CN114317616A

CN114317616A - 一种菌类发酵产物的制备工艺及化妆品

Info

Publication number: CN114317616A
Application number: CN202111493934.XA
Authority: CN
Inventors: 刘忠
Original assignee: Guangdong Tajian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Tajian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-08
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明公开了一种菌类发酵产物的制备工艺及化妆品，制备工艺包括：将菌类粉碎、过筛，制得菌类粉备用；对原始酵母菌株进行诱变后筛选出重组菌株，所述重组菌株具有乙酸耐受性和/或糠醛耐受性；对重组菌株进行活化培养，得到酵母菌种子液；将菌类粉和酵母菌种子液加入到液体发酵培养基中发酵，得到发酵液；对发酵液离心、过滤除菌，得到菌类发酵产物。本发明能够大大提高菌类的资源利用率和营养附加值，同时产物具有较好的自由基清除能力和抑制黑色素生成能力，因而能够提高抗衰老、抗氧化及美白的功效。

Description

一种菌类发酵产物的制备工艺及化妆品

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，尤其涉及一种菌类发酵产物的制备工艺及化妆品。

背景技术

皮肤的结构包括表皮层、真皮层和皮下脂肪。真皮层包含胶原蛋白、弹力蛋白和其他纤维组织。人们长时间对着电脑和手机电子设备，电子设备易产生静电吸引灰尘或微小颗粒附着在皮肤表面，再加上作息不规律，表皮易干燥，加剧了黑色素沉淀。随着年龄的增长，表皮层逐渐变薄，皮肤新陈代谢减慢，真皮层内的保湿因子减少，真皮层内弹力纤维和胶原纤维功能减退，弹力减弱进而出现皱纹；而且人体内的活性生物酶减少，大量的自由基破坏人体细胞，加快了皮肤衰老的进程。

松茸为口蘑科真菌松口蘑的子实体，在我国主要产于东北地区和贵州、云南、四川交界一带海拔3000m的针叶阔叶林区，被称为“食用菌之王”。由于松茸的生长需要独特的环境和气候条件，到目前为止还不能进行完全人工栽培，只能实现半人工栽培，属于国家二级濒危保护物种，是世界上珍贵的天然野生药用菌。松茸是具有肉质子实体的大型真菌，不仅可以作为可口美味的菜肴，而且具有多种保健和药用价值。据文献记载，松茸具有强身、补肾壮阳、益肠胃、理气、化痰和驱虫等功效。现代医学表明，松茸还具有治疗糖尿病和抑制癌细胞增殖的作用。

微生物发酵技术可将植物的养分切换成为肌肤可吸收的小分子，从而起到护肤的作用。该技术反应条件温和，设备运行操作也比较简单、安全，一般不造成环境污染。目前，微生物发酵技术在护肤品应用中已得到了一定的推广，如Pitera即覆膜酵母发酵产物，双歧杆菌发酵产物，乳酸杆菌发酵产物等等。

然而，现有松茸及其松茸发酵物对抗氧化、抗衰老及美白功效较差，无法广泛应用于各类化妆品中。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有相关技术中存在的问题之一，为此，本发明提出一种菌类发酵产物的制备工艺，大大提高了菌类的资源利用率和营养附加值，同时产物具有较好的自由基清除能力和抑制黑色素生成能力，因而能够提高抗衰老、抗氧化及美白的功效。

