物用于治疗或预防疾病或病症，诸如用于治疗或预防涉及表达CD38的细胞的疾病或病症，例如用于治疗涉及表达CD38的细胞的疾病。
在一个方面，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，其包括将根据本发明的药物组合物施用于有此需要的受试者。
在一个方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物用于治疗或预防疾病或病症。
在一个方面，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，其包括将根据本发明的药物组合物施用于有此需要的患者，通常以治疗有效量和/或足以治疗疾病或病症的时间。
在一个方面，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，其包括以下步骤：
-选择患有疾病或病症的受试者，以及
-向受试者施用本发明的药物组合物，通常以治疗有效量和/或足以治疗疾病或病症的时间。
在一个实施方案中，涉及表达CD38的细胞的疾病或病症是癌症，即致瘤性病症，诸如特征在于存在表达CD38的肿瘤细胞或免疫细胞的病症，包括例如血液癌症，诸如B细胞淋巴瘤、浆细胞恶性肿瘤、T/NK细胞淋巴瘤、髓系恶性肿瘤以及实体瘤恶性肿瘤。
在一些实施方案中，疾病或病症是涉及表达CD38的肿瘤细胞的癌症。
在一些实施方案中，疾病或病症是涉及表达CD38的免疫抑制细胞的癌症，诸如表达CD38的非癌性免疫抑制细胞。
在一些实施方案中，疾病或病症是涉及表达CD38的肿瘤细胞和免疫抑制细胞两者的癌症。
在一些实施方案中，疾病或病症是涉及表达CD38的免疫抑制细胞和不表达CD38的肿瘤细胞的癌症。
在其他实施方案中，疾病或病症是涉及表达CD38的细胞的炎性和/或自身免疫性疾病或病症。
在其他实施方案中，疾病或病症是涉及表达CD38的细胞的代谢病症。
药物组合物可以通过任何合适的途径和方式施用于受试者或患者，如本文别处所述。在特定的实施方案中，药物组合物通过静脉内注射或输注施用。在静脉输注或注射之前或与其相关时，可以任选地用合适的稀释剂稀释药物组合物。
血液肿瘤：
在一个方面，疾病或病症是血液癌症。此类血液癌症的实例包括B细胞淋巴瘤/白血病，包括前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤和B细胞非霍奇金淋巴瘤；急性早幼粒细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病和成熟B细胞赘生物，诸如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、B细胞急性淋巴细胞性白血病、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)，包括低级、中级和高级FL、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结和脾型)、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞白血病、移植后淋巴组织增生性疾病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞白血病和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
B细胞非霍奇金淋巴瘤的实例有淋巴瘤样肉芽肿、原发性渗出性淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、重链疾病(包括γ、μ和α疾病)、免疫抑制剂治疗诱导的淋巴瘤，诸如环孢素诱导的淋巴瘤和甲氨蝶呤诱导的淋巴瘤。
在本发明的一个实施方案中，涉及表达CD38的细胞的病症是霍奇金淋巴瘤。
涉及表达CD38的细胞的疾病的其他实例包括衍生自T细胞和NK细胞的恶性肿瘤，其包括：成熟T细胞和NK细胞赘生物包括T细胞幼淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻型，肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿/塞扎里综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生性疾病(原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤C-ALCL、淋巴瘤样丘疹病、交界性病变)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特指的外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。
衍生自髓系细胞的恶性肿瘤的实例包括急性髓系白血病，包括急性早幼粒细胞性白血病，和慢性骨髓增生性疾病，包括慢性髓系白血病。
在一些实施方案中，血液癌症选自由多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(成人)(AML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组成的组。在一个实施方案中，ALL是B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)。
在一些实施方案中，癌症选自由多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、急性髓性白血病(成人)(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和滤泡性淋巴瘤(FL)组成的组。
在一些实施方案中，血液癌症选自由多发性骨髓瘤(MM)、B细胞淋巴瘤和急性髓性白血病(AML)组成的组。B细胞淋巴瘤的非限制性实例包括例如套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)和B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)。
在一些实施方案中，血液癌症选自由多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(成人)(AML)、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和骨髓增生异常综合征(MDS)组成的组。在一个实施方案中，B细胞淋巴瘤选自套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(FL)。在一个实施方案中，ALL是B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)。用于治疗或预防血液癌症的药物组合物可以例如通过静脉内注射或输注施用于受试者或患者。在静脉输注或注射之前或与其有关时，可以任选地用合适的稀释剂稀释药物组合物。
在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤(MM)。
在一些实施方案中，癌症是B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在一些实施方案中，癌症是套细胞淋巴瘤(MCL)。
在一些实施方案中，癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
在一些实施方案中，癌症是滤泡性淋巴瘤(FL)。
在一些实施方案中，癌症是急性髓性白血病(成人)(AML)。
在一些实施方案中，癌症是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。
在一些实施方案中，癌症是B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)。
在一些实施方案中，癌症是伯基特淋巴瘤。
在一些实施方案中，癌症是骨髓增生异常综合征(MDS)。
实体瘤恶性肿瘤：
在一个方面，疾病或病症是包括实体瘤的癌症。也就是说，患有癌症的患者患有实体瘤。
实体瘤的实例包括但不限于黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、***癌、去势抵抗性***癌、胃部癌(stomach cancer)、卵巢癌、胃癌(gastric cancer)、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖***癌症、子宫内膜癌、***、肺腺癌、肾细胞癌(RCC)(例如，肾透明细胞癌或肾***状细胞癌)、间皮瘤、鼻咽癌(NPC)、食管或胃肠道癌，或其任一种的转移性病变。
在一个优选的实施方案中，实体瘤来自含有免疫抑制细胞(诸如Treg)并表达CD38的癌症。T调节细胞(Treg)可以具有高CD38表达，并且与具有中等CD38表达的Treg相比，具有高CD38表达的Treg具有更强的免疫抑制性(Krejcik J.et al.Blood 2016 128:384-394)。因此，不受理论限制，包含在根据本发明的药物组合物中的抗体通过胞啃作用降低Treg上表达的CD38的量的能力特别允许治疗Treg表达CD38的患者的实体瘤。当Treg上的CD38表达与对照相比(例如使用众所周知的方法用抗CD38抗体检测到的表达与用同种型对照抗体检测到的表达比较)在统计学上显著时，Treg表达CD38。这可以，例如，通过采集生物样品诸如血液样品、骨髓样品或肿瘤活检进行测试。
因此，在一个方面，本发明涉及包含该药物组合物的药物组合物，其用于治疗或预防包含表达CD38的Treg的受试者的实体瘤。
在另一个方面，本发明涉及治疗包含表达CD38的Treg的受试者实体瘤的方法，其包括施用根据本发明的药物组合物，通常以治疗有效量和/或足以使治疗疾病或病症的时间。
在一些实施方案中，实体瘤是黑色素瘤。
在一些实施方案中，实体瘤是肺癌。
在一些实施方案中，实体瘤是鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施方案中，实体瘤是非鳞状NSCLC。
在一些实施方案中，实体瘤是结直肠癌。
在一些实施方案中，实体瘤是***癌。
在一些实施方案中，实体瘤是去势抵抗性***癌。
在一些实施方案中，实体瘤是胃部癌(stomach cancer)。
在一些实施方案中，实体瘤是卵巢癌。
在一些实施方案中，实体瘤是胃癌(gastric cancer)。
在一些实施方案中，实体瘤是肝癌。
在一些实施方案中，实体瘤是胰腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤是甲状腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤是头颈部鳞状细胞癌。
在一些实施方案中，实体瘤是食管或胃肠道癌。
在一些实施方案中，实体瘤是乳腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤是输卵管癌。
在一些实施方案中，实体瘤是脑癌。
在一些实施方案中，实体瘤是尿道癌。
在一些实施方案中，实体瘤是泌尿生殖***癌症。
在一些实施方案中，实体瘤是子宫内膜癌。
在一些实施方案中，实体瘤是***。
在一些实施方案中，实体瘤的肿瘤细胞缺乏可检测的CD38表达。当从实体瘤中分离出的肿瘤细胞上的CD38表达与对照相比(例如使用众所周知的方法用抗CD38抗体检测到的表达与用同种型对照抗体检测到的表达比较)在统计学上不显著时，实体瘤的肿瘤细胞缺乏可检测的CD38表达。这可以，例如，通过从肿瘤中获取生物样品诸如活检进行测试。
在一些实施方案中，癌症在包含表达CD38的T调节细胞的患者中。
在具体的实施方案中，药物组合物以治疗有效量和/或足以治疗癌症的时间施用。
代谢性病症：
在一个方面，疾病或病症是代谢性病症。也就是说，患者患有代谢性病症。
在一些实施方案中，代谢性病症是淀粉样变性。淀粉样变性是由组织中存在不溶性蛋白质沉积物定义的一大组疾病。其诊断基于组织学发现。在进一步的实施方案中，所述淀粉样变性可以是AL淀粉样变性。
患者：
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以用于治疗新诊断患有多发性骨髓瘤的患者中的多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以用于治疗或预防受试者中的疾病或病症，该受试者已经接受过至少一种用一种或多种化合物针对相同疾病或病症的先前疗法，其中所述一种或多种化合物不同于本发明的药物组合物。疾病或病症可以是本文所述的任何疾病或病症；诸如涉及表达CD38的细胞的癌症、炎症和/或自身免疫性疾病或病症，或涉及表达CD38的细胞的代谢性病症。
例如，在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以用于治疗或预防已经接受过蛋白酶体抑制剂(PI)和/或免疫调节药物(IMiD)的先前治疗的受试者的疾病或病症。蛋白酶体抑制剂的实例包括但不限于硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)和艾沙佐米(ixazomib)。IMiD的实例包括但不限于沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)。在进一步的实施方案中，所述疾病或病症可以是癌症或肿瘤，诸如多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤或骨髓增生异常综合征(MDS)。因此，受试者可以是癌症患者，诸如多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤或骨髓增生异常综合征(MDS)患者。在具体的实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗或预防已经接受过蛋白酶体抑制剂(PI)和/或免疫调节药物(IMiD)的先前治疗的受试者或患者的多发性骨髓瘤。药物组合物可以例如，通过静脉内注射或输注施用于受试者或患者。在静脉输注或注射之前或与其有关时，可以任选地用合适的稀释剂稀释药物组合物。
本发明的药物组合物可以用于治疗或预防未用抗CD38抗体进行任何先前治疗的受试者的疾病或病症。通常，此类受试者或患者被称为抗CD38抗体初治患者。在一个实施方案中，抗CD38抗体是达雷妥尤单抗；即受试者或患者之前没有用达雷妥尤单抗进行过任何先前治疗。因此，在一个实施方案中，受试者或患者是未接受达雷妥尤单抗的受试者/患者。根据本文公开的任何方面或实施方案，疾病或病症可以是癌症或肿瘤，或代谢性疾病，诸如淀粉样变性。在具体的实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗或预防未接受达雷妥尤单抗的受试者或患者的多发性骨髓瘤(MM)。在特定的实施方案中，药物组合物通过静脉内注射或输注施用于受试者或患者。在静脉输注或注射之前或与其有关时，可以任选地用合适的稀释剂稀释药物组合物。
本发明还提供药物组合物，其用于治疗或预防已接受至少一种包含CD38抗体的先前疗法的受试者的疾病或病症。
本发明还提供了用于治疗已接受至少一种包含CD38抗体的先前疗法的癌症患者的药物组合物。本发明还提供了用于治疗患有代谢性疾病诸如淀粉样变性的患者的药物组合物，这些患者已经接受至少一种包含CD38抗体的先前疗法。此类先前疗法可能是包含CD38抗体的计划治疗程序的一个或多个周期，诸如CD38抗体作为单一药剂疗法或联合疗法的一个或多个计划周期，以及以计划方式的连续治疗。在一个实施方案中，先前疗法是CD38抗体单一疗法。在一个实施方案中，先前疗法是包含CD38抗体的联合疗法。例如，先前疗法可能是CD38抗体联合蛋白酶体抑制剂(PI)和免疫调节剂。在一些实施方案中，CD38抗体是达雷妥尤单抗。
在一些方面，癌症患者也可能是其中施用达雷妥尤单抗作为单一疗法具有有限效果的患者。
在某些方面，癌症可以表征为对先前疗法“难治”或“复发”的癌症。在进一步的实施方案中，先前疗法可以包括PI、IMiD和CD38抗体中的一种或多种，例如其中CD38抗体是达雷妥尤单抗。通常，这表明先前疗法未达到完全响应(CR)，例如，癌症对CD38抗体单一或联合治疗无响应，或者癌症在治疗CD38抗体疗法结束后的预定时间段内进展。此类联合疗法的实例包括但不限于CD38抗体与PI或IMiD或PI和IMiD的组合的组合。类似地，它可能表明先前疗法未达到完全响应(CR)，例如，癌症对PI、IMiD或其联合疗法无响应，或者癌症在所述治疗结束后的预定时间段内进展。技术人员可以基于本领域已知的，包括可用于每种癌症的指南来确定癌症是否对先前疗法难治。
例如，在多发性骨髓瘤中，难治性和复发性疾病可以根据Rajkumar、Harousseau等人代表国际骨髓瘤研讨会共识小组发布的指南，Consensus recommendations for theuniform reporting of clinical trials:report of the International MyelomaWorkshop Consensus Panel,Blood 2011；117:4691-4695来鉴定。
难治性骨髓瘤可以定义为在初次治疗或挽救治疗时无响应或在末次治疗后60天内进展的疾病。无响应性疾病被定义为在治疗时未能达到最小响应或发展为进行性疾病(PD)。难治性骨髓瘤可能有2类：“复发性和难治性骨髓瘤”和“原发性难治性骨髓瘤”。
复发性和难治性骨髓瘤可以定义为患者在挽救治疗时无响应或在末次治疗后60天内进展的疾病，所述患者在其病程进展之前的某个时间点达到最小响应(MR)或更好。
原发性难治性骨髓瘤可以定义为对任何治疗从未达到最小响应或更好的患者无响应的疾病。它包括从未达到MR或更好的患者，其中M蛋白没有显著变化并且没有临床进展的证据，以及其中患者符合真正PD标准的原发性难治性PD。在报告原发性难治性患者的治疗功效时，应分别说明这2个亚组(“无响应-无进展”和“进展”)的功效。
复发性骨髓瘤可以定义为既往治疗的骨髓瘤，其进展并需要开始挽救治疗，但不符合“原发性难治性骨髓瘤”或“复发性和难治性骨髓瘤”类别的标准。
有关多发性骨髓瘤中具体响应(CR、PR等)以及如何测试它们的详细信息，参见Rajkumar,Harousseau et al.,2011(同上)。
