CN113122606B - 一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基 - Google Patents

一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基 Download PDF

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Abstract

本申请涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基。一种核黄素的发酵方法，包括以下步骤：S1、种子活化；S2、种子培养；S3、发酵培养基配制；S4、酶解处理；S5、灭菌处理；S6、发酵培养。所用的发酵培养基，按重量百分比计算，其原料组成及含量如下：蔗糖3‑5%、酵母浸粉0.5‑1.5%、豆粕粉0.5‑0.8%、玉米蛋白粉0.5‑0.8%、棉籽饼粉0.3‑0.4%、甜菜碱0.15‑0.30%、氯化钠0.20‑0.30%、碳酸钙0.15‑0.40%、余量为水。本申请通过酶解将培养基中大分子裂解成小分子，具有能够增加出液体积，并提高发酵水平的优点。

Description

一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基
技术领域
本申请涉及微生物发酵技术领域，更具体地说，它涉及一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基。
背景技术
核黄素(Riboflavin)又名维生素B2，化学名称7，8-二甲基-10-(D-1-核糖基)异咯嗪，分子式C17H20N4O6，是一种人和动植物必需的水溶性维生素，在医药行业、养殖业、种植业等领域有广泛应用。微生物发酵法是目前唯一被采用的核黄素工业化生产方法，常用的生产菌有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、棉囊阿舒霉(Ashbya gossypii)、无名假丝酵母(Candidafamata)及阿舒假囊酵母(Eremotheciumashbya)。
目前，国内核黄素的发酵生产水平以50吨罐为例，单位浓度产量为20g/L,出液体积为35吨左右，主要研究方向集中在在菌种选育，培养基优化等方面，对于泡沫的控制多采用直接添加消泡剂，但随着发酵过程中补料的进行，消泡剂的添加量难以与发酵液保持适配，核黄素发酵过程中，消泡剂过多或过少，均会导致泡沫产生量过大，继而对生产水平造成巨大影响，主要体现在逃液、发酵罐实际装量减少，从而使得单罐产出减少。
发明内容
为了减少发酵过程中的泡沫产生，达到提高装液量、提升核黄素的发酵水平的目的，本申请提供一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基。
本申请提供的一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基采用如下的技术方案：
第一方面，本申请提供核黄素的发酵方法，采用如下的技术方案：
一种核黄素的发酵方法,包括以下步骤：
S1、种子活化：将甘油管保存的枯草芽孢杆菌自然解冻，挑取0.5-1.0mL枯草芽孢杆菌菌落接至装有活化培养基的三角瓶中，于培养箱中200-300r/min，37℃培养20-24h，得到活化种子；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC20872，保藏日期2007年2月9日；
S2、种子培养：吸取S1中得到的活化种子按体积比计算，即活化种子：种子培养基的体积比为5-10：100，将活化种子接种于培养罐中的种子培养基，然后通过控制通气量在1V/V.M，溶氧量DO为20-40％，37℃进行培养20-24h，得到种子液；
S3、发酵培养基的配方及配制：
所述发酵培养基，按重量百分比计算，其原料组成及含量如下：
蔗糖3-5％
酵母浸粉0.5-1.5％
豆粕粉0.5-0.8％
玉米蛋白粉0.5-0.8％
棉籽饼粉0.3-0.4％
甜菜碱0.15-0.30％
氯化钠0.20-0.30％
碳酸钙0.15-0.40％
余量为水；
将所述发酵培养基各原料组分混合完成后，加入发酵罐内，控制发酵罐的装液量按体积比计算，即发酵培养基：发酵罐的体积比为50-60：100；