本发明还提供了一种具有该菌类发酵产物的制备工艺的化妆品。

根据上述提供的一种菌类发酵产物的制备工艺，其通过如下技术方案来实现：

一种菌类发酵产物的制备工艺，包括如下步骤：

S1，将菌类粉碎、过筛，制得菌类粉备用；

S2，对原始酵母菌株进行诱变后筛选出重组菌株，所述重组菌株具有乙酸耐受性和/或糠醛耐受性；

S3，对重组菌株进行活化培养，得到酵母菌种子液；

S4，将菌类粉和酵母菌种子液加入到液体发酵培养基中发酵，得到发酵液；

S5，对发酵液离心、过滤除菌，得到菌类发酵产物。

进一步地，所述对原始酵母菌株进行诱变后筛选出重组菌株包括：

S21，将原始酵母菌株进行化学诱变、筛选，得到具有乙酸耐受性的第一突变菌株和糠醛耐受性的第二突变菌株；

S22，对第一突变菌株和第二突变菌株进行基因组DNA诱变和/或遗传转化；

S23，通过筛选得到所述重组菌株。

进一步地，所述将原始酵母菌株进行化学诱变、筛选包括：将原始酵母菌株在液体培养基中培养、离心收集菌体，并用磷酸缓冲液洗涤后得到重悬菌液；在15mL灭菌的离心管加入重悬菌液、磷酸缓冲液和硫酸二乙酯，涡旋振荡混匀后培养20～40min，加入硫代硫酸钠溶液终止反应，得到诱变后的反应菌液；反应菌液进行稀释后，涂布于抑制物耐受性筛选固体培养基上培养，然后进行抑制物耐受性筛选。

进一步地，所述重悬菌液、磷酸缓冲液和硫酸二乙酯按体积比为40～60:40～55:1。

进一步地，所述对第一突变菌株和第二突变菌株进行基因组DNA诱变和/或遗传转化包括：提取第一突变菌株和第二突变菌株的总基因组DNA用于转化得到酵母菌菌液；将酵母菌菌液进行离心收集和重悬处理，得到感受态细胞。

进一步地，所述将酵母菌菌液进行离心收集和重悬处理包括：对酵母菌菌液离心收集一级菌体后，用醋酸锂﹣二硫苏糖醇混合液重悬处理；再次离心收集二级菌体，然后用预冷的无菌水冲洗。

进一步地，所述对第一突变菌株和第二突变菌株进行基因组DNA诱变和/或遗传转化还包括：取等量的第一突变菌株和第二突变菌株的总基因组DNA混合，加入硫酸二乙酯培养，得到待转化DNA；感受态细胞与待转化DNA按体积比为2:1混合，置于电转化杯中进行电击处理。

进一步地，在步骤S3中，所述对重组菌株进行活化培养具体为：将重组菌株接种于种子培养基中，28～30℃、180～200r/min摇床震荡培养16～20h。

进一步地，所述重组菌株与所述种子培养基的体积比为5～10；所述种子培养基包括葡萄糖10～30g/L、酵母提取物5～15g/L和蛋白胨10～30g/L。

进一步地，在步骤S4中，所述液体发酵培养基包括菌类10～20g/L和碳源10～30g/L，其中所述菌类包括松茸，所述碳源包括蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和麦芽糖醇中的至少一种。

根据上述提供的化妆品，其通过如下技术方案来实现：

化妆品，其包括如上所述的一种菌类发酵产物的制备工艺。

与现有技术相比，本发明的至少包括以下有益效果：

1、本发明通过以菌类为底物，并以经原始酵母菌株改良的重组菌株为菌种，进行发酵、离心、过滤除菌得到菌类发酵产物，实现大大提高菌类的资源利用率和营养附加值，相较于直提法，避免了有机溶剂和酶的添加，既安全环保，又能节约成本；

2、菌类发酵产物富含黄酮、多酚、多肽及各种氨基酸等成分，能够有效地促进人皮肤成纤维细胞(NHDFs)的***增殖，并促进其对Ⅰ型胶原蛋白的合成，同时有较好的自由基清除能力以及抑制黑色素生成的能力，因而能够提高抗衰老、抗氧化及美白的功效，可广泛应用到各类化妆品中。

附图说明

图1是本发明实施例1中菌类发酵产物的制备工艺的流程图；

图2是本发明实施例1中菌类发酵产物的浓度与ABTS自由基清除率的关系图；

图3是本发明实施例1中菌类发酵产物的浓度与细胞相对增繁能力的关系图；

图4是本发明实施例1中菌类发酵产物的浓度与I型胶原蛋白相对含量的关系图；

图5是本发明实施例1中菌类发酵产物的浓度与B16-F10细胞黑素相对含量的关系图。

具体实施方式

以下实施例对本发明进行说明，但本发明并不受这些实施例所限制。对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，而不脱离本发明方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

以下实施例中所使用的实验方法无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例

参见图1，本实施例提供了一种菌类发酵产物的制备工艺，该制备工艺包括如下步骤：

S1，将菌类粉碎、过筛，制得菌类粉备用；

具体地，菌类包括松茸，将松茸直接粉碎或者先剪切后粉碎，然后经70～100目筛滤，得到松茸粉，该松茸粉用于作为发酵底物。通过将松茸制成松茸粉，使得松茸的细胞壁被破坏，利于提升酶活性转化效率，保证发酵效果，从而保证松茸发酵产物的品质。