因此，在一些实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的药物组合物用于治疗对先前治疗难治的癌症，所述先前治疗包含PI、IMiD和CD38抗体中的一种或多种。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体。在一个实施方案中，先前治疗包括PI和/或IMid。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体和PI和IMid中的两种或更多种。在具体的实施方案中，在使用前癌症被鉴定为难治性癌症。
在另一个实施方案中，提供了治疗受试者癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)将受试者鉴定为对包含PI、IMiD和CD38抗体中的一种或多种的先前治疗难治，和
(ii)向受试者施用治疗有效量的根据本文任何方面或实施方案的药物组合物。
在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体。在一个实施方案中，先前治疗包括PI和/或IMid。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体、PI和IMid中的两种或更多种。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗受试者对包括PI、IMiD和CD38抗体中的一种或多种的先前治疗难治的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据本文任何方面或实施方案的药物组合物。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体。在一个实施方案中，先前治疗包括PI和/或IMid。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体、PI和/或IMid中的两种或更多种。
在一些实施方案中，PI选自由硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)和艾沙佐米(ixazomib)组成的组。
在一些实施方案中，IMiD选自由沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)组成的组。
在一些实施方案中，CD38抗体是达雷妥尤单抗(daratumumab)。
在一些实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的药物组合物用于治疗在先前治疗后复发的癌症，所述先前治疗包含PI、IMiD和CD38抗体中的一种或多种。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体。在一个实施方案中，先前治疗包括PI和/或IMid。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体、PI和IMid中的两种或更多种。在具体的实施方案中，在使用前癌症鉴定为复发。
在另一个实施方案中，提供了治疗受试者癌症的方法，其包括以下步骤：
(i)将受试者鉴定为在包含PI、IMiD和CD38抗体中的一种或多种的先前治疗后复发，和
(ii)向受试者施用治疗有效量的根据本文任何方面或实施方案的药物组合物。
在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体。在一个实施方案中，先前治疗包括PI和/或IMid。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体、PI和IMid中的两种或更多种。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗受试者中在包括PI、IMiD和CD38抗体中的一种或多种的先前治疗后复发的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据本文任何方面或实施方案的药物组合物。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体。在一个实施方案中，先前治疗包括PI和/或IMid。在一个实施方案中，先前治疗包括CD38抗体、PI和IMid中的两种或更多种。
在一些实施方案中，PI选自由硼替佐米、卡非佐米和艾沙佐米组成的组。
在一些实施方案中，IMiD选自由沙利度胺、来那度胺和泊马度胺组成的组。
在一些实施方案中，CD38抗体是达雷妥尤单抗。
在具体的实施方案中，根据本发明的药物组合物以治疗有效量和/或足以治疗难治性或复发性癌症的时间施用。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是血液癌症。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症选自由多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(成人)(AML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组成的组。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症选自由多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(FL)组成的组。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是多发性骨髓瘤(MM)。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是套细胞淋巴瘤(MCL)。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是滤泡性淋巴瘤(FL)。
在一个具体实施方案中，根据本文任何方面或实施方案的药物组合物用于在包含PI、IMiD或两者的先前治疗之后治疗受试者或患者的难治性或复发性多发性骨髓瘤(MM)。在特定的实施方案中，药物组合物通过静脉内注射或输注施用于受试者或患者。在静脉输注或注射之前或与其有关时，可以任选地用合适的稀释剂稀释药物组合物。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是实体瘤。在一些实施方案中，难治性或复发性癌症选自由黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、***癌、去势抵抗性***癌、胃部癌(stomach cancer)、卵巢癌、胃癌(gastric cancer)、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖***癌症、子宫内膜癌，***组成的组。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是黑色素瘤。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是肺癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是非鳞状NSCLC。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是结直肠癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是***癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是去势抵抗性***癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是胃部癌(stomach cancer)。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是卵巢癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是胃癌(gastric cancer)。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是肝癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是胰腺癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是甲状腺癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是头颈部鳞状细胞癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是食管或胃肠道癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是乳腺癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是输卵管癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是脑癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是尿道癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是泌尿生殖***癌症。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是子宫内膜癌。
在一些实施方案中，难治性或复发性癌症是***。
自身免疫性和炎性疾病和病症：
在本发明的另一个实施方案中，涉及表达CD38的细胞的病症是其中涉及表达CD38的B细胞、巨噬细胞、浆细胞、单核细胞和T细胞的免疫病症，诸如炎性和/或自身免疫性疾病。涉及表达CD38的B细胞、浆细胞、单核细胞和T细胞的免疫病症的实例包括自身免疫性疾病(诸如银屑病、银屑病关节炎、皮炎、***性硬皮病和硬化症)、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、肾小球肾炎、湿疹、哮喘、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷、多发性硬化症、雷诺综合征、干燥综合征、幼年型糖尿病、赖特氏病、***、免疫复合物肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病、免疫介导的血小板减少症(诸如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜)、溶血性贫血、重症肌无力、狼疮性肾炎、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、特应性皮炎、天疱疮、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、韦氏肉芽肿病、奥梅恩综合征、慢性肾衰竭、急性传染性单核细胞增多症、多发性硬化症、HIV和疱疹病毒相关疾病。进一步的实例是严重的急性呼吸窘迫综合征和脉络膜视网膜炎。此外，包括其他疾病和病症，诸如由病毒感染B细胞引起或介导的疾病和病症，诸如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)。
在一个实施方案中，涉及表达CD38的细胞的病症是类风湿性关节炎。
其中自身抗体和/或过度的B和T淋巴细胞活性突出并且可以根据本发明治疗的炎性、免疫和/或自身免疫性病症的其他实例包括以下：血管炎和其他血管疾病，诸如显微镜下多血管炎，Churg-Strauss综合征和其他ANCA相关性血管炎、结节性多动脉炎、原发性冷球蛋白血症性血管炎、皮肤白细胞破碎性血管炎、川崎病、大动脉炎、巨细胞关节炎、过敏性紫癜、原发性或孤立性脑血管炎、结节性红斑、血栓闭塞性血管炎、血栓性血小板减少性紫癜(包括溶血性***综合征)和继发性血管炎，包括皮肤白细胞破碎性血管炎(例如，继发于乙型肝炎、丙型肝炎、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、B细胞赘生物、类风湿性关节炎、干燥综合征或***性红斑狼疮)；进一步的实例是结节性红斑、过敏性血管炎、脂膜炎、韦勃-克莱斯坦病、高球蛋白血症性紫癜和伯格氏病；皮肤病症，诸如接触性皮炎、线性IgA皮肤病、白癜风、坏疽性脓皮病、获得性大疱性表皮松解症、寻常型天疱疮(包括瘢痕性类天疱疮和大疱性类天疱疮)、斑秃(包括普秃和全秃)、疱疹样皮炎、多形性红斑和慢性自身免疫性荨麻疹(包括血管神经性水肿和荨麻疹性血管炎)；免疫介导的血细胞减少，诸如自身免疫性中性粒细胞减少和纯红细胞再生障碍；***疾病，诸如CNS狼疮，盘状红斑狼疮、CREST综合征、混合性***病、多发性肌炎/皮肌炎、包涵体肌炎、继发性淀粉样变性、I型和II型冷球蛋白血症、纤维肌痛、磷脂抗体综合征、继发性血友病、复发性多软骨炎、结节病、僵人综合征和风湿热；进一步的实例是嗜酸性筋膜炎；关节炎，诸如强直性脊柱炎、青少年慢性关节炎、成人斯蒂尔病和SAPHO综合征；进一步的实例是骶髂关节炎、反应性关节炎、斯蒂尔病和痛风；血液***疾病，诸如再生障碍性贫血、原发性溶血性贫血(包括冷凝集素综合征)、继发于CLL或***性红斑狼疮的溶血性贫血；POEMS综合征、恶性贫血和瓦尔登斯特伦紫癜高球蛋白血症；进一步的实例是粒细胞缺乏症、自身免疫性中性粒细胞减少症、Franklin病、Seligmann病、γ重链病、继发于胸腺瘤和淋巴瘤的副肿瘤综合征、继发于胸腺瘤和淋巴瘤的副肿瘤综合征，以及因子VIII抑制物形成；内分泌病，诸如多内分泌病和艾迪生病；进一步的实例是自身免疫性低血糖、自身免疫性甲状腺功能减退、自身免疫性胰岛素综合征、德凯尔万甲状腺炎和胰岛素受体抗体介导的胰岛素抵抗；肝胃肠病症，诸如乳糜泻、惠普尔病、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎和原发性硬化性胆管炎；进一步的实例是自身免疫性胃炎；肾病，诸如急进性肾小球肾炎、链球菌感染后肾炎、古德帕斯丘综合征、膜性肾小球肾炎和冷球蛋白血症肾炎；进一步的实例是微小病变；神经***病症，诸如自身免疫性神经病、多发性单神经炎、兰伯特-伊顿肌无力综合征、西登哈姆氏舞蹈病、脊髓痨和吉兰-巴雷综合征；进一步的实例是脊髓病/热带痉挛性截瘫、重症肌无力、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病；多发性硬化症；心脏和肺部疾病，诸如COPD、纤维化肺泡炎、闭塞性细支气管炎、过敏性曲霉病、囊性纤维化、
Figure BDA0003747970340000681
综合征、心肌炎和心包炎；进一步的实例是过敏性肺炎和继发于肺癌的副肿瘤综合征；过敏性疾病，诸如支气管哮喘和高IgE综合征；进一步的实例是一时性黑朦；眼科病症，诸如特发性脉络膜视网膜炎；感染性疾病，诸如细小病毒B感染(包括手袜综合症)；妇产科病症，诸如复发性流产、复发性胎儿丢失和宫内发育迟缓；进一步的实例是继发于妇科赘生物的副肿瘤综合征；男性生殖障碍，诸如继发于睾丸赘生物的副肿瘤综合征；以及移植衍生的病症，诸如同种异体移植物和异种移植物排斥，以及移植物抗宿主病。
在一个实施方案中，疾病或病症是类风湿性关节炎。
表1.氨基酸和核酸序列
Figure BDA0003747970340000691
Figure BDA0003747970340000701
Figure BDA0003747970340000711
Figure BDA0003747970340000721
Figure BDA0003747970340000731
Figure BDA0003747970340000741
实施例
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应被解释为限制性的。
实施例1——抗体和细胞系
抗体表达构建体
为了表达本文使用的人抗体和人源化抗体，通过基因合成(GeneArt GeneSynthesis；ThermoFisher Scientific)制备可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列并克隆到含有人IgG重链恒定区(HC)(恒定区人IgG1m(f)HC：SEQ ID NO:20)和/或人κ轻链恒定区(LC)：SEQ ID NO:37的pcDNA3.3表达载体(ThermoFisher Scientific)中。通过基因合成引入期望的突变。本申请中的CD38抗体具有衍生自先前描述的CD38抗体IgG1-A(WO 2006/099875 A1、WO2008/037257A2、WO 2011/154453 A1；VH:SEQ ID NO:10；VL:SEQ ID NO:11)、IgG1-B(WO 2006/099875 A1、WO 2008/037257 A2、WO 2011/154453A1；VH：SEQ ID NO:8；VL：SEQ ID NO:9)和IgG1-C(WO 2011/154453 A1；VH：SEQ ID NO:1；VL：SEQ ID NO:5)的VH和VL序列。人IgG1抗体b12，一种HIV gp120特异性抗体，在一些实验中用作阴性对照(Barbas et al.,J Mol Biol.1993Apr 5；230(3):812-23；VH：SEQ ID NO:12；VL：SEQ IDNO:16)。
瞬时表达抗体构建体
基本上如Vink等人(Vink et al.,2014Methods 65(1):5-10)所述，使用293fectin(Life Technologies)将编码抗体重链和轻链两者的质粒DNA混合物瞬时转染到Expi293F细胞(Gibco，目录号A14635)中。通过在280nm处的吸光度测量上清液中的抗体浓度。含有抗体的上清液直接用于体外测定，或者如下所述纯化抗体。
抗体纯化和质量评估
通过蛋白A亲和层析纯化抗体。将培养物上清液通过0.20μM死端过滤器过滤并加载到5mL MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)上，清洗和用0.02M柠檬酸钠-NaOH，pH 3洗脱。在纯化后立即将洗脱物加载到HiPrep脱盐柱(GE Healthcare)上，并将抗体缓冲剂交换到12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl、pH7.4缓冲剂(B.Braun或Thermo Fisher)中。缓冲剂交换后，样品通过0.2μm死端过滤器进行无菌过滤。纯化的蛋白质通过多种生物分析测定法，包括月桂基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(CE-SDS)上的毛细管电泳和高性能尺寸排阻色谱法(HP-SEC)进行分析。通过280nm处的吸光度测量浓度。纯化的抗体贮存在2-8℃。