S4、酶解处理：室温条件下，向发酵罐中加入酶，并对发酵培养基进行酶解处理10-30min，得到酶解后的发酵培养基；
所述酶为纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶中的一种或两种及以上，酶的添加量按发酵培养基中的氮源计算，酶10-30U/克氮源，其中所述的氮源为豆粕粉、玉米蛋白粉、棉籽饼粉；
S5、灭菌处理：控制温度120-125℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30-45min，得到培养液；
S6、发酵培养：将发酵罐内的培养液降温至37℃后，将培养好的种子液按体积比计算，即种子液：培养液的体积比为5-10：100的比例，将种子液接种于发酵罐的培养液中控制通气量在1V/V.M，溶氧量为20-40％，pH为6.8-7.2，进行发酵72h，得到发酵液；
上述发酵过程中通过补料控制发酵罐中的培养液的还原糖浓度维持在1.0％以下，所述补料采用的补料培养基为质量百分比浓度为40-60％的葡萄糖水溶液。
通过采用上述技术方案，由于预先采用酶对发酵培养基进行酶解，使得发酵培养基中的碳源、氮源自高分子裂解为小分子状，便于菌体的吸收，含有的少量类生产因子能高效的促进菌体的繁殖发育，且小颗粒状的碳源或氮源不易产生泡沫，单罐的实际装液量较高，因此，获得了较高发酵水平的效果。
优选的，S3中所述发酵培养基中按重量百分比计算，还包括0-0.30％的发酵液残渣；所述发酵液残渣是所述的发酵方法最终得到的发酵液提取核黄素后剩余的残液采用电渗析除去盐分后，用双锥卧螺离心机在4000-5000r/min下离心30-60min，再经过滤、控制温度为200-350℃烘干得到的残渣。
通过采用上述技术方案，选用发酵液残渣作为氮源的补充，充分循环利用了资源，其相对颗粒较小，菌体易于吸收，且死亡菌体中含有促进菌体维持较高活力的微量成分，继而保障了发酵菌体的发酵水平。
优选的，S4中所述酶的酶解温度为25-55℃。
通过采用上述技术方案，调整培养基的温度至纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶相对适宜的温度，使得氮源及碳源中的纤维素、脂肪、蛋白质等高分子被酶解更充分，培养液更有利于菌体繁殖发育，且通过控制温度使得不同酶解阶段时，该阶段对应的酶活性最高，提高了分步酶解的效果，从而提高了核黄素的发酵水平。
优选的，S4中所述酶为纤维素酶、脂肪酶或蛋白酶中任意两种按质量比1：1组成。
通过采用上述技术方案，同时加入两种酶并选用相同的用量，进一步保障了两种酶之间的配合作用，酶解处理时，酶解可正常进行的同时，培养基中各组分不易因酶解程度差异性较大，导致发酵水平降低。
优选的，S4中所述酶为纤维素酶和脂肪酶或纤维素酶和蛋白酶的组合，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为45-55℃、pH为4.5-5.5，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理8-12min后，再加入脂肪酶或蛋白酶；
当加入蛋白酶时，上述纤维素酶进行酶解处理结束后，先控制发酵培养基的温度为35-45℃、pH为5.5-6.5，再向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理18-22min；
当加入脂肪酶时，上述纤维素酶进行酶解处理结束后，先控制发酵培养基的温度为25-35℃、pH为6.5-7.5，再向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理18-22min。
通过采用上述技术方案，先向发酵培养基中添加纤维素酶，通过纤维素酶对纤维素的分解、软化，使得部分有机氮源中的植物细胞壁被裂解破坏，继而有利于有机氮源中蛋白质或脂肪的溶出，此时再添加脂肪酶或蛋白酶时，有利于酶解反应的进行。
优选的，S4中所述酶为脂肪酶和蛋白酶的组合，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为35-45℃、pH为5.5-6.5，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理8-12min后，再控制发酵培养基的温度为25-35℃、pH为6.5-7.5，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理18-22min。