S2，对原始酵母菌株KN-1进行诱变后筛选出重组菌株，该重组菌株具有乙酸耐受性和/或糠醛耐受性；

具体地，原始酵母菌株KN-1优选为酿酒酵母,该酿酒酵母购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。通过对酿酒酵母进行诱变，以实现对酿酒酵母进行改良。然后通过筛选得到目标物即重组菌株KN-1-24，此时重组菌株KN-1-24具有乙酸耐受性和/或糠醛耐受性。本实施例以重组菌株KN-1-24兼具乙酸耐受性和糠醛耐受性两大功能为例，该重组菌株KN-1-24同时在1～8g/L乙酸和0.1～1.5g/L糠醛的抑制物耐受性筛选固体培养基上生长较好。

将重组菌株KN-1-24与原始酵母菌KN-1接种于10mL YEPD液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养20h；以10％接种量转接到50mL YEPD液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养20h，然后以10％接种量分别转接到100mL抑制物耐受性发酵培养基和纤维素水解液发酵培养基中，每个条件设3个重复，在30℃条件下培养，定时取样检测各项发酵性能指标。在发酵的不同时间点取出发酵液1mL，振荡后进行适当稀释，将稀释液8000r/min离心5min，用SBA-40C型生物传感分析仪测定乙醇和葡萄糖(g/L)。结果显示：发酵12h后重组菌株KN-1-24的糖利用率和产乙醇能力均高于原始酵母菌KN-1；在纤维素水解液中，重组菌株KN-1-24与原始酵母菌KN-1相比，乙醇产量高9.8％，发酵周期缩短6h；在发酵36h后，重组菌株KN-1-24培养基中的葡萄糖基本完全消耗，而此时原始酵母菌KN-1培养基中的残糖量为34g/L。可见，改良后的重组菌株KN-1-24具有较高的糖利用率和产乙醇能力，可实现缩短发酵周期，显著提高发酵效率。

S3，对重组菌株进行活化培养，得到酵母菌种子液；

S5，对发酵液离心、过滤除菌，得到菌类发酵产物。

具体地，对发酵液离心、过滤除菌具体为：对发酵液8000r/min离心20min，以除残渣收集上清；然后经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌，即得菌类发酵产物。

对菌类发酵产物中的主要功效成分及含量进行检测，其结果如表1所示。表1中蛋白质的检测方法参照GB5009.5-2010；粗多糖的检测方法参照GB5009.8-2008；总黄酮(以芦丁计)的检测方法参照DB13T385-1988；多酚的检测方法参照GB/T8313-2008；氨基酸的检测方法参照GB/T5009.124-2003。

表1菌类发酵产物的主要功效成分及含量

可见，通过以包括松茸的菌类为底物，并以经原始酵母菌株改良的重组菌株为菌种，进行发酵、离心、过滤除菌得到菌类发酵产物，一来实现大大提高菌类的资源利用率和营养附加值；二来相较于直提法，避免了有机溶剂和酶的添加，既安全环保，又能节约成本；三来菌类发酵产物富含黄酮、多酚、多肽及各种氨基酸等成分。

对菌类发酵产物进行如下性能检测：

(1)对菌类发酵产物进行抗氧化功效评。

通过总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)检测菌类发酵产物对各种活性氧(羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢等)的清除能力。

将菌类发酵产物(样品)配制成不同浓度(1.25、2.50、5.00、10.0、20.0％(v/v))的待测液，在96孔板中按照表2中各试剂添加量配制反应体系，混匀，每个浓度设置3个复孔，1个背景对照孔。

表2 ABTS自由基清除试验反应体系

室温孵育2～6min后，于734nm下读取吸光度OD值，计算样品对ABTS自由基的清除率。

样品对ABTS自由基清除率(％)＝[(C1﹣C2)﹣(T1﹣T2)]/(C1﹣C2)×100％

式中：C1——空白有ABTS体系吸光度值；C2——空白无ABTS体系吸光度值；T1——样品组有ABTS体系吸光度值；T2——样品组无ABTS体系吸光度值。

表3 ABTS自由基清除试验结果分析(Mean±SD)