实施例中使用的细胞系描述于下表2中。通过定量流式细胞术(Qifi，DAKO)确定每个细胞的CD38和CD59分子的平均数量。
表2.细胞系和CD38和CD59表达概述
Figure BDA0003747970340000761
Figure BDA0003747970340000771
ABC＝每个细胞结合的抗体
细胞系的起源/来源如下：
Figure BDA0003747970340000772
实施例2——CD38抗体与在细胞表面上表达的人和食蟹猴CD38的结合
通过流式细胞术测定与Daudi和NALM16细胞和来自食蟹猴的PBMC上的细胞表面表达的CD38的结合。将重悬浮于含有0.2％BSA的RPMI中的细胞以100,000个细胞/孔接种在聚苯乙烯96孔圆底板(Greiner bio-one)中，并在300xg、4℃下离心3分钟。添加CD38或对照抗体的连续稀释物(最终抗体浓度为0.005-10μg/mL，以3倍连续稀释)，并将细胞在4℃下温育30分钟。使用FACS缓冲剂(PBS/0.1％BSA/0.01％叠氮化钠)将板清洗/离心两次。接下来，将细胞与在PBS/0.1％BSA/0.01％叠氮化钠中以1/100稀释的R-藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗人IgGF(ab’)2(Jackson)或FITC缀合的山羊抗人IgG(Southern Biotech)在4℃下温育30分钟，用于分析食蟹猴PBMC。使用FACS缓冲剂将细胞清洗/离心两次，重悬浮于FACS缓冲剂中，并通过使用FACS_Fortessa(BD)确定平均荧光强度进行分析。在GraphPad Prism V6.04软件(GraphPad Software)中使用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量-响应)分析生成结合曲线。
图2显示CD38抗体IgG1-B、IgG1-C和IgG1-A与表达CD38的NALM16细胞剂量依赖性地结合。将六聚化增强E430G突变引入这些抗体不影响结合。
图3显示CD38抗体IgG1-A-E430G，而不是IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G，与在食蟹猴PBMC(A)上表达的CD38剂量依赖性地结合。描绘了与在食蟹猴B、T和NK细胞上表达的CD38的平均结合，基于FSC和SSC进行门控。作为阳性对照，还描绘了与表达高拷贝数人CD38的Daudi细胞的结合(B)。
实施例3——E430G突变的CD38抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)
肿瘤细胞系上的CDC
将Daudi、Wien133、Ramos、NALM16、U266和RC-K8细胞重悬浮在含有0.2％BSA的RPMI中，并以1x105个细胞/孔(40μL/孔)的密度铺板到聚苯乙烯96孔圆底板(Greiner bio-one)中。将CD38抗体和同种型对照Ab连续稀释(最终抗体浓度0.0002-10μg/mL，以3x连续稀释)，并每孔添加40μL稀释的Ab。将细胞和Ab在室温下预温育20分钟，然后将20μL的合并正常人血清(Sanquin)添加到每个孔中，并在37℃下温育另外的45分钟。之后，将板离心(3分钟，1200rpm)并弃去上清液。将细胞沉淀物重悬浮在补充有0.25μM topro-3碘化物(LifeTechnologies)的FACS缓冲剂中，并通过测量FACS_Fortessa(BD)上topro-3碘阳性细胞的百分比来检测裂解。CDC描述为百分比裂解。显示的数据为N＝3(Daudi和NALM16)、N＝2(Wien133和U266细胞)或N＝1(RC-K8和Ramos)。同种型对照抗体仅包含在Daudi和Wien133细胞上。
图4表明不具有E430G突变的CD38抗体B、C和A诱导Ramos和Daudi细胞的约85％、约50％和0％裂解。对于任何其他测试的细胞系，均未观察到这些CD38抗体的显著裂解。在这些CD38抗体中引入E430G突变导致在显著更低的抗体浓度下更高的CDC活性。具有E430G突变的所有3种抗体均诱导Ramos和Daudi细胞高达100％的裂解。此外，在CD38表达较低的细胞系上，E430G突变的CD38抗体能够诱导最大(Wien133)或部分(NALM16和U266)CDC，而没有E430G突变的CD38抗体不诱导CDC。这些结果表明，与没有E430G突变的CD38抗体相比，具有E430G突变的CD38 Ab诱导更强的CDC并且需要更少的CD38表达。在CD38表达水平较低的肿瘤细胞(NALM-16、RS4；11和REH)中，与IgG1-B-E430G相比，IgG1-C-E430G显示出更低的EC50值。
表3.裂解的EC50值
一些细胞系仅测试一次(Ramos、RS4；11、REH)
Figure BDA0003747970340000791
用衍生自B细胞肿瘤，包括DLBCL、伯基特淋巴瘤、FL、MCL、B-ALL、CLL或MM的许多其他肿瘤细胞系以及抗体IgG1-B、IgG1-B-E430G、IgG1-C-E430G、IgG1-A-E430G和同种型对照抗体重复上述CDC测定法。将百分比裂解针对抗体浓度作图，并使用Graphpad Prism(GraphPad Software,Inc；版本8.1.0)软件计算最大百分比裂解和EC50值并显示在表4中。结果也显示在图14中。
图14证明野生型CD38 mAb IgG1-B诱导高CD38表达细胞系；SU-DHL-8、Oci-Ly-7、Oci-Ly-19、Ramos、Daudi、Oci-Ly-18和Raji的裂解；但对于在膜上表达较少CD38分子的任何其他细胞系则不然。在IgG1-B中引入E430G突变导致对野生型IgG1-B已经敏感的细胞系在显著更低的Ab浓度下的更高CDC活性，并导致对IgG1-B诱导的CDC不敏感的具有较低CD38拷贝数的其他细胞系(例如：DOHH2、SU-DHL-4、WSU-DLCL2、Z-138、JVM-13、REH、Jeko-1、Wien-133、697、RS4；11、NALM-16和JVM-3)的裂解。一些CD38表达非常低(RC-K8和Pfeiffer)或CD59表达非常高(DB和Granta-519)的细胞系在暴露于IgG1-B和IgG1-B-E430G时没有显示出裂解。在几乎所有测试的细胞系中，与IgG1-B-E430G相比，IgG1-C-E430G在较低抗体浓度下诱导细胞裂解，而IgG1-A-E430G在高得多的Ab浓度下诱导裂解。表4中IgG1-A-E430G的较高EC50值也反映了这一点。这表明，与野生型CD38抗体相比，E430G突变的CD38 mAb诱导更强的CDC，并在CD38表达水平较低的肿瘤细胞上诱导CDC，其中野生型CD38型抗体不诱导CDC。此外，E430G突变的CD38抗体诱导CDC的效力可能在不同的CD38靶向抗体克隆之间变化。
图15显示了表4中描绘的一些EC50值的汇总。显示了由抗体IgG1-B、IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G在20种不同B细胞肿瘤细胞系上诱导的CDC的EC50值。每个正方形、三角形或圆形代表不同的B细胞肿瘤细胞系。不包括用AML细胞系获得的EC50值，因为没有在AML细胞系上测试IgG1-B-E430G。
还在急性髓系白血病(AML)细胞系选择上评估了IgG1-C-E430G的CDC(图16)。如上所述对B细胞肿瘤细胞系进行，唯一的区别是肿瘤细胞系。
图16表明IgG1-C-E430G在所有表达CD38的AML细胞系中诱导了CDC，而在CD38阴性AML细胞系中未观察到CDC。与IgG1-B相比，IgG1-C-E430G的CDC以低得多的EC50值发生，而与IgG1-B相比，IgG1-C-E430G的最大细胞裂解更高(表4)。
此外，在其他多发性骨髓瘤(MM)细胞系上评估了IgG1-C-E430G的CDC(图23)。如上所述对B细胞肿瘤细胞系进行实验，唯一的区别是肿瘤细胞系。
图23表明IgG1-C-E430G诱导了高达100％的LP-1细胞裂解。在具有较低CD38表达水平的NCI-H929细胞上，IgG1-C-E430G诱导部分CDC，而在2个MM细胞系OPM-2和ARH77中未观察到CDC。在2个敏感的MM细胞系中，与IgG1-B相比，由IgG1-C-E430G诱导的CDC以较低的EC50值发生，而在NCI-H929细胞系中，与IgG1-B相比，IgG1-C-E430G的最大细胞裂解更高。(表4)。
表4.最大裂解和裂解的EC50值
Figure BDA0003747970340000811
Figure BDA0003747970340000821
ND＝未确定；NT＝未测试
还确定了使用T调节细胞通过野生型和E430G突变的CD38抗体诱导CDC。如实施例8中所述生成T调节细胞(来自T调节细胞的CD38的胞啃作用)并在如上文所述的CDC测定法中对肿瘤细胞系进行测试。裂解百分比与EC50值一起显示在图17中。
图17表明IgG1-B几乎不诱导T调节细胞的裂解；而IgG1-B-E430G和IgG1-C-E430G诱导T调节细胞的裂解，其中IgG1-C-E430G与IgG1-B-E430G相比显示出更低的EC50值。
全血中的CDC
将来自健康供体的全血收集在水蛭素管中，以防止凝血而不干扰生理钙水平(CDC所需)。将50μL/孔铺板到96孔平底组织培养板(Greiner bio-one)中。CD38抗体和对照Ab在含有0.2％BSA(最终抗体浓度为0.016-10μg/mL，5x连续稀释)的RPMI中连续稀释，并且每孔添加50μL稀释的Ab，并在37℃下温育过夜。作为B细胞上CDC的阳性对照，在有和没有60μg/mL艾库组单抗(eculizumab)的情况下测试了CD20 Ab IgG1-7D8以阻断CDC。将细胞转移至聚苯乙烯96孔圆底板(Greiner bio-one，离心)，离心(3分钟，1200rpm)并用每孔150μL PBS(B.Braun)清洗一次。细胞沉淀物重悬浮在具有1000x稀释的胺反应性存活力染料(BD)的80μL PBS中，并在4℃下温育30分钟。接下来，用150μL PBS清洗细胞，并在4℃下与80μL含有淋巴细胞表型抗体混合物的PBS(1:200小鼠抗人CD3-EF450[OKT3，ebioscience]、1:50小鼠抗人CD19-BV711[HIB19，Biolegend]和1:100小鼠抗人CD56-PE/CF594[NCAM16.2，BD])温育30分钟。用150μL PBS清洗细胞，并在4℃下与150μL红细胞裂解溶液(10mM KHCO3[Sigma]、0.01mM EDTA[Fluka]、155mM NH4Cl[Sigma]溶解在1L的H2O[B.Braun]中并调整至pH 7.2)温育10分钟。用150μL FACS缓冲剂清洗细胞，重悬浮在100μL FACS缓冲剂中并在FACS_Fortessa(BD)上进行分析。活NK细胞(CD56pos、CD3neg和胺反应性存活力染料neg)、T细胞(CD3pos和胺反应性存活力染料neg)和B细胞(CD19pos和胺反应性存活力染料neg)的数量描绘于图5中。显示的数据来自所测试的5个中的1个代表性供体。
图5表明含有E430G突变的CD38抗体诱导健康血液淋巴细胞的最小CDC。阳性对照CD20 Ab IgG1-7D8表现出CD20阳性B细胞的特异性CDC，其由CDC抑制剂艾库组单抗完全阻断。野生型IgG1 CD38抗体不诱导B、T和NK细胞的CDC。在与含有E430G突变的克隆B和C温育后，对于NK细胞观察到一些CDC(用IgG1-B-E430G在最高浓度下约40％的NK细胞裂解)，但B和T细胞则不然。
总体而言，这些结果表明E430G突变的CD38抗体针对具有可变CD38表达的一组肿瘤细胞系具有广泛的CDC活性。还针对从健康供体获得的淋巴细胞测试了具有E430G突变的CD38抗体，并显示仅诱导至多40％的NK细胞裂解。NK细胞表达平均15,000个CD38/细胞，这与MM细胞系U266相似。两种细胞类型对E430G突变的CD38抗体产生的CDC的敏感性相同，表明E430G突变的CD38抗体的CDC与CD38表达相关。不受理论限制，基于这些数据，相信E430G突变的CD38抗体的CDC的阈值为约15,000个CD38分子/细胞。虽然大多数B细胞肿瘤细胞系表达在15,000-400,000个CD38分子/细胞范围内的较高水平的CD38，但是健康淋巴细胞仅表达2,000-15,000个CD38分子/细胞，这使得这些细胞不易受到E430G突变CD38抗体的CDC伤害。
实施例4——E430G突变的CD38抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
E430G突变的CD38抗体诱导抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)的能力通过铬释放测定法确定。将Daudi细胞收集(5x106个细胞/mL)在2mL培养基(补充有0.2％BSA的RPMI1640)中，其中添加了100μCi 51Cr(铬-51；Perkin Elmer)。将细胞在37℃的水浴中在摇动的情况下温育1小时。清洗细胞(在PBS中两次，1500rpm，5分钟)后，将细胞重悬浮在培养基中并通过台盼蓝排斥法(trypan-blue exclusion)计数。将细胞稀释至1x105个细胞/mL的密度并移液到96孔圆底微量滴定板(Greiner Bio-One)和添加在培养基中稀释的50μL浓度系列(终浓度为0.005-10μg/mL，3倍稀释)的CD38或同种型对照抗体。将细胞与Ab在室温(RT)下预温育15分钟。
同时，根据制造商的说明，使用淋巴细胞分离培养基(Bio Whittaker)从45mL新鲜抽取的肝素血(血沉棕黄层)中分离来自健康志愿者(Sanquin)的外周血单个核细胞(PBMC)。在培养基中重悬浮细胞后，通过台盼蓝排斥法计数细胞并稀释至1x107个细胞/mL的密度。
靶细胞与Ab预温育后，添加50μL效应细胞，导致100:1的效应物与靶物的比率。细胞在37℃和5％CO2下温育4小时。为了确定最大裂解，将50μL 51Cr标记的Daudi细胞(5,000个细胞)与100μL 5％Triton-X100一起温育；为了测定自发裂解(背景裂解)，将5,000个51Cr标记的Daudi细胞在150μL没有任何抗体或效应细胞的培养基中温育。通过将5,000个Daudi细胞在没有抗体的情况下与500,000个PBMC一起温育来确定不依赖于抗体的细胞裂解水平。将板离心(1200rpm，10分钟)并将75μL上清液转移到微量管中，然后使用伽马计数器对释放的51Cr进行计数。抗体介导的裂解的百分比计算如下：
％特异性裂解＝(cpm样品-cpm自发裂解)/(cpm最大裂解-cpm自发裂解)其中cpm是每分钟的计数。
图6显示所有CD38 Ab均能够诱导Daudi裂解，如与同种型对照(IgG1-b12-E430G)相比对CD38 Ab看到的裂解增加所指示。已经在最低抗体浓度下注意到细胞裂解，表明抗体应进一步稀释以观察剂量依赖性效应。与野生型抗体相比，包含E430G突变的CD38抗体显示出较低的最大裂解。
用来自不同健康志愿者的外周血单个核细胞(效应细胞)、以下靶细胞：Daudi、Wien-133、Granta519和MEC-2以及抗体IgG1-B-E430G、IgG1-B、IgG1-C-E430G、IgG1-C和IgG1-b12-E430G重复上述铬释放测定法。结果在图18中所示。
图18显示所有CD38 Ab均能够诱导Daudi、Wien-133、Granta519和MEC-2细胞的裂解，如与同种型对照(IgG1-b12-E430G)相比对CD38 Ab看到裂解增加所指示。在大多数情况下，看到剂量依赖性靶细胞裂解，但在不同的PBMC供体之间观察到一些变化。
使用检测作为ADCC替代者的FcγRIIIa(CD16)交联的发光ADCC报告物生物测定法(Promega，目录号G7018)，进一步评估了CD38抗体诱导ADCC的能力。作为效应细胞，试剂盒提供Jurkat人T细胞，这些细胞经过工程化改造以稳定表达高亲和力FcγRIIIa(V158)和驱动萤火虫萤光素酶表达的活化T细胞核因子(NFAT)反应元件。简而言之，将Daudi或T调节细胞(5,000个细胞/孔)接种在384孔白色Optiplates(Perkin Elmer)中的ADCC测定缓冲剂[补充有3.5％低IgG血清的RPMI-1640培养基[(Lonza，目录号BE12-115F)]中并在37℃/5％CO2下温育6小时，总体积为30μL，其含有抗体浓度系列(终浓度为0.5-250ng/mL，3.5倍稀释)和解冻的ADCC生物测定效应细胞。在将板调节至室温(RT)15分钟后，添加30μL Bio Glo测定萤光素酶试剂，并将板在室温下温育5分钟。通过EnVision多标记读数器(PerkinElmer)上的发光读数对萤光素酶的产生进行量化。从仅添加靶细胞和抗体(无效应细胞)的孔中测定背景水平。作为阴性对照，使用仅含有靶细胞和效应细胞(不含抗体)的孔。
图7显示了用Daudi细胞获得的结果，这表明CD38抗体在诱导剂量依赖性FcγRIIIa交联上非常有效，如在报告物测定法中所确定。与各自的野生型抗体相比，含有E430G突变的CD38抗体显示出较低的最大交联，这与铬释放测定法获得的结果一致。
图19显示了用T调节细胞获得的结果，这表明CD38抗体在诱导剂量依赖性FcγRIIIa交联上非常有效，如在报告物测定法中所确定。与各自的野生型抗体相比，含有E430G突变的CD38抗体显示出较低的最大交联。
实施例5——E430G突变CD38抗体的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)