通过采用上述技术方案，先向发酵培养基中添加纤维素酶或蛋白酶时，通过蛋白酶的酶解作用，有利于有机氮源细胞中蛋白质或脂肪溶出，此时再添加脂肪酶时，酶解更迅速，且酶解得到的甘油，可作为天然消泡剂，一定程度上起到了减少了泡沫产生的效果。
优选的，S4中所述酶为纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶中按质量比1：1：1组成。
通过采用上述技术方案，同时加入三种酶并选用相同的用量，并通过三种酶之间的的配合使用，使得培养基中纤维素、蛋白质、脂肪组分酶解更充分，且酶解程度差异性较低，继而提高了发酵水平。
优选的，S4中所述酶为纤维素酶、蛋白质酶和脂肪酶的组合，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为45-55℃、pH为4.5-5.5，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理8-12min后，再控制发酵培养基的温度为35-45℃、pH为5.5-6.5，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理8-12min，最后控制发酵培养基的温度为25-35℃、pH为6.5-7.5，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理8-12min。
通过采用上述技术方案，按照纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶的添加顺序依次加入至发酵培养基内后，多种酶的配合使用，作用于有机氮源的细胞壁、细胞膜等结构，纤维素被水解的同时，蛋白质、脂肪等被快速溶出，相同酶解时间下，酶解更为充分。
优选的，S6的发酵过程中发酵罐内培养液的还原糖浓度维持在0.8-1.0％。
通过采用上述技术方案，通过补料补料培养基将培养液中的还原糖浓度维持在0.8-1.0％，使得培养液中菌体可最大程度生产核黄素的同时，不易因营养物质不足造成菌体死亡，继而影响发酵水平现象的发生。
第二方面，本申请提供一种发酵培养基，采用如下的技术方案：
一种发酵培养基，按重量百分比计算，其原料组成及含量如下：
蔗糖3-5％
酵母浸粉0.5-1.5％
豆粕粉0.5-0.8％
玉米蛋白粉0.5-0.8％
棉籽饼粉0.3-0.4％
甜菜碱0.15-0.30％
氯化钠0.20-0.30％
碳酸钙0.15-0.40％
发酵液残渣0-0.30％
余量为水；
所述发酵液残渣是所述的发酵方法最终得到的发酵液提取核黄素后剩余的残液采用电渗析除去盐分后，用双锥卧螺离心机在4000-5000r/min下离心30-60min，再经过滤、控制温度为200-350℃烘干得到的残渣。
通过采用上述技术方案，选用豆粕粉、玉米蛋白粉、棉籽饼粉作为有机氮源，颗粒较厚的同时，脂肪含量较高，因此不易起泡,且豆粕粉与玉米蛋白粉中含有少量类生长因子，可促进菌体的繁殖发育。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请的一种核黄素的发酵方法，由于采用酶对发酵培养基进行酶解，使得发酵培养基中的碳源、氮源自高分子可裂解为小分子状，因此，使得发酵罐内碳源、氮源菌种便于吸收的同时，不易产生泡沫，单罐的实际装液量较高，最终装液量可达发酵罐容积的76—86％，相对于相关技术提高了6-16％；
2、本申请中核黄素的发酵方法，由于采用多种酶共同酶解，并按照纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶的特定添加顺序酶解，使得碳源、氮源中的高分子更快的被裂解成小分子的同时，裂解也更为充分，菌体在发酵过程中对于各种营养物质的吸收更高效，因此，获得了较高发酵水平的效果；
进一步，由于特定的发酵培养和酶解的协同作用，提高了单位发酵液中的发酵产物核黄素的产量，其产量为21.8-24.0g/L，相对于相关技术，最终核黄素产量提高了9-20％；