从表2可知，菌类发酵产物(即样品)具有清除ABTS自由基的能力，随着样品浓度的增加，其清除自由基的能越强，且20％(v/v)的菌类发酵产物可清除75.21±1.20％的ABTS自由基，说明菌类发酵产物具有较好的抗氧化活性，参见图2。

(2)对菌类发酵产物进行抗衰老功效评价。

2.1体外皮肤修复与再生功效评估(NHDFs细胞增殖能力)

通过MTT法检测人皮肤成纤维细胞(NHDFs)相对增殖能力。

收集对数生长期细胞，按照细胞密度为6×10³个/孔接种至96孔板，每孔含培养液100μL。在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养24h后，样品由低到高分别设定0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.0％(v/v)7个给药浓度，以1％FBS作为阳性对照，以未处理细胞作为阴性对照，每组设置4个重复孔。

加药后在培养箱(37℃，5％CO₂)中继续培养48h，然后进行MTT试验，以不做MTT处理作为背景对照，每个浓度设置1个背景对照，以MTT处理不含细胞的微孔作为空白对照，于490/603nm下读取吸光度OD值，空白对照平均OD值应小于0.1。按照以下公式计算细胞相对增殖能力。

相对增殖能力(％)＝(给药孔OD﹣给药背景OD)/(溶剂对照孔OD﹣溶剂对照背景OD)×100％。

表4细胞增殖检测结果分析(作用48h)

从表4可知，菌类发酵产物(即样品)具有促进人皮肤成纤维细胞(NHDFs)增殖的能力。与阴性对照比较，当样品浓度在0.3％左右时，就能明显促进NHDFs细胞的增殖，随着样品浓度的增加，NHDFs细胞的增殖能力越强；当样品浓度达到10％时，可促进NHDFs增殖能力提升至阴性对照的4.47±0.25倍，参见图3。

2.2体外紧致抗皱功效评估(胶原蛋白I含量)

通过ELISA法检测I型胶原蛋白含量。

收集对数生长期人皮肤成纤维细胞(NHDFs)，按照细胞密度为6×10⁴个/孔接种至12孔板。在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养24h后，根据细胞毒性结果，按照10％(v/v)浓度加入样品，以50μg/mL抗坏血酸(VC)作为阳性对照，以未处理细胞作为阴性对照，以反应体系试剂及溶剂作为溶剂对照，每组设置3个重复孔。

加药后在培养箱(37℃，5％CO₂)中继续培养48h，收集培养液。采用Col IELISA试剂盒进行培养液中Ⅰ型胶原蛋白含量的检测，计算I型胶原蛋白相对溶剂对照的相对含量。

I型胶原蛋白相对含量＝给药孔胶原蛋白含量÷阴性对照孔胶原蛋白含量

表5 I型胶原蛋白相对含量结果分析(Mean±SD)

从表5可知，基于促人皮肤成纤维细胞I型胶原蛋白合成试验结果，菌类发酵产物(即样品)具有一定的紧致抗皱功效，浓度为10％(V/V)的样品可促进I型胶原蛋白合成能力提升至阴性对照的6.87±0.79倍，明显高于阳性对照组，参见图4。

(3)菌类发酵产物美白功效评价。

收集对数生长期小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10)，按照细胞密度为8×10⁵个/瓶接种至T25细胞培养瓶。在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养24h后，根据细胞毒性结果，加入浓度10％(v/v)的样品，1％抗坏血酸葡糖苷(AA2G)作为阳性对照，以未处理细胞作为阴性对照，每组设置3个平行。

加药后在培养箱(37℃，5％CO₂)中继续培养48h，用0.25％胰酶消化收集细胞并计数，取相等数量的细胞离心后，弃去上清，加入0.5mL含10％DMSO的1M NaOH，放入80℃水浴30min，离心后取上清液加入96孔板，以含10％DMSO的1M NaOH作为空白对照，于475nm下读取吸光度值并计算细胞黑素相对含量。

细胞黑素相对含量(％)＝(给药孔OD﹣空白孔OD)/(对照孔OD﹣空白孔OD)×100％。

表6相对黑色素含量结果分析(Mean±SD)