E430G突变的CD38抗体诱导抗体依赖性细胞吞噬作用的能力改编自OverdijkM.B.et al.mAbs 7:2,311-320。根据制造商的说明，使用淋巴细胞分离培养基(BioWhittaker)从健康志愿者(Sanquin)中分离PBMC来获得巨噬细胞。使用Dynabeads未接触人单核细胞分离试剂盒(Invitrogen)通过负选择从PBMC中分离单核细胞。将分离的单核细胞在补充有50ng/mL GM-CSF(Invitrogen)的无血清树突细胞培养基(CellGenix Gmbh)中培养3天，然后在补充有100ng/mL GM-CSF的无血清树突细胞培养基中培养2天，以诱导巨噬细胞分化。使用versene(Life Technologies)和细胞刮擦使分化的巨噬细胞脱附，并通过用CD1a-FITC(BD)、CD14-PE/Cy7(BD)、CD40-APC/H7(BD)、CD80-APC(Miltenyi biotec)、CD83-PE(BD)和CD86-PerCP-Cy5.5(Biolegend)染色进行流式细胞术表征。将巨噬细胞以每孔100,000个细胞接种到96孔平底培养板(Greiner bio-one)中，并使其在37℃下在补充有100ng/mL GM-CSF的无血清树突细胞培养基中粘附过夜。
根据制造商的说明，用PKH-26(Sigma)标记靶细胞(Daudi)，用10μg/mL CD38抗体调理(在4℃下30分钟)，用FACS缓冲剂清洗3次，并以5:1的效应物:靶物(E:T)比率添加到巨噬细胞中。将板以300rpm短暂旋转以使效应细胞和靶细胞极其靠近并在37℃下温育45分钟。接下来，使用versene收集巨噬细胞并用CD14-BV605(biolegend)和CD19-BV711(biolegend)染色。吞噬作用描绘为在流式细胞仪(BD)上测量的CD14阳性巨噬细胞的百分比，这些巨噬细胞也对PKH-26呈阳性，但对CD19呈阴性(以排除仅附着于Daudi细胞的巨噬细胞)。
图8显示所有CD38 Ab均能够诱导Daudi细胞的ADCP，如与同种型对照(IgG1-b12和IgG1-b12-E430G)相比对CD38 Ab看到的PKH-29pos、CD14pos和CD19neg巨噬细胞百分比增加所指示。根据所使用的供体，与野生型抗体相比，含有E430G突变的CD38抗体显示出更高百分比的PKH-29pos、CD14pos和CD19neg巨噬细胞，表明通过引入E430G突变可以增加CD38-Ab介导的吞噬作用。
实施例6——CD38抗体对肿瘤细胞系的凋亡的诱导
通过将肿瘤细胞系与CD38抗体温育过夜，然后在流式细胞仪上进行活/死分析来研究CD38抗体的凋亡诱导。将重悬浮于含有0.2％BSA的RPMI中的细胞以100,000个细胞/孔接种在96孔平底组织培养板(Greiner bio-one)中。在不存在或存在10μg/mL山羊抗人IgG1(Jackson)的情况下添加CD38或对照抗体的连续稀释物(最终抗体浓度为0.01-10μg/mL，4x连续稀释)，以提供额外的Fc交联。细胞在37℃下温育过夜，使用FACS缓冲剂(PBS/0.1％BSA/0.01％叠氮化钠)清洗/离心两次，并重悬浮在补充有1:4000稀释的Topro-3-碘(LifeTechnologies)的FACS缓冲剂中。在FACS_Fortessa(BD)上分析细胞活力并描述为凋亡(topro-3-碘阳性)细胞的百分比。
图9显示野生型和E430G突变的CD38抗体不单独诱导凋亡，但添加Fc交联抗体导致约30％的凋亡。野生型和E430G突变的CD38抗体之间没有看到差异。
实施例7——在不存在PBMC的情况下对CD38酶活性的抑制
抑制CD38环化酶活性
CD38是将NAD转化为cADPR和ADPR的外酶(ecto-enzyme)。这些活性取决于H2O的存在。当H2O存在时，NAD转化为ADPR(糖水解酶活性)，而cADPR转化为ADPR(水解酶活性)。约95％的NAD通过(糖)水解酶活性转化为ADPR。在不存在H2O的情况下，CD38利用其环化酶活性将NAD转化为cADPR。为了测量对CD38酶活性的抑制作用，使用经CD38处理后变成荧光的NAD衍生物。
图10例示了CD38的酶活性。
首先，使用烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸钠盐磷酸二酯酶(NGD，Sigma)作为CD38的底物测量CD38环化酶活性的抑制。作为CD38的来源，使用了具有不同CD38表达水平的肿瘤细胞系以及带his标签的重组CD38胞外域(hisCD38)。收获肿瘤细胞(Daudi和Wien133)并用20mMTris-HCL清洗。将细胞重悬浮在20mM Tris-HCL中，并将200,000个细胞/孔在100μL/孔中接种于96孔白色不透明板(Perkin Elmer)中。HisCD38以0.6μg/mL在100μL/孔20mM Tris-HCL中接种。CD38抗体在20mM Tris-HCL中稀释至100μg/mL，然后将10μL添加到细胞和hisCD38(最终浓度为9μg/mL)并在室温下温育20分钟。对照孔用b12抗体而不是CD38抗体温育，或者根本没有抗体温育。接下来，将在20mM Tris-HCL中稀释的10μL(80μM)NGD添加到板中，并立即在Envision多标记读数器(Perkin Elmer)上使用340nm激发和430nm发射测量荧光。通过在图11中指示的时间点测量荧光，实时跟踪NGD的转化，直到达到平台期。对于hisCD38，每3分钟测量荧光，持续27分钟，对于Daudi细胞，在5、15、30、60、120和185分钟后测量荧光，对于Wien133，在5、15、30、60、150、220、300和360分钟后测量荧光。CD38环化酶活性的抑制描述为与对照相比的百分比抑制，其中对照是具有hisCD38和NGD但没有Ab的样品。为每个测试条件描绘一个代表性实验。
图11A表明NGD通过hisCD38环化酶活性迅速转化。约9分钟后转化完成。在CD38 AbB存在下，NGD转化的最大百分比降低了约25％，在CD38Ab C存在下，NGD转化的最大百分比降低了约50％，而CD38 Ab A对NGD的总周转没有影响。CD38环化酶活性的抑制不受E430G突变存在的影响。在图11B和11C中看到了类似的结果，其中测量了由Daudi和Wien133细胞上存在的CD38进行的NGD转化。NGD转化的动力学在Daudi，尤其是Wien133细胞上稍慢，这可能与存在的CD38分子较少有关。然而，Ab B诱导了CD38环化酶活性的25％抑制(约25％抑制)，而Ab C诱导了CD38环化酶活性的约40％抑制，而Ab A显示无效果。野生型抗体和E430G突变抗体显示了相似的结果，表明E430G突变不影响抗体介导的对CD38环化酶活性的抑制。
实施例8——E430G突变的CD38抗体的抗体依赖性胞啃作用
E430G突变的CD38抗体对Daudi细胞的胞啃作用
评估了E430G突变的CD38抗体诱导对Daudi细胞的胞啃作用的能力。根据制造商的说明，使用淋巴细胞分离培养基(Bio Whittaker)通过从健康志愿者(Sanquin)中分离PBMC来获得巨噬细胞。使用Dynabeads未接触人单核细胞分离试剂盒(Invitrogen)通过负选择从PBMC中分离单核细胞。将分离的单核细胞在补充有50ng/mL GM-CSF(Invitrogen)的无血清树突细胞培养基(CellGenix Gmbh)中培养3天，然后在补充有100ng/mL GM-CSF的无血清树突细胞培养基中培养2天，以诱导巨噬细胞分化。使用versene(Life Technologies)和细胞刮擦使分化的巨噬细胞脱附，并通过用CD1a-FITC(BD)、CD14-PE/Cy7(BD)、CD40-APC/H7(BD)、CD80-APC(Miltenyi biotec)、CD83-PE(BD)和CD86-PerCP-Cy5.5(Biolegend)染色进行流式细胞术表征。将巨噬细胞以每孔100,000个细胞接种到96孔平底培养板(Greinerbio-one)中，并使其在37℃下在补充有100ng/mL GM-CSF的无血清树突细胞培养基中粘附过夜。
根据制造商的说明，用PKH-26(Sigma)标记靶细胞(Daudi)，用10μg/mL CD38抗体调理(在4℃下30分钟)，用FACS缓冲剂清洗3次，并以5:1的效应物:靶物(E:T)比率添加到巨噬细胞中。将板以300rpm短暂旋转，使效应细胞和靶细胞极其靠近，并在37℃下温育45分钟。
图21说明了用于测量胞啃作用的测定设置。
通过分别与FITC缀合的CD38克隆A和山羊抗人IgG-FITC(Southern Biotech)温育，在Daudi细胞上测定CD38表达和人IgG染色。CD38克隆A用于染色CD38，因为与克隆B和C相比，此Ab识别CD38上的非重叠表位。
图12显示Daudi细胞上的CD38表达在与巨噬细胞和CD38抗体共培养45分钟后显著降低。CD38表达的降低在E430G突变的CD38抗体中最强。在抗体调理的Daudi细胞上对人IgG染色也看到了相同的趋势。
E430G突变的CD38抗体对T调节细胞的胞啃作用
与具有中等CD38表达的Treg相比，具有高CD38表达的T调节细胞(Treg)具有更强的免疫抑制性(Krejcik J.et al.Blood 2016 128:384-394)。因此，降低Treg上CD38表达的策略可能降低这些细胞的免疫抑制作用。我们研究了E430G突变的CD38抗体是否可以通过胞啃作用降低Treg上的CD38表达。根据制造商的说明，使用淋巴细胞分离培养基(BioWhittaker)从健康志愿者(Sanquin)的PBMC中分离Treg。根据制造商的说明，使用Treg分离试剂盒(Miltenyi)通过负选择从PBMC中分离CD4+T细胞，然后富集CD4+CD25+T调节细胞。随后，在补充有5％人血清(Sigma)、1000U/mL IL-2(peprotech)、100ng/mL雷帕霉素(Sigma)和4:1珠:细胞比率的CD3/CD28包被的珠(Gibco)的无血清树突细胞培养基中以5x104个细胞/mL将Treg在37℃下扩增20天。每3到4天，使用补充有1000U/mL IL-2和100ng/mL雷帕霉素的无血清树突细胞培养基将细胞密度调整到5x105个细胞/mL。使用用以下抗体进行的流式细胞术染色随时间跟踪T调节表型：CCR7-BV785(Biolegend)、CD62L-FITC(BD)、CD4-APC/efluor780(e-biosciences)、CD25-PerCP/Cy5(Biolegend)、Foxp3-PE/CF594(BD)、CTLA4-efluor660(e-biosciences)、CD127-PE/CY7和CD38-GV605(Biolegend)。
为了评估Ab诱导的来自Treg的CD38胞啃作用，将Treg(靶细胞)与PBMC(效应细胞)共培养，并监测Treg上的CD38表达。简而言之：根据制造商的说明，使用淋巴细胞分离培养基(Bio Whittaker)从血沉棕黄层(Sanquin)中分离PBMC，并以每孔5x105个细胞的密度接种到补充有0.2％BSA的RPMI-1640培养基(Lonza)中并培养3天以允许单核细胞粘附。根据制造商的说明，用0.25μM CellTrace far red(CTFR)标记Treg，并在37℃下与E430G突变的CD38 Ab预温育10分钟。清洗Treg并将每孔1x105 Ab调理的细胞转移到具有PBMC的板中。将PBMC和Treg以300rpm短暂旋转，使细胞极其靠近，并在37℃下温育23小时。CD38的胞啃作用通过使用流式细胞术在CTFR阳性Treg上用FITC缀合的CD38克隆A分析CD38表达来测量。
图13显示在与E430G突变的CD38抗体和PBMC温育后，T调节细胞上的CD38表达降低。在没有PBMC的情况下，看到T调节细胞上CD38表达的无减少，强烈表明胞啃作用。此外，在存在PBMC的情况下，IgG1-B不诱导CD38的胞啃作用，而E430G突变的B和C诱导CD38表达的强烈降低。这表明E430G突变的CD38抗体诱导CD38的胞啃作用增强。
实施例9——E430G突变的CD38抗体C在患者衍生的弥漫性大B细胞淋巴瘤模型中的抗肿瘤活性
将患者衍生的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞皮下接种到CB17.SCID小鼠中，并在肿瘤达到约150-250mm3的平均体积时开始抗体治疗(每周2次剂量的5mg/kg IgG1-C-E430G，静脉内注射；使用PBS作为阴性对照)。使用卡尺在二维上测量肿瘤体积，并使用以下公式以mm3表示体积：V＝(L x W x W)/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长肿瘤尺寸)，W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤尺寸)，并在图20中随时间描绘。每个治疗组由单只小鼠组成。为了计算响应值，使用以下公式；(第X天时IgG1-C-E430G处理的小鼠的肿瘤体积-第0天时IgG1-C-E430G处理的小鼠的肿瘤体积)/(第X天时对照小鼠的肿瘤体积-第0天时对照小鼠的肿瘤体积)。
X＝第7天至第25天期间两只动物均存活并进行肿瘤测量的最后一天。
表5中描绘了响应值以及CD38 mRNA表达。具有最高CD38 mRNA水平的模型也显示出最佳响应。这也可以从图20中的图表中看出。因此，每周两次剂量的IgG1-C-E430G在具有最高CD38 mRNA表达的五个所测试DLBCL PDX模型的两个中减少了肿瘤生长。
表5五个DLBCL PDX模型的CD38 mRNA表达和计算的响应值的概述。低响应值表明肿瘤消退。
Figure BDA0003747970340000911
实施例10——IgG1-C-E430G在来自新诊断的MM患者的骨髓单个核细胞中诱导有力的补体介导的细胞毒性
通过Ficoll-Hypaque密度梯度从3名新诊断的MM患者和1名复发/难治性MM患者的全骨髓抽吸物中分离骨髓单个核细胞(BM-MNC)，并在-80℃下冷冻直至使用。在使用当天，将BM-MNC解冻，计数活细胞并铺板在96孔板中。将细胞与IgG1-C-E430G或
Figure BDA0003747970340000912
的连续稀释物(0.01-10μg/mL)在室温下在板振荡器上温育15分钟。作为阴性对照，细胞未经处理或用10μg/mL IgG1-b12温育。作为补体的来源，在FACS测量前45分钟添加20％正常人血清，其中使用流式细胞计数珠作为常数来确定细胞的绝对数量。为了测定总体裂解百分比，使用未处理的对照孔作为对照值。使用以下等式相对于对照确定百分比多发性骨髓瘤细胞裂解：
％细胞裂解＝(1-(抗体处理样品中存活细胞的数量/未处理对照中存活细胞的数量)x100％
图22A和B显示，与
Figure BDA0003747970340000913
相比，IgG1-C-E430G在来自新诊断的MM患者的两份BM-MNC样品中诱导更高水平的裂解。与
Figure BDA0003747970340000914
诱导的31-55％范围内的最大裂解相比，由IgG1-C-E430G诱导的最大裂解范围为84-90％。在另外两份BM-MNC样品中，一个来自未接受
Figure BDA0003747970340000915
作为先前疗法的部分的复发/难治性MM患者(图22C)并且一个来自新诊断的MM患者(图22D)，IgG-C-E430G或
Figure BDA0003747970340000916
未发现CDC的诱导(图22C和D)。
实施例11——抗体配制剂
进行了研究以评估缓冲剂身份、溶液pH和赋形剂对IgG1-C-E430G蛋白质稳定性的影响。具有包含SEQ ID NO:1的VH、包含SEQ ID NO:5的VL、包含SEQ ID NO:46的CH和包含SEQ ID NO:37的CL的IgG1-C-E430G在CHO细胞中表达。
方法
生物物理研究：
一项生物物理研究评估了不同缓冲剂/赋形剂/pH组合中的IgG1-C-E430G(2mg/mL)。为研究制备了两种缓冲剂类型(乙酸盐和组氨酸)，在5.5-6.5之间的pH，以及四种类型的赋形剂(NaCl、精氨酸、蔗糖、山梨糖醇)(表5)。
通过差示扫描荧光测定法(DSF)评估IgG1-C-E430G的热稳定性和构象稳定性，并通过动态光散射(DLS)确定聚集体谱和粒径测量(particle sizing)。
表5.生物物理研究(BS)配制剂
Figure BDA0003747970340000921
物理应激和表面活性剂研究：
在生物物理研究之后，评估了6种选择的配制剂，以确定在IgG1-C-E430G的冻融循环和摇动期间提供的保护。还通过将聚山梨酯80(PS80)添加到6种配制剂中的每一种来评估配制剂中表面活性剂的作用，得到总共12种用于评估的配制剂(表6)。
通过离心过滤将IgG1-C-E430G缓冲剂交换为6种配制剂，并在台式平板振荡器上以400RPM进行5次冻融循环或48小时摇动。第三组样品在室温下放置在工作台上48小时，用作对照。对于表面活性剂配制剂，在更换缓冲剂后添加PS80。
使用以下分析技术分析样品：外观、尺寸排阻色谱(SEC)、A280、DLS和A550。
表6.物理应激研究(PSS)配制剂
Figure BDA0003747970340000931
稳定性研究：
选择表7中所示的配制剂用于在标称(2-8℃)和加速(25℃/60％相对湿度(RH)和40℃/75％RH)条件下评价20mg/mL下的IgG1-C-E430G长达12周。为确认在物理应激后最佳配制剂的产品质量，在初始条件下，一个另外的样品经历了五个冻融循环，并且一个样品经历了摇动(400RPM下48小时)。
使用了以下分析技术：外观、pH测定；A280(单次重复)、SEC、成像毛细管等电聚焦(icIEF)以及还原和非还原毛细管电泳。
表7.稳定性研究配制剂
抗体浓度(mg/mL) 配制剂 赋形剂 pH 表面活性剂
20 20mM组氨酸 250mM山梨糖醇 6.0 0.04％PS80
分析方法
差示扫描荧光测定法(DSF)：
DSF分析利用增加的热应激来诱导蛋白质解折叠来评估热稳定性和胶体稳定性。通过环境条件变化时埋藏的疏水残基暴露导致的蛋白质的内在荧光变化来检测由增加的热应激引起的未折叠状态转变。随着色氨酸残基的暴露，最大发射波长移动到更长的波长。绘制了重心平均值(BCM)，即荧光发射光谱均分的波长，显示了蛋白质随温度的构象变化。DSF分析提供了从BCM曲线生成的解折叠起始温度(Tonset)和解链温度(Tm)值。Tonset提供蛋白质开始解折叠时计算的温度。Tm值是计算的蛋白质从折叠状态到未折叠状态的温度依赖性转变中点。