从表6可知，检测结果如表6所示，基于黑色素合成抑制实验结果，样品具有较好的美白效果，浓度为10％(V/V)的样品可抑制44.01±0.77％的黑色素生成，参见图5。

由此可见，从菌类发酵产物的性能检测结果可知，菌类发酵产物能有效地促进人皮肤成纤维细胞(NHDFs)的***增殖，并促进其对Ⅰ型胶原蛋白的合成，同时有较好的自由基清除能力以及抑制黑色素生成的能力，因而能够提高抗衰老、抗氧化及美白的功效，可广泛应用到各类化妆品中。

进一步地，在步骤S2中，对原始酵母菌株进行诱变后筛选出重组菌株包括：

具体地，将原始酵母菌株KN-1在酵母浸出粉胨葡萄糖(YEPD)液体培养基中培养22h至菌体生长对数期，得到菌液，以此材料进行以下的化学诱变实验。

取5mL菌液于5000r/min离心5min收集菌体，并用0.2mol/L磷酸缓冲液(PB，pH值5.8)洗涤2次，以使细胞重新悬浮于2.5mL的磷酸缓冲液中，得到重悬菌液，通过离心和两次洗涤去除液体培养基，充分洗涤菌体，并重悬于合适的缓冲液中。

在15mL灭菌的离心管加入500μL重悬菌液、490μL磷酸缓冲液和10μL硫酸二乙酯，涡旋振荡混匀，以启动酵母菌株化学诱变的反应。可选地，重悬菌液、磷酸缓冲液和硫酸二乙酯按体积比为40～60:40～55:1。本实施例中，重悬菌液、磷酸缓冲液和硫酸二乙酯按体积比为50:49:1。

在30℃、200r/min条件下培养25～45min，加入其体积5倍的25％的硫代硫酸钠溶液终止反应，得到诱变后的反应菌液，这样，实现了对原始酵母菌株KN-1进行第一次突变。

将反应菌液进行稀释后，涂布于抑制物耐受性筛选固体培养基上，30℃恒温培养48h后，然后进行抑制物耐受性筛选，其中抑制物包括乙酸和糠醛。

由此，通过对原始酵母菌株KN-1进行化学诱变，并通过抑制物耐受性筛选得到具有乙酸耐受性的第一突变菌株KN-1-8、KN-1-16和糠醛耐受性的第二突变菌株KN-1-3、KN-1-5，其中第一突变菌株最高能在含1～8g/L乙酸的抑制物耐受性筛选固体培养基上正常生长的突变菌株，第二突变菌株最高能在含0.1～1.5g/L糠醛的抑制物耐受性筛选固体培养基上正常生长。

S23，通过抑制物耐受性筛选得到重组菌株。

具体地，在基因组DNA诱变和/或遗传转化后，立即加入一定体积的山梨醇溶液并轻轻混匀，以保持菌体的活性；转移到5.0mL离心管中，加入1mLYEPD液体培养基，在30℃下孵育2h；孵育完成后，8000r/min离心3min收集细胞，并将细胞重悬于1mL无菌超纯水；均匀涂布在含有一定浓度乙酸和糠醛的抑制物耐受性筛选固体培养基上，以筛选得到同时在1～8g/L乙酸和0.1～1.5g/L糠醛的抑制物耐受性筛选固体培养基上生长较好的重组菌株KN-1-24。

由此，通过先对原始酵母菌株KN-1进行第一次突变，以筛选得到具有乙酸耐受性的第一突变菌株和糠醛耐受性的第二突变菌株，再对第一突变菌株和第二突变菌株进行第二次突变，以筛选得到同时在1～8g/L乙酸和0.1～1.5g/L糠醛的抑制物耐受性筛选固体培养基上生长较好的重组菌株KN-1-24，有效保证改良后的重组菌株兼具乙酸耐受性和糠醛耐受性。

将原始酵母菌KN-1、第一突变菌株KN-1-8、第一突变菌株KN-1-16、第二突变菌株KN-1-3、第二突变菌株KN-1-5和重组菌株KN-1-24接种于10mL YEPD液体培养基中，在同等条件下培养后，以10％接种量分别转接到100mL抑制物耐受性发酵培养基和纤维素水解液发酵培养基中，每个条件设3个重复，在30℃条件下培养，定时取样检测各项发酵性能指标。在发酵36h后取出发酵液1mL，振荡后进行适当稀释，将稀释液8000r/min离心5min，用SBA-40C型生物传感分析仪测定乙醇和葡萄糖(g/L)，检测结果见表7。