在DSF分析期间，在266nm和473nm处测定静态光散射(SLS)测量值，以评估蛋白质胶体稳定性。用于照射样品的激光的静态光散射强度与同入射光相同数量级的颗粒的存在成正比。因此，该分析对温度斜坡上的蛋白质聚集敏感。静态光散射在266nm处测量，以检测较小的聚集体粒径，以及在473nm处测量，以检测较大的聚集体种类。从这些数据中确定聚集起始温度(Tagg)，这是蛋白质开始聚集的温度。这些数据最好通过计数强度的大变化来分析——更高的计数表明由于蛋白质聚集体的缔合，更多的光已经被散射。随着升高的温度斜坡，SLS计数数据在103标度内的变化通常归因于显著的蛋白质聚集，SLS计数的最小变化归因于部分聚集，并且在温度斜坡上SLS计数没有变化表明蛋白质聚集可忽略。
动态光散射(DLS)：
DLS分析在室温下评估蛋白质大小和聚集。对于DLS分析，确定了散射光的时间自相关函数，并且用数据的单个指数累积量拟合假设单个粒径。累积量拟合用于确定溶液中颗粒的尺寸分布。可报告的值是多分散性和流体动力学半径(直径)。对于由单体的单一分布组成的蛋白质样品，认为该样品是单分散的，然而，对于含有多个粒径群体的样品，认为该样品是多分散的。多分散指数是粒径分布宽度的量度——多分散性指数越高，颗粒分布越宽。因此，通常发现具有高PDI的样品含有更高阶的聚合物或大的聚集体。非球形蛋白质颗粒的流体动力学半径是与颗粒具有相同平移扩散速度的球体的直径。扩散系数取决于颗粒的分子量、表面结构以及配制剂中离子的浓度和类型。单分散尺寸分布中较大的流体动力学半径可以归因于溶液中存在高阶低聚物(例如四聚体)，而不是大聚集体。
对于目前的分析，每个样品的DSF和DLS数据均在Uncle仪器(Unchained Labs)上的相同运行中收集。简而言之，分析了2mg/mL抗体溶液样品(在各自的配制剂缓冲剂中稀释)，通常每次运行48份样品。在通常为25℃的最低温度下收集DLS数据。然后，对于DFS数据，通常以1℃/min开始温度斜坡，并在整个温度斜坡过程中连续测量每个样品的荧光。
视觉外观：
将抗体样品平衡至室温。检查玻璃小瓶以确保它们清洁且没有划痕或异物。如果适用，将1mL样品转移到适当的玻璃小瓶中。使用在类似玻璃小瓶中的1mL水进行比较。相对于在环境实验室照明的干净的白色和黑色背景评估外观。相对于白色背景与水相比评估颜色。相对于白色和黑色背景与水相比评估澄清度。通过轻轻倒置小瓶来评估颗粒，确保没有引入气泡，然后在白色和黑色背景前观察约5秒。
pH：
将样品平衡至室温。通常，将100-250μL样品转移到试管中，在23-27℃下进行pH测量。将pH探针浸入样品中并测量pH。每天校准pH探针。
通过UV A280的蛋白质浓度：
使用UV/Vis分光光度计(Agilent或等同***)通过使用320nm(A320)作为参考波长测量样品在280nm处的吸光度(A280)来确定蛋白质浓度。使用稀释缓冲剂(12.6mM磷酸二氢钠，140mM氯化钠，pH 7.3)将样品稀释至约0.6mg/mL，并转移至UVette一次性比色皿(Eppendorf)。分光光度计使用配制剂缓冲剂作为空白，然后用于测量空白和制备的样品在240至400nm范围内所有波长的吸光度。使用A280和A320的结果以使用Beer-Lambert定律确定总蛋白质浓度。
通过A550的浊度
浊度是使用UV/Vis分光光度计(Agilent 8453或8454或等同***)通过在1cm比色皿(UVette一次性比色皿；Eppendorf)中使用未稀释的材料测量样品在550nm处的吸光度来确定的，没有背景校正。
尺寸排阻色谱(SEC)
使用SEC以评估药物产品的初始纯度以及观察为低分子量(LMW)种类的碎片化程度，和观察为高分子量(HMW)种类的聚集。DAD产生的色谱图的相对峰面积用于确定相对于在单体之前洗脱的(HMW)种类和在单体之后洗脱的(LMW)种类的单体的纯度。该方法报告的结果是％单体纯度、在单体之前洗脱的所有峰的总和为％总HMW种类、在单体之后洗脱的所有峰的总和为％总LMW种类并且所有非单体种类报告为％总杂质。
使用高效液相色谱(HPLC)***(Agilent 1100/1200系列或同等物)用100mM磷酸钠、100mM硫酸钠、pH 6.8流动相和TOSOH TSK-gel G3000SWxl(7.8x 300mm)柱固定相(Sigma)进行通过SEC的纯度评估。样品制备由在流动相中至1.0mg/mL的稀释组成。仪器参数由50μL(50μg加载)的样品注射量、1.0mL/min的流速、27.5℃的柱温、5±3℃的自动进样器温度和20分钟的样品运行时间组成。使用二极管阵列检测器(DAD)在280nm波长和8nm带宽下收集数据。
成像毛细管等电聚焦(icIEF)
使用成像毛细管等电聚焦以确定抗体样品的电荷异质性和等电点。icIEF使用全毛细管UV检测器检测聚焦的蛋白质区域。在icIEF分离过程中，将电压施加到填充有样品、pI(等电点)标志物、甲基纤维素和载体两性电解质的包被毛细管上，允许根据其pI分离蛋白质种类。分离毛细管使用位于阳极(酸性)和阴极(碱性)罐中的中空纤维膜连接到入口和出口毛细管。这允许罐和分离毛细管的内部容积之间的电连通。跨罐施加的高压允许基于电荷的蛋白质种类的分离。该方法用于观察在稳定性研究过程中由于化学变化诸如脱酰胺导致的配制抗体的电荷异质性变化。
在分离结束时捕获的所得电泳图(吸光度相对pH)用于根据每个峰的相对面积与总面积相比的百分比生成电荷异质性结果。该方法报告的结果包括％主峰、％总酸性变体(pI低于主峰的变体)和％总碱性变体(pI高于主峰的变体)。此外，使用已知pI值的两个蛋白质标志物来确定每个峰的pI，并报告主峰的pI。
该分析使用了来自ProteinSimple的cIEF筒(cartridge)和Mauricec IEF化学测试试剂盒。样品和参考标准品在纯化水(MilliQ或等同物)中稀释至3mg/mL。预混物(Mastermix)按照如下所示的组分列表制备，按比例缩放配方以制备足够用于所有样品的体积：
Figure BDA0003747970340000971
然后将10μL样品与90μL预混物混合，将样品稀释至最终浓度(0.3mg/mL)。还使用10μL水代替样品制备空白。根据制造商说明，使用测试试剂盒制备Mauricec IEF***适用性标准品。然后按以下顺序将所有制备物转移到两个Maurice 96孔板中：***适用性、空白、参考标准品、样品制备物。缓冲剂小瓶制备由以下组成：准备ProteinSimple压力加盖的2mL小瓶(其含由0.5mL荧光校准标准品、2mL MilliQ水、2mL 0.5％甲基纤维素)，和空瓶以及具有2mL MilliQ水和透明螺帽的小瓶。然后根据软件中的描述将这些小瓶加载到仪器中。通过将2mL阴极电解液加载至红色端口并将2mL阳极电解液加载至白色端口来制备筒。
毛细管电泳(CE)
在CE中，蛋白质种类在电场的影响下通过凝胶迁移而分离。凝胶含有充当分子筛的交联聚合物网络，较小的分子在凝胶中移动得更快。
SDS用于解折叠蛋白质并施加均匀的电荷以允许在电场中迁移。添加还原剂(DTT)以破坏二硫键。Protein Express Dye与蛋白质结合并在暴露于强光时发出荧光，当片段通过传感器时，仪器会检测到强光。
还原性微芯片毛细管电泳(R CE-SDS)
通过与所有峰的总面积比较每个感兴趣峰的相对面积来确定结果。报告的结果是％轻链(％LC)、％重链(％HC)、％非糖基化重链(％NGHC)、％纯度(％LC+％HC)和％总相关物质/杂质(除％LC和％HC之外的所有峰的总和)。
该分析使用均来自Perkin Elmer的Caliper Lab Chip CXII***、ProteinExpress Assay Lab Chip和Caliper Protein Express Reagent试剂盒，以通过芯片实验室(Lab on a Chip,LoC)毛细管电泳月桂基硫酸钠(CE-SDS)进行纯度评价，使用二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂。在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将样品和参考标准品稀释至1mg/mL。通过将24.5μL 1M DTT在700μL HT Protein Express Sample Buffer中稀释至终浓度为33.8mM来制备还原工作溶液。通过在微量离心管中将5μL稀释样品与7μL还原工作溶液混合，然后以3000x g离心1分钟并在加热块上在70±2℃下加热3分钟来还原样品。然后将样品冷却至室温，接着以3000x g离心1分钟。然后将样品制备物用32μL MilliQ水稀释并转移到96孔板中。使用5μL PBS pH 7.4和相同的样品制备规程制备空白，以确保没有干扰峰。
使用添加到实验室芯片的试剂进行芯片制备。通过将18μL的HT Protein ExpressDye Solution添加到520μL的HT Protein Express Gel Matrix中，然后在提供的旋转过滤器中以9300x g离心5分钟来制备Gel-Dye混合物。通过将250μL的HT Protein Express GelMatrix添加到旋转过滤器中并以9300x g离心5分钟来制备脱色溶液。通过将12μL在100±2℃的加热块上加热5分钟，然后冷却并添加120μL法MilliQ水来制备HT表达梯。将梯转移到0.2mL PCR管中并加载到仪器中的指定位置。芯片制备足以运行96孔板。将芯片和样品板加载到仪器并运行样品。
非还原性微芯片毛细管电泳(NR CE-SDS)
通过与所有峰的总面积比较每个感兴趣峰的相对面积来确定结果。报告的结果是主峰的％纯度、％正面相关物质/杂质(分子量低于主峰的峰)、％背面相关物质/杂质(分子量高于主峰的峰)和％总相关物质/杂质(％TRS/I)。
该分析使用Perkin Elmer Caliper Lab Chip CXII***、Protein ExpressAssay Lab Chip和Caliper Protein Express Reagent试剂盒，以通过芯片实验室(LoC)毛细管电泳月桂基硫酸钠(CE-SDS)进行纯度评价。在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将样品和参考标准品稀释至1mg/mL。通过将122.5μL碘乙酰胺(IAM)在3500μL HT ProteinExpress Sample Buffer中稀释至终浓度为8.5mM来制备非还原工作溶液。通过在微量离心管中将5μL稀释样品与7μL非还原工作溶液混合，然后以3000x g离心1分钟并在加热块上在70±2℃下加热3分钟来制备样品。然后将样品冷却至室温，接着以3000x g离心1分钟。然后将样品制备物用32μL水稀释并转移到96孔板中。使用5μL PBS pH7.4和相同的样品制备规程制备空白，以确保没有干扰峰。有关芯片制备，请参阅上面的RCE-SDS。
在第一项稳定性研究(实施例11)中，在没有IAM的情况下进行非还原性CE-SDS样品制备(将7μL HT Protein Express样品缓冲剂与5μL稀释样品混合)。在实施例12中报告的稳定性研究之前更新了该方法以包括IAM，以减少由于SDS与样品的相互作用引起的纯度的人为变化而导致的观察变异性。
在第二项稳定性研究中，将IAM添加到非还原工作溶液中，以减少由于添加SDS引起的游离巯基的存在而导致的纯度变化。巯基可以通过如新峰所观察到的二硫键加扰(scrambling)来诱导新种类的形成，从而导致样品纯度的人为降低。IAM是烷化剂，可以阻断巯基并防止二硫键加扰。
结果与讨论
生物物理测试：
通过DSF和DLS进行了生物物理测试，以评估缓冲剂特性、溶液pH和赋形剂对IgG1-C-E430G稳定性的影响。评估的配制剂显示在表5中。从DSF和DLS分析获得的结果显示在表8中。
Figure BDA0003747970340001001
根据从DSF和DLS获得的数据，就缓冲剂类型而言，乙酸盐与组氨酸相比提供了更好的热稳定性，如更高的Tonset值和更高的Tagg值所示。然而，在升高的温度下，乙酸盐配制剂的聚集程度明显更高，如在266nm和473nm处增加的SLS计数所示。观察到溶液pH和Tonset和Tagg两者呈正相关，表明在较高pH下具有更高的热稳定性。然而，在溶液pH和266nm和473nm处的SLS计数之间也观察到正相关，表明较低的pH溶液可能赋予溶液中IgG1-C-E430G更大的胶体稳定性。由于更高的pk1直径(即DLS分析中的主峰大小)和用该赋形剂观察到的多分散性值，蔗糖配制剂似乎生成更大的IgG1-C-E430G聚集体。
选择的配制剂在经历冻融循环和连续物理摇动的物理应激筛选后进一步筛选。还筛选了添加表面活性剂PS80对IgG1-C-E430G稳定性的影响。
物理应激和表面活性剂研究：
筛选了12种配制剂以评估溶液pH、赋形剂和表面活性剂对IgG1-C-E430G稳定性的影响。针对物理应激和表面活性剂研究筛选的配制剂显示在表6中。由于DSF分析中观察到的生物物理结果，排除了具有精氨酸的配制剂。下表列出了每种分析测定的结果。
表9.物理应激研究-外观结果
Figure BDA0003747970340001011
Figure BDA0003747970340001021
1可能是灰尘颗粒
Figure BDA0003747970340001031
Figure BDA0003747970340001041
表11.物理应激研究-A280结果
Figure BDA0003747970340001051
Figure BDA0003747970340001061
表12.物理应激研究-浑浊度结果
Figure BDA0003747970340001062
Figure BDA0003747970340001071
Figure BDA0003747970340001081
就缓冲剂特性而言，只有20mM乙酸盐、150mM NaCl(pH 5.5)的配制剂在暴露于48小时的连续摇动后显示可见颗粒。在五个冻融循环后20mM乙酸盐、150mM NaCl(pH 5.5)和20mM乙酸盐、250mM蔗糖(pH 5.5)和20mM组氨酸、250mM山梨糖醇(pH 6.0)是观察到形成颗粒的仅有配制剂。然而，将这些配制剂与含有0.04％(w/v)PS80的对应配制剂进行比较，未观察到颗粒，这表明在IgG1-C-E430G配制剂中包括PS80可能有助于防止颗粒形成。
在赋形剂方面，SLS数据(表8)表明，与糖赋形剂的SLS计数相比，具有带电赋形剂(NaCl、精氨酸)的配制剂在升高的温度在266和473nm处具有显著更高的SLS计数，表明糖为IgG1-C-E430G提供了更大的胶体稳定性。
在五次冻融循环后，20mM乙酸盐、150mM NaCl(pH5.5)是在物理应激后观察到纯度降低的仅有配制剂。然而，在配制剂中包含PS80似乎可以防止冻融后聚集体的生长，因为纯度保持一致，即使在冻融后也是如此。
在具有蔗糖的配制剂中，冻融循环后IgG1-C-E430G的A280观察到变化。
基于这些汇总结果，选择20mM组氨酸、250mM山梨糖醇、0.04％(w/v)PS80、pH 6.0作为IgG1-C-E430G的最佳配制剂。
稳定性研究
然后在5±3℃、25±2℃/60±5％RH和40±2℃/75±5％RH贮存条件下8周内以20mg/mL评估IgG1-C-E430G的已鉴定的配制剂，20mM组氨酸、250mM山梨糖醇、0.04％PS80、pH6.0(表7)的稳定性。初始样品通过外观、pH、A280、SE-HPLC、icIEF、微芯片CE-SDS(还原和非还原)进行测试。在初始时间点制备额外的样品并进行五个冻融循环以及物理摇动(400RPM持续48小时)以确认物理应激研究的结果。所选分析的结果显示在下表中。
表14.稳定性研究LoC-NR结果
Figure BDA0003747970340001091
Figure BDA0003747970340001101
1由于样品制备物中缺乏烷化剂，游离巯基催化的不受控制的二硫键加扰(scrambling)可能导致正面(front-side)相关杂质(片段)的变化。
表15.稳定性研究LoC-R结果
Figure BDA0003747970340001102
Figure BDA0003747970340001111
表16.稳定性研究icIEF结果
Figure BDA0003747970340001112
根据从稳定性研究中获得的数据，无论贮存条件如何，对溶液的外观或颗粒含量均没有影响。在研究期间，无论贮存条件如何，似乎对溶液pH或A280没有影响，除了在40±2℃/70±5％RH下的A280，观察到其随时间增加。A280的这种增加可能归因于较高贮存温度下的蒸发。
SE-HPLC结果表明，在冻融循环或48小时或连续摇动的物理应激后，对IgG1-C-E430G纯度没有影响。在研究过程中，每种条件在单体纯度方面显示出相似的趋势，在每个时间点纯度均有所下降，但在40±2℃/70±5％RH加速贮存条件下对纯度的影响更为显著。在温度应激条件下，LMW和HMW IgG1-C-E430G种类均随时间增加。对于5±3℃和25±2℃/60±5％RH条件，在8周内仅观察到％LMW增加。
通过LoC-NR分析未观察到IgG1-C-E430G纯度的显著变化。在还原条件下，在长达8周的所有条件下均观察到IgG1-C-E430G纯度下降和碎片化增加，尽管在加速贮存条件下变化更为明显。
icIEF结果表明，在标称条件(5±3℃)下，IgG1-C-E430G的电荷异质性没有变化，但是在两种加速贮存条件下(25±2℃/60±5％RH和40±2℃/70±5％RH)均有变化。在每个连续的时间点观察到％酸性变体的增加，这可能是加速贮存条件下蛋白质脱酰胺的结果。在整个研究中，无论贮存条件如何，主峰的pI均没有变化。
结论
从生物物理研究、物理应激研究和表面活性剂研究获得的结果，将20mM组氨酸、250mM山梨糖醇、0.04％PS80、pH6.0(表7)确定为用于在标称和加速贮存条件下评估产品稳定性的IgG1-C-E430G的最佳配制剂。
最初的生物物理研究评估了缓冲剂类型、赋形剂和pH对IgG1-C-E430G热稳定性和构象稳定性的影响。根据从DSF和DLS获得的结果，与组氨酸相比，乙酸盐似乎提供更好的热稳定性，观察到的Tonset和Tagg值更高，但乙酸盐配制剂中的聚集程度显著更高，如通过在升高的温度下在266和473nm处的SLS计数所观察到的。除了20mM组氨酸、250mM山梨糖醇(pH5.5)之外，乙酸盐配制剂似乎通常具有较低的z-平均粒径。然而，与组氨酸相比，乙酸盐配制剂似乎也具有更高的平均pk 1多分散性％，这表明乙酸盐配制剂中存在较大的聚集体。
就溶液pH而言，在组氨酸配制剂和Tagg值之间观察到正相关，表明较高的溶液pH可能提高蛋白质聚集开始的温度。然而，SLS计数表明，在高pH溶液中聚集程度更高，表明低pH配制剂具有更高的胶体稳定性。DLS结果显示pk 1多分散性在高pH(6.5)配制剂中最高，表明较高pH溶液可能具有较高的低聚物群体，诸如IgG1-C-E430G的二聚体和三聚体。
在赋形剂方面，SLS数据表明，与糖赋形剂的SLS计数相比，具有带电赋形剂(NaCl、精氨酸)的配制剂在升高的温度下在266和473nm处具有显著更高的SLS计数，表明糖为IgG1-C-E430G提供了更大的胶体稳定性。蔗糖配制剂通常具有最高的pk 1直径和pk 1多分散性，表明这些配制剂含有更多的小低聚物。尽管由于存在二级群体(多模态)，在一些配制剂中z-平均粒径较大，但这些样品中峰1的总体质量％非常高(>99％)，这表明二级直径的总体贡献最小。
从生物物理研究中选出的六种最佳配制剂在存在物理应激源的情况下进行了进一步评估(以400RPM摇动48小时和五个冻融循环)。还对添加PS80的这些配制剂进行了评估，以确定表面活性剂是否对IgG1-C-E430G配制剂有任何益处。外观测试表明，在暴露于受应激的条件后，颜色或澄清度没有差异。然而，在pH5.5下的20mM乙酸盐、150mM NaCl的配制剂中，在暴露于摇动48小时后观察到颗粒的形成。在五个冻融循环后，pH5.5的20mM乙酸盐、150mM NaCl，pH 5.5的20mM乙酸盐、250mM蔗糖和pH 6.0的20mM组氨酸、250mM山梨糖醇是显示颗粒的仅有配制剂。在配制剂中添加PS80似乎有助于防止所有样品在冻融或摇动物理应激后形成颗粒。根据DLS结果，观察到具有NaCl的配制剂表现出更高的z-平均粒径。除了20mM组氨酸和糖(250mM山梨糖醇和250mM蔗糖)配制剂外，有PS80和没有PS80的配制剂之间的z-平均粒径似乎没有差异，其中在包括0.04％(w/v)PS80的配制剂中观察到z-平均粒径显著降低。这表明PS80可能有助于防止IgG1-C-E430G在组氨酸和糖配制剂中的聚集。SE-HPLC结果表明，在冻融循环后，乙酸盐与NaCl看到纯度下降，这归因于％HMW种类的增长，但是通过在溶液中添加PS80可以缓解这种纯度下降，而在物理应激源之后没有观察到纯度下降。根据生成的DLS、外观和SE-HPLC数据，这表明在pH6.0下的20mM组氨酸、250mM山梨糖醇、0.04％PS80是进入稳定性的最佳配制剂。
最后，进行了稳定性研究，评估了20mg/mL的最佳IgG1-C-E430G配制剂(20mM组氨酸、250mM山梨糖醇、0.04％PS80，pH 6.0)。样品在标称条件(5±3℃)和两种加速条件(25±2℃/60±5％RH和40±2℃/70±5％RH)下温育八周。温育后，通过外观、pH、A280、SE-HPLC、LoC和icIEF测试样品。在该稳定性研究的初始时间点评价冻融循环和物理摇动。
外观、pH和A280测试表明在贮存条件之间没有差异，并且在长达8周的时间内没有观察到可见颗粒。
SE-HPLC结果显示，在每种条件下，每个时间点的单体纯度均有所下降，尽管这种影响在加速条件下最为显著。加速条件(40±2℃/70±5％RH)也是仅有显示％HMW种类增加的样品，而其他两种条件仅显示％LMW种类增加。
从LoC-NR结果来看，在2周时间点之前观察到每个样品的纯度的初始下降，但是，杂质可能达到平衡并且不会进一步增加。然而，需要分析进一步的时间点来证实这一假设。
icIEF结果显示，％主峰、％酸性变体和％碱性变体在整个标称条件(5±3℃)的研究中相似。然而，在加速条件下(25±2℃/60±5％RH和40±2℃/70±5％RH)，％主峰的降解导致％酸性变体增加，表明IgG1-C-E430G在较高温度下的潜在脱氨基。
实施例12——抗体配制剂-第二项稳定性研究
进行了20mg/mL IgG1-C-E430G配制剂(在20mM组氨酸、250mM山梨糖醇，pH 6.0、0.04％PS80中)的第二次稳定性研究。
方法
除下文提供外，所用方法描述于实施例11中。
微流成像(MFI)：
该方法利用ProteinSimple微流成像(MFI)显微镜来收集亚可见颗粒的图像并允许对其进行表征。通过将1mL的每个样品转移到96孔Eppendorf深孔板上的孔中来进行样品分析。使用MFI View***软件(MVSS)创建仪器方法。仪器收集具有≥1和≤100微米的等效圆直径(ECD)的所有颗粒的图像。
在样品分析之后，使用MVSS软件以将形态过滤器应用于收集的图像，并根据共同特征将颗粒分组到群体中。通过ECD将图像过滤到以下组：ECD≥2微米、ECD≥5微米、ECD≥10微米和≥25微米。长宽比形态过滤器以≥0.85的截止值应用于≥5微米的群体，其鉴定含有圆形和非圆形颗粒的图像。非圆形颗粒(AR<0.85)倾向于是蛋白质来源，而圆形颗粒(AR≥0.85)倾向于由气泡和硅油组成。
然后可以根据MVSS软件将其定义为颗粒内最轻像素的强度的强度min，将含有圆形颗粒的图像表征为气泡或有机硅颗粒。使用过滤器以将强度min>75的圆形颗粒分组为气泡，并将强度min≥75和≤300的颗粒分组为有机硅颗粒。然后可以通过将确定为有机硅或圆形的颗粒数量除以具有相同ECD的颗粒总数量来确定有机硅和圆形分数。
对于由形态特征确定的期望表征组，该方法的结果报告为每mL的颗粒计数。可以使用MFI的结果以通过在稳定性研究过程中观察颗粒计数的变化来评估配制抗体的稳定性。MFI仅用作颗粒的间接表征，而不是颗粒组成的直接测量。
结果
第二次稳定性研究的结果如下表所示。
表17.外观
Figure BDA0003747970340001151
表18 pH外观
Figure BDA0003747970340001161
表19.280nm(A280)处的吸光度
Figure BDA0003747970340001162
Figure BDA0003747970340001171
表20.尺寸排阻色谱(SEC)
Figure BDA0003747970340001172
Figure BDA0003747970340001181
表21.LoC-NR
Figure BDA0003747970340001182
表22.LoC-R
Figure BDA0003747970340001191
表23.MFI汇总
Figure BDA0003747970340001192
Figure BDA0003747970340001201
表24.icIEF
Figure BDA0003747970340001202
Figure BDA0003747970340001211
实施例13——使用生物层干涉法测定的结合亲和力
人CD38特异性抗体IgG1-C-E430G和IgG1-B的靶物结合亲和力在Octet HTX仪器(ForteBio)上通过无标记生物层干涉法(label-free biolayer interferometry，BLI)确定。在30℃下以1,000RPM摇动进行实验。
抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(ForteBio，目录号18-5060)通过暴露于10mM甘氨酸缓冲剂pH 1.7(
Figure BDA0003747970340001212
目录号15227)5秒进行预处理，然后在样品稀释剂(ForteBio，目录号18-1104)中中和5秒；两个步骤重复5次。接下来，对AHC传感器加载抗体(在样品稀释剂中为1μg/mL)600秒。在样品稀释剂中进行基线测量(100秒)后，使用在样品稀释剂中进行2倍稀释步骤的0.78-50nM(0.02-1.53μg/ml)的浓度范围确定重组His-CD38(Genmab)的缔合(200秒)和解离(1,000秒)。基于氨基酸序列(30.5kDa)的His-CD38的理论分子量用于计算。对于每种抗体，使用了参考传感器，其用样品稀释剂而不是抗原温育。
使用数据采集软件v9.0.0.49d(ForteBio)获取数据，并使用数据分析软件v9.0.0.14(ForteBio)进行分析。通过减去参考传感器来校正每个抗体的数据追踪。Y轴与基线的最后10s对齐，并应用了对解离的步间校正对齐以及Savitzky-Golay过滤。将响应<0.04nm的数据追踪排除在分析之外。使用分别设置为200秒和1,000秒的缔合和解离时间窗口，用1:1模型拟合数据。
“KD”(M)是指抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，并且由kd除以ka得到。“kd”(sec-1)是指抗体-抗原相互作用的解离速率常数。这有时也称为koff值或解离率(off-rate)。“ka”(M-1x sec-1)是指抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。这有时也称为kon值或缔合率(on-rate)。
表25显示了三个独立实验的结果。IgG1-C-E430G对His-CD38的平均亲和力(解离平衡常数，KD)为1.1±0.17nM。IgG1-B对His-CD38的亲和力为3.9±0.48nM。
表25.CD38抗体对His-CD38的结合亲和力
Figure BDA0003747970340001221
实施例14——抗体配制剂-进一步的稳定性研究
对在20mM组氨酸、250mM山梨糖醇、0.04％PS80，pH6.0中配制的包含20mg/mLIgG1-C-E430G的不同批次A和B进行了进一步的稳定性研究。结果列在下表中并且包括持续长达6个月的不同贮存温度。评估的参数是外观、颜色、乳光、亚可见颗粒、CE-SDS(红色)(RCE-SDS)、CE-SDS(非红色)(NR CE_SDS)、icIEF、SE-HPLC、ELISA、效力、A280和pH，使用如上文实施例11和12中描述的方法以及下文进一步描述的方法进行评估。下面的结果证实了IgG1-C-E430G在配制剂中被认为是稳定的并且适合医疗用途。
根据药典(欧洲药典(Ph.Eur.)和日本药典(JP))中描述的标准化方法，通过目视检查颜色和乳光。相对据颜色标准品以1到7的增量(1是最浓缩的溶液)评估颜色，诸如“黄色”(Y)、“棕色”(B)或“棕黄色”(BY)。针对一系列参考悬浮物评估乳光(RSI、RSII、RSIII和RSIV；后者是最乳白色的溶液)。
根据药典(美国药典(USP)、欧洲药典(Ph.Eur.)和日本药典(JP))中描述的标准化方法，通过分析由自由漂浮的亚可见颗粒引起的不透光度(light obscuration)来评估亚可见颗粒。在合并几个小瓶后测量的亚可见颗粒计数。计算结果并表示为每小瓶的颗粒。
通过使用CellTiter-Glo读出***评估的补体依赖性细胞毒性(CDC)确定效力。该方法基于在ATP存在下将荧光素催化成发光的氧化荧光素，这是对活细胞的测量。
简而言之，将Daudi靶细胞解冻并以105个细胞/孔接种于白色不透明96孔培养板中的测定培养基中，并在室温(RT)下静置60分钟。HexaBody-CD38的连续稀释物在单独稀释板中的测定培养基中制备，添加到细胞中并在RT下温育30分钟。以每孔25％的最终浓度添加合并正常人血清作为补体效应蛋白的来源，并在RT下温育30分钟。然后将板包裹在透明箔中并在37℃、5％CO2下温育2.5小时。在RT平衡30分钟后，添加CellTiter-Glo试剂。将板以400rpm摇动30秒，在RT下温育10分钟，并使用多板读板器测量发光。
如下通过ELISA确定CD38结合。使用配体结合ELISA评估与靶抗原的结合。将靶抗原(HIS-CD38)在包被Nunc Maxisorp ELISA板的PBS中稀释，并在4℃下温育16-20小时。在每一步之间使用具有PBS-Tween-20(0.05％)的ELISA清洗器将测定板清洗3次。用PBS-T封闭检测板，然后在温度受控振荡器以25℃和300rpm上温育60分钟。将在PBS-T中制备的样品的连续稀释物添加到板中，并在温度受控振荡器上以25℃和300rpm温育90分钟。清洗后，添加在PBS-T中预稀释的山羊抗人IgG Fcγ-HRP并在温度受控振荡器中以25℃和300rpm温育60分钟。为了检测，在清洗板后，将ABTS添加到测定板中，然后在温度受控振荡器上以25℃和300rpm温育30分钟。添加2％草酸(不清洗)以终止酶促反应。在405nm处进行读数和分析。
表26.IgG1-C-E430G，批号A，贮存温度5±3℃-直立的稳定性数据
Figure BDA0003747970340001231
Figure BDA0003747970340001241
表27.IgG1-C-E430G，批号A，贮存温度5±3℃-倒置的稳定性数据
Figure BDA0003747970340001242
Figure BDA0003747970340001251
Figure BDA0003747970340001261
表28.IgG1-C-E430G，批号A，贮存温度25±2℃/60±5％RH的稳定性数据
Figure BDA0003747970340001262
Figure BDA0003747970340001271
表29.IgG1-C-E430G，批号B，贮存温度≤-65℃的稳定性数据
Figure BDA0003747970340001272
Figure BDA0003747970340001281
表30.IgG1-C-E430G，批号B，贮存温度5±3℃的稳定性数据
Figure BDA0003747970340001282
Figure BDA0003747970340001291
表31.IgG1-C-E430G，批号B，贮存温度25±2℃/60±5％RH的稳定性数据
Figure BDA0003747970340001292
Figure BDA0003747970340001301
参考文献的列表
该列表中或本文其他地方引用的的每篇参考文献均在此特别通过引用整体并入。
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Arg Phe Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Ile Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 2
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 3
Ile Ile Arg Phe Leu Gly Ile Ala
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 4
Ala Gly Glu Pro Gly Glu Arg Asp Pro Asp Ala Val Asp Ile
1 5 10
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 6
Gln Gly Ile Arg Ser Trp
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 7
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Ile Pro Phe Leu Gly Ile Ala Asn Ser Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Ile Ala Ala Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Phe Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Lys Glu Phe Ser Ala Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Pro Tyr Ser Trp Asp Asp Ser Pro Gln Asp Asn Tyr
100 105 110
Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 13
Gly Tyr Arg Phe Ser Asn Phe Val
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 14
Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Lys
1 5
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 15
Ala Arg Val Gly Pro Tyr Ser Trp Asp Asp Ser Pro Gln Asp Asn Tyr
1 5 10 15
Tyr Met Asp Val
20
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Phe Ser Cys Arg Ser Ser His Ser Ile Arg Ser Arg
20 25 30
Arg Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Val
35 40 45
Ile His Gly Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Gly Ala Ser Ser
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Arg Lys
100 105
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 17
His Ser Ile Arg Ser Arg Arg
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 18
Gln Val Tyr Gly Ala Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 20
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 21
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 22
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 23
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 24
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Ser Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Phe Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 27