表7各样品的糖利用率和产乙醇能力的对比结果

从表7可看出，重组菌株KN-1-24的糖利用率和产乙醇能力均高于原始酵母菌以及第一、第二突变菌株，第一突变菌株KN-1-16的糖利用率和产乙醇能力仅次于重组菌株KN-1-24。因此，重组菌株KN-1-24具有较高的糖利用率和产乙醇能力，能够缩短其后期发酵所需周期，大大提高发酵效率。

进一步地，在步骤S22中，对第一突变菌株和第二突变菌株进行基因组DNA诱变和/或遗传转化包括：

S221,提取第一突变菌株和第二突变菌株的总基因组DNA用于转化得到酵母菌菌液；

具体地，采用Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒，提取第一突变菌株KN-1-16和第二突变菌株KN-1-3的总基因组DNA；取50mL培养至菌体生长对数期，以转化得到酵母菌菌液，该酵母菌菌液为突变菌株KN-1-16和第二突变菌株KN-1-3菌液。

S222，将酵母菌菌液进行离心收集和重悬处理，得到感受态细胞。

具体地，对酵母菌菌液离心收集一级菌体后，用醋酸锂﹣二硫苏糖醇混合液重悬处理；再次离心收集二级菌体后，用预冷的无菌水冲洗，重悬于预冷的山梨醇溶液得到感受态细胞。可选地，预冷的无菌水冲洗为4℃左右的无菌水冲洗；预冷的山梨醇溶液为4℃左右的山梨醇溶液。

在本实施例中，先在4℃下5000r/min离心5min收集一级菌体，用等体积预冷的醋酸锂﹣二硫苏糖醇混合液(醋酸锂﹣二硫苏糖醇的体积比优选为7～11:1)重悬，处理20min；再在4℃下5000r/min离心5min收集菌体，用预冷的无菌水冲洗2次，最终重悬于1mL预冷的1mol/L山梨醇溶液得到感受态细胞，置于冰上备用，以保存感受态细胞的活力。由此，通过进行二次离心收集菌体去除醋酸锂﹣二硫苏糖醇混合液，充分洗涤菌体，浓缩菌液体积，得到相对纯净的感受态细胞。

更进一步地，在步骤S22中，第一突变菌株和第二突变菌株进行基因组DNA诱变和/或遗传转化还包括：

S223，取等量的第一突变菌株和第二突变菌株的总基因组DNA混合，加入硫酸二乙酯培养，得到待转化DNA；

具体地，取等量第一突变菌株KN-1-16和第二突变菌株KN-1-3的总基因组DNA混合后，加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯最终体积分数为1％，然后在37℃温育1h，培养完成后即得待转化DNA，备用。

S224，感受态细胞与待转化DNA按体积比为2:1混合，置于电转化杯中进行电击处理。

具体地，分别取80μL感受态细胞与20μL待转化DNA混合后，移入100μL电转化杯中，在2.0kV电压下电击，以使混合物发生变性。

由此，通过培养第一突变菌株KN-1-16和第二突变菌株KN-1-3制得感受态细胞，再取等量第一突变菌株和第二突变菌株的总基因组DNA混合培养制得待转化DNA，最后将感受态细胞与待转化DNA按体积比为2:1混合、电击处理，将第一突变菌株和第二突变菌株的总基因组DNA导入感受态细胞中。

进一步地，在步骤S3中，对重组菌株进行活化培养具体为：将重组菌株KN-1-24接种于种子培养基中，28～30℃、180～200r/min摇床震荡培养16～20h。可选地，重组菌株KN-1-24与种子培养基的体积比为5～10。种子培养基包括葡萄糖10～30g/L、酵母提取物5～15g/L和蛋白胨10～30g/L。