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Thr Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 28
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Gln Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 30
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Arg Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 31
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Tyr Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 32
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Trp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 33
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 34
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 34
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 35
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 36
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 37
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 38
<211> 300
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys
1 5 10 15
Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val
20 25 30
Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln
35 40 45
Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu
50 55 60
Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val
65 70 75 80
Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys
85 90 95
His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu
100 105 110
Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile
115 120 125
Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr
130 135 140
Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys
145 150 155 160
Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp
165 170 175
Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val
180 185 190
Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu
195 200 205
Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser
210 215 220
Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala
225 230 235 240
Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp
245 250 255
Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln
260 265 270
Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val
275 280 285
Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile
290 295 300
<210> 39
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带标签的序列
<400> 39
His His His His His His Arg Trp Arg Gln Thr Trp Ser Gly Pro Gly
1 5 10 15
Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr
20 25 30
Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp
35 40 45
Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr
50 55 60
Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro
65 70 75 80
Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln
85 90 95
Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu
100 105 110
Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser
115 120 125
Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn
130 135 140
Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu
145 150 155 160
Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys
165 170 175
Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu
180 185 190
Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly
195 200 205
Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu
210 215 220
Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile
225 230 235 240
Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser
245 250 255
Ser Cys Thr Ser Glu Ile
260
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是Ser或Arg
<400> 40
Gly Gly Thr Phe Xaa Ser Tyr Ala
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是Arg或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X是Ile或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是Ala, Tyr或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是Ala, Thr或Val
<400> 41
Ile Ile Xaa Phe Leu Gly Xaa Xaa
1 5
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X是Ala或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X是Glu, Asp或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X是Val或Phe
<400> 42
Xaa Gly Glu Pro Gly Xaa Arg Asp Pro Asp Ala Xaa Asp Ile
1 5 10
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 43
Gln Gly Ile Arg Ser Trp
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是Ser或Asn
<400> 44
Gln Gln Tyr Asn Xaa Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 45
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 46
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列的部分
<400> 46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325

Claims (77)

1.药物组合物，其包含
a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包含
-抗原结合区，其包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3、具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3，和
-Fc区，其包含选自对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的组的一个或多个氨基酸残基中的突变，其中所述氨基酸残基根据EU索引编号；
b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
d)表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其基本上由(a)、(b)、(c)和(d)组成。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的药物组合物，其由在水溶液中的(a)、(b)、(c)和(d)组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体包含
-可变重链(VH)区，其包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，诸如90％、或95％、或97％、或98％、或99％的氨基酸序列；和/或
-可变轻链(VL)区，其包含SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性，诸如90％、或95％、或97％、或98％、或99％的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，在所述抗体中
-所述VH与SEQ ID NO:1相差12个或更少，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，诸如氨基酸残基的取代、***或缺失；
和/或
-所述VL与SEQ ID NO:5相差12个或更少，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，诸如氨基酸残基的取代、***或缺失。
6.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体包括包含SEQ ID NO:1序列的VH区和包含SEQ ID NO:5序列的VL区。
7.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，在所述抗体中，所述一个或多个氨基酸残基中的突变选自由E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440Y和S440W组成的组，诸如选自对应于E430G、E345K、E430S和E345Q的组。
8.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述一个或多个氨基酸残基中的突变包含E430G或由E430G组成。
9.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述Fc区包含除对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的那些氨基酸残基以外的氨基酸残基中的一个或多个进一步突变，并且
其中所述一个或多个进一步突变不降低由没有所述一个或多个进一步突变的抗体诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述一个或多个进一步突变为12个或更少，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，诸如氨基酸残基的取代、***或缺失。
11.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，在所述抗体中，对应于人IgG1重链中447位的Lys(K)的氨基酸残基不存在，其中所述氨基酸残基根据EU索引编号。
12.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中除了所列突变之外，所述Fc区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型或其混合同种型。
13.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中除了所列突变之外，所述Fc区是人IgG1 Fc区，诸如人IgG1m(f)、IgG1m(a)、IgG1m(x)、IgG1m(z)同种异型或其任意两种或更多种的混合同种异型。
14.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述Fc区是人IgG1 Fc区，除了所列突变之外，其包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23或SEQ ID NO:45的氨基酸残基99至329(直接编号)。
15.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述Fc区是人IgG1 Fc区，其包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:46的氨基酸残基99至329。
16.药物组合物，其包含
a)1至200mg/mL的与人CD38结合的抗体，其包含
-重链，其包括包含具有SEQ ID NO:2中所示序列的VH CDR1、具有SEQ ID NO:3中所示序列的VH CDR2、具有SEQ ID NO:4中所示序列的VH CDR3的VH区和在E430、E345和S440中的一个或多个中具有突变的人IgG1 CH区，氨基酸残基根据EU索引编号，和
-轻链，其包括包含具有SEQ ID NO:6中所示序列的VL CDR1、具有序列AAS的VL CDR2和具有SEQ ID NO:7中所示序列的VL CDR3的VL区；
b)5-40mM组氨酸或乙酸盐；
c)100-400mM山梨糖醇或蔗糖；和
d)表面活性剂。
17.根据权利要求16的药物组合物，其基本上由(a)、(b)、(c)和(d)组成。
18.根据权利要求16和17中任一项所述的药物组合物，其由在水溶液中的(a)、(b)、(c)和(d)组成。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体包含
-重链，其包括包含SEQ ID NO:1的VH区和在E430、E345和S440中的一个或多个中具有突变的人IgG1 CH区，其中氨基酸残基编号是根据EU索引，和
-轻链，其包括包含SEQ ID NO:5的VL。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的药物组合物，其中所述突变包含E430G或由E430G组成。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的药物组合物，其中除了所列突变之外，所述人IgG1 CH区是人IgG1m(f)、IgG1m(a)、IgG1m(x)或IgG1m(z)同种异型，或其中任意两种或更多种的混合同种异型。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的药物组合物，其中除了所列突变之外，所述人IgG1 CH区包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述人IgG1 CH区包含除对应于人IgG1重链中的E430、E345和S440的那些氨基酸残基以外的氨基酸残基中的一个或多个进一步突变，其中所述氨基酸残基根据EU索引编号，任选地其中所述一个或多个进一步突变为12个或更少，诸如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变，诸如氨基酸残基的取代、***或缺失。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的药物组合物，其中所述CH区包含选自由SEQID NO:24至SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:46组成的组的氨基酸序列。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述CH区包含SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:46，任选地其中所述轻链包括包含SEQ ID NO:37的CL。