本实施例还提供了一种化妆品，该化妆品应如上所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，由此，通过菌类发酵产物的制备工艺，制得一种菌类发酵产物，该菌类发酵产物富含黄酮、多酚、多肽及各种氨基酸等成分，能有效地促进人皮肤成纤维细胞(NHDFs)的***增殖，并促进其对Ⅰ型胶原蛋白的合成，同时有较好的自由基清除能力以及抑制黑色素生成的能力，因而能够提高抗衰老、抗氧化及美白的功效，可广泛应用到各类化妆品中。

对比例1

本对比例与实施例的区别在于，步骤S2不同，即省去步骤S2中的子步骤S22至步骤S23，从而使得步骤S2筛选出重组菌株不同。在本对比例中，重组菌株为第一突变菌株KN-1-8、KN-1-16。

对比例2

本对比例与本对比例1区别在于，重组菌株为第二突变菌株KN-1-3、第二突变菌株KN-1-5。

在相同测试条件下，分别对实施例、对比例1-2制得的菌类发酵物进行ABTS自由基清除率、细胞相对增殖能力、I型胶原蛋白合成能力和黑色素相对抑制率测试，结果参见表8。

表8不同菌类发酵物的检测指标的结果对比

从表8可知，在相同测试条件下，实施例制得的菌类发酵物对ABTS自由基清除率、细胞相对增殖能力、I型胶原蛋白合成能力和黑色素相对抑制率均优于对比例1-2制得的菌类发酵物。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种菌类发酵产物的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

S1，将菌类粉碎、过筛，制得菌类粉备用；

S3，对重组菌株进行活化培养，得到酵母菌种子液；

S5，对发酵液离心、过滤除菌，得到菌类发酵产物。

2.根据权利要求1所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，其特征在于，所述对原始酵母菌株进行诱变后筛选出重组菌株包括：

S23，通过筛选得到重组菌株。

3.根据权利要求2所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，其特征在于，所述将原始酵母菌株进行化学诱变、筛选包括：

将原始酵母菌株在液体培养基中培养、离心收集菌体，并用磷酸缓冲液洗涤后得到重悬菌液；

在15mL灭菌的离心管加入重悬菌液、磷酸缓冲液和硫酸二乙酯，涡旋振荡混匀后培养20～40min，加入硫代硫酸钠溶液终止反应，得到诱变后的反应菌液；

反应菌液进行稀释后，涂布于抑制物耐受性筛选固体培养基上培养，然后进行抑制物耐受性筛选。

4.根据权利要求3所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，其特征在于，所述重悬菌液、磷酸缓冲液和硫酸二乙酯按体积比为40～60:40～55:1。

5.根据权利要求2所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，特征在于，所述对第一突变菌株和第二突变菌株进行基因组DNA诱变和/或遗传转化包括：

提取第一突变菌株和第二突变菌株的总基因组DNA用于转化得到酵母菌菌液；

将酵母菌菌液进行离心收集和重悬处理，得到感受态细胞。

6.根据权利要求5所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，其特征在于，所述将酵母菌菌液进行离心收集和重悬处理包括：

对酵母菌菌液离心收集一级菌体后，用醋酸锂﹣二硫苏糖醇混合液重悬处理；

再次离心收集二级菌体，然后用预冷的无菌水冲洗。

7.根据权利要求5或6所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，其特征在于，所述对第一突变菌株和第二突变菌株进行基因组DNA诱变和/或遗传转化还包括：

取等量的第一突变菌株和第二突变菌株的总基因组DNA混合，加入硫酸二乙酯培养，得到待转化DNA；

感受态细胞与待转化DNA按体积比为2:1混合，置于电转化杯中进行电击处理。

8.根据权利要求1所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，其特征在于，在步骤S3中，所述对重组菌株进行活化培养具体为：将重组菌株接种于种子培养基中，28～30℃、180～200r/min摇床震荡培养16～20h。

9.根据权利要求8所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，其特征在于，所述重组菌株与所述种子培养基的体积比为5～10；所述种子培养基包括葡萄糖10～30g/L、酵母提取物5～15g/L和蛋白胨10～30g/L。

10.根据权利要求1所述的一种菌类发酵产物的制备工艺，其特征在于，在步骤S4中，所述液体发酵培养基包括菌类10～20g/L和碳源10～30g/L，其中所述菌类包括松茸，所述碳源包括蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和麦芽糖醇中的至少一种。

11.化妆品，其特征在于，包括权利要求1-10中任一项所述的一种菌类发酵产物的制备工艺。