26.根据权利要求16至25中任一项所述的药物组合物，其中对应于人IgG1重链中447位的Lys(K)的氨基酸残基不存在，其中所述氨基酸残基根据EU索引编号。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的药物组合物，其为二价抗体。
28.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中除了所列一个或多个突变之外，所述抗体是人单克隆全长单特异性二价IgG1m(f),κ抗体。
29.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中a)是1至80mg/mL，诸如1至60mg/ml、1至40mg/mL、1至30mg/ml或1至25mg/ml；2至80mg/mL，诸如2至40mg/mL或2至30mg/ml；或10至80mg/mL，诸如10至40mg/mL或10至30mg/ml；或15至80mg/ml，诸如15至40mg/ml，诸如15至25mg/ml，诸如2mg/ml、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、22mg/mL、24mg/mL、26mg/mL、28mg/mL、30mg/mL、32mg/mL、34mg/mL、36mg/mL、38mg/mL、40mg/mL或50mg/mL；优选约20mg/mL，诸如20mg/mL的所述抗体。
30.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中b)是5至30mM，诸如5至25mM，诸如10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM或30mM；优选约20mM，诸如20mM的组氨酸或乙酸盐；诸如组氨酸。
31.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中c)是100至350mM，诸如100至300mM、100至260mM、100至200mM、150至350mM、200至300mM、200至260mM、200至350mM、200至300mM、200至260mM、230至350mM、230至300mM、230至260mM或240至260mM；诸如245mM、246mM、247mM、248mM、249mM、250mM、251mM、252mM、253mM、254mM或255mM，优选约250mM，诸如250mM的山梨糖醇或蔗糖，诸如山梨糖醇。
32.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为5.0至6.5，诸如5.5至6.5，诸如5.6至6.5、5.7至6.5、5.8至6.5、5.9至6.5、6.0至6.5、5.5至6.4、5.5至6.3、5.5至6.2、5.5至6.1、5.5至6.0、5.7至6.3、5.8至6.2、5.9至6.1，诸如约6，诸如6或6.0。
33.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂选自下组，所述组包含：甘油单油酸酯、苄索氯铵、多库酯钠、磷脂、聚乙烯烷基醚、月桂基硫酸钠和三辛精、苯扎氯铵、溴棕三甲胺(citrimide)、西吡氯铵和磷脂、α生育酚、甘油单油酸酯、肉豆蔻醇、磷脂、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙二醇羟基硬脂酸酯、聚乙二醇甘油酯、聚山梨酯、丙二醇二月桂酸酯、丙二醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇酯蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯、三辛精和TPGS。
34.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨酯。
35.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨酯20或80，诸如聚山梨酯80。
36.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为约0.005％至0.5％w/v，诸如约0.01至0.1％w/v，诸如约0.01至0.09％w/v，诸如约0.01至0.06％w/v，诸如约0.01至0.05％w/v，诸如0.02％w/v或0.03％w/v或0.04％w/v或0.05％w/v，或0.06％w/v，诸如约0.04％w/v或0.04％w/v。
37.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物具有5.9至6.1，诸如约6或6.0的pH，并且包含以下各项或基本上由以下各项组成：
a)1至80mg/mL的所述抗体
b)15至40mM组氨酸
c)200至300mM山梨糖醇
d)0.01％至0.1％w/v的表面活性剂，优选聚山梨酯，诸如聚山梨酯20或聚山梨酯80，诸如聚山梨酯80。
38.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物具有5.9至6.1，诸如约6或6.0的pH，并且包含以下各项或基本上由以下各项组成：
a)10至40mg/mL的所述抗体
b)15至40mM组氨酸
c)200至300mM山梨糖醇
d)0.02％至0.06％w/v的表面活性剂，优选聚山梨酯，诸如聚山梨酯20或聚山梨酯80，诸如聚山梨酯80。
39.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物具有5.9至6.1，诸如约6或6.0的pH，并且包含以下各项或基本上由以下各项组成：
a)10至40mg/mL的所述抗体
b)15至25mM组氨酸
c)240至260mM山梨糖醇
d)0.02％至0.06％w/v的表面活性剂，优选聚山梨酯，诸如聚山梨酯20或聚山梨酯80，诸如聚山梨酯80。
40.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在至少8周的时段，诸如1-60个月、1-48个月、1-36个月、1-30个月、1-24个月、1-18个月、1-12个月或1-6个月的时段；诸如2-60个月、2-48个月、2-36个月、2-30个月、2-24个月、2-18个月、2-12个月或2-6个月；诸如3-60个月、3-48个月、3-36个月、3-30个月、3-24个月、3-18个月、3-12个月或3-6个月，诸如48个月、36个月、30个月、24个月、18个月、12个月或6个月是稳定的。
41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中在所述组合物保持在5℃±3℃、25℃±5℃或40℃±10℃，诸如在5℃±3℃、约25℃±5℃或约40℃，诸如在5℃±3℃时测定稳定性。
42.根据权利要求40或41所述的药物组合物，其中通过以下来评估稳定性：
(a)亚可见颗粒计数；
(b)pH；
(c)蛋白质浓度；
(d)尺寸排阻色谱法；
(e)等电聚焦；
(f)还原条件下的电泳；
(g)非还原条件下的电泳；和/或
(h)目视检查。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的药物组合物，其中通过测定以下来评估稳定性：
(a)使用微流成像(MFI)显微镜进行亚可见颗粒计数，任选地如实施例12中提供的；
(b)pH，任选地如实施例11中提供的；
(c)使用280nm处吸光度(A280)的蛋白质浓度，任选地如实施例11中提供的；
(d)使用尺寸排阻色谱法，与所述组合物中存在的抗体单体、高分子量(HMW)种类和低分子量(LMW)种类的总和相比的抗体单体的相对量，任选地如实施例11中提供的；
(e)通过成像毛细管等电聚焦(icIEF)，与抗体、所述抗体的酸性变体和所述抗体的碱性变体的总和相比的抗体的相对量，任选地如实施例11中提供的；
(f)通过还原性毛细管电泳，与所述轻链、重链和非糖基化重链的总和相比的所述轻链和重链的总和的相对量，任选地如实施例11中提供的；
(g)与抗体、分子量低于抗体峰的峰和分子量高于抗体峰的峰的总和相比的抗体峰的相对量；和/或
(h)视觉外观，任选地如实施例11中提供的。
44.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体能够与如SEQ IDNO:39中指定的带His标签的人CD38结合。
45.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体对人CD38的环化酶活性具有抑制作用。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述抗体抑制人CD38的环化酶活性至少约40％，诸如至少约50％，诸如至少约60％，任选地其中环化酶活性的抑制通过包括以下步骤的测定法来确定：
a)在多孔板中将200,000个Daudi或Wien133细胞接种到每孔100μL 20mM Tris-HCL中；或将0.6ug/mL带His标签的可溶性人CD38(SEQ ID NO:39)接种到每孔100μL 20mM Tris-HCL中；
b)每孔添加1μg/mL CD38抗体和80μM NGD；
c)测量荧光直至达到平台期(例如，5、10或30分钟)；和
d)测定与对照，诸如用同种型对照抗体温育的孔相比的抑制百分比。
47.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体在存在而不是不存在Fc交联抗体的情况下诱导凋亡。
48.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体诱导表达人CD38的细胞的CDC、ADCC、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、胞啃作用(trogocytosis)或其任何组合。
49.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体诱导表达人CD38的细胞的CDC。
50.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体诱导针对Daudi细胞(ATCC号CCL-213)或Ramos细胞(ATCC号CRL-1596)的CDC，导致最大裂解比用不同之处仅在于不存在所述Fc区中的所述一个或多个突变的参考抗体获得的最大裂解高至少50％，诸如至少60％，诸如至少70％。
51.根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述CDC通过包括以下步骤的测定法来确定：
a)在多孔板中将100,000个表达CD38的细胞铺板在每孔40μL补充有0.2％BSA的培养基中；
b)用40μL连续稀释的CD38抗体(0.0002-10μg/mL)预温育细胞20分钟；
c)用20％的合并正常人血清在37℃下温育每个孔45分钟；
d)添加存活力染料并在流式细胞仪上测量细胞裂解的百分比；
e)使用非线性回归确定所述最大裂解。
52.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体是全长二价抗体，其包含两条重链和两条轻链、由或基本上由两条重链和两条轻链组成，其中
-每条重链包含VH区和CH区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1并且所述CH区包含SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:46，并且
-每条轻链包含VL区和CL区，其中所述VL区包含SEQ ID NO:5且所述CL区包含SEQ IDNO:37。
53.药物组合物，其具有约6的pH并且包含以下各项或基本上由以下各项组成：
a)约20mg/mL的与人CD38结合的抗体，
b)约20mM组氨酸，
c)约250mM山梨糖醇，和
d)约0.04％w/v的聚山梨酯80，
其中所述抗体是全长二价抗体，其包含两条重链和两条轻链、由或基本上由两条重链和两条轻链组成，其中
-每条重链包含VH区和CH区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:1并且所述CH区包含SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:46，并且
-每条轻链包含VL区和CL区，其中所述VL区包含SEQ ID NO:5并且所述CL区包含SEQ IDNO:37。
54.根据权利要求53所述的药物组合物，其具有约6的pH并且包含在水溶液中的以下各项、由或基本上由在水溶液中的以下各项组成：
a)20mg/mL的所述抗体，
b)20mM组氨酸，
c)250mM山梨糖醇，和
d)0.04％w/v的聚山梨酯80。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体通过包括在CHO细胞中表达所述重链和所述轻链的方法获得或可通过包括在CHO细胞中表达所述重链和所述轻链的方法获得。
57.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物用于静脉内或皮下注射或输注。
58.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是待稀释的浓缩物；诸如在0.9％NaCl(盐水)或右旋糖溶液中，任选地在5％w/v右旋糖溶液中。
59.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其用作药物。
60.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其用于治疗涉及表达CD38的细胞的疾病。
61.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其用于诱导针对包含表达CD38的细胞的肿瘤的CDC响应。
62.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其用于在包含表达人CD38的细胞的受试者中治疗或预防癌症。
63.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其用于治疗对先前疗法难治的癌症，所述先前疗法包含CD38抗体、蛋白酶体抑制剂(PI)和免疫调节药物(IMiD)中的一种或多种。
64.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其用于治疗在先前疗法之后复发的癌症，所述先前疗法包含CD38抗体、PI和IMiD中的一种或多种。
65.根据权利要求63和64中任一项所述使用的药物组合物，其中所述CD38抗体是达雷妥尤单抗(daratumumab)。
66.根据权利要求62至65中任一项所述使用的药物组合物，其中所述癌症是血液癌症。
67.根据权利要求62至65中任一项所述使用的药物组合物，其中所述癌症选自下组：多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(成人)(AML)、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和骨髓增生异常综合征(MDS)，任选地其中所述ALL是B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)。
68.根据权利要求66和67中任一项所述使用的药物组合物，其中所述B细胞淋巴瘤选自下组：套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(FL)。
69.根据权利要求66所述使用的药物组合物，其中所述血液癌症选自下组：多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(成人)(AML)、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
70.根据权利要求62至65中任一项所述使用的药物组合物，其中所述癌症包括实体瘤。
71.根据权利要求70所述使用的药物组合物，其中所述实体瘤是黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、***癌、去势抵抗性***癌、胃部癌(stomach cancer)、卵巢癌、胃癌(gastric cancer)、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖***癌症、子宫内膜癌、***、肺腺癌、肾细胞癌(RCC)(例如，肾透明细胞癌或肾***状细胞癌)、间皮瘤、鼻咽癌(NPC)、食管或胃肠道癌，或其任一种的转移性病变。
72.根据权利要求70和71中任一项所述使用的抗体，其中所述实体瘤缺乏可检测的CD38表达。
73.根据权利要求62至72中任一项所述使用的抗体，其中所述癌症在包含表达CD38的T调节细胞的患者中。
74.根据权利要求1至58中任一项所述的药物组合物，其用于治疗或预防类风湿性关节炎。
75.用于治疗包含表达CD38的细胞的疾病的方法，其包括将根据权利要求1至58中任一项所述的药物组合物施用于有此需要的患者。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述药物组合物以治疗有效量和/或足以治疗所述疾病的时间施用。
77.根据权利要求75和76中任一项所述的方法，其进一步包括权利要求59至73中任一项所述的一个或多个特征。
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