3、本申请中的培养基，通过采用原料来源广、颗粒厚，且脂肪含量较高的豆粕粉、玉米蛋白粉和棉籽饼粉作为氮源，配比适量的发酵液残渣，使得菌体不易起泡的同时，营养物质丰富，有利于菌体的繁殖发育。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
全自动还原糖检测仪SD-4，厂家：山东省生物传感器重点实验室；
双锥卧螺离心机，厂家：上海依路机电设备有限公司；
超滤膜分离浓缩设备，福美科技FMT，采购厂家:厦门福美科技有限公司；
玉米浆干粉，焦作市豫新药辅有限公司生产；
豆粕粉，扶风斯诺特生物科技有限公司生产；
棉籽饼粉，北京鸿润宝顺科技有限公司生产；
酵母浸粉，山东玉宝生物科技股份有限公司生产；
甜菜碱，济南亚西亚药业有限公司生产；
纤维素酶本身的酶活力5万U/g，采购厂家:宁夏夏盛实业集团；
蛋白酶本身的酶活力10万U/g，采购厂家:宁夏夏盛实业集团；
脂肪酶本身的酶活力10万U/g，采购厂家:宁夏夏盛实业集团。
原料的制备例
制备例1：
所述活化培养基与种子培养基各组分配比相同，按每升计算，由15g葡萄糖、4g玉米浆干粉、尿素1g、余量水组成。
制备例2：
发酵液残渣的制备：对实施例1的核黄素的发酵方法最终所得的发酵液提取完核黄素后所得的残渣用超滤膜分离浓缩设备电渗析2h，进行处理以除去其中的盐分，然后用双锥卧螺离心机在4000r/min的转速下离心30min后，然后再经过滤、温度为200℃进行烘干，即得发酵液残渣。
制备例3：
发酵液残渣的制备：对实施例1的核黄素的发酵方法最终所得的发酵液提取完核黄素后所得的残渣用超滤膜分离浓缩设备电渗析3h，除去发酵液中盐分，以双锥卧螺离心机在4500r/min的转速下离心45min后，然后再经过滤、温度为275℃进行烘干，即得发酵液残渣。
制备例4：
发酵液残渣的制备：对实施例1的核黄素的发酵方法最终所得的发酵液提取完核黄素后所得的残渣用超滤膜分离浓缩设备电渗析4h，除去发酵液中盐分，以双锥卧螺离心机在5000r/min的转速下离心60min后，然后再经过滤、温度为350℃进行烘干，即得发酵液残渣。
实施例
实施例1：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，发酵培养基中各组分的重量份数如表1所示，并通过如下步骤进行发酵：
一种核黄素的发酵方法,包括以下步骤：
S1、种子活化：将甘油管保存的枯草芽孢杆菌自然解冻，挑取0.5mL枯草芽孢杆菌菌落接至装有100mL活化培养基的500ml三角瓶中，于培养箱中200r/min，37℃培养20h，得到活化种子。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC 20872，保藏日期2007年2月9日；
所述活化培养基为制备例1中制得的活化培养基。
S2、种子培养：吸取S1中得到的活化种子按体积比计算，即活化种子：种子培养基的体积比为5：100，将活化种子接种于3吨培养罐中的种子培养基中，然后通过控制通气量在1V/V.M，溶氧量DO为20％，37℃进行培养20h，得到种子液。
所述种子培养基为制备例1中制得的种子培养基。
S3、发酵培养基的配制：将发酵培养基按表1各组分比例配制后，加入50吨发酵罐内，控制50吨发酵罐的装液量按体积比计算,即发酵培养基：发酵罐的体积比为50：100。
S4、酶解处理：室温条件下，向发酵培养基内加入纤维素酶进行酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5，再向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理30min，酶的添加量为每克氮源10U，得到酶解后的发酵培养基。
S5、灭菌处理：控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
S6、发酵培养：将发酵罐内的培养液降温至37℃后，将培养好的种子液按体积比计算，即种子液：培养液的体积比为5：100的比例，将种子液接种于发酵罐的培养液中控制通气量在1V/V.M，溶氧量为20％，pH为6.8，进行发酵72h，得到发酵液；
上述发酵过程中通过补料控制发酵罐中的培养液的还原糖浓度维持在1.0％，所述补料采用的补料培养基为质量百分比浓度为50％的葡萄糖水溶液，所述发酵过程中的还原糖浓度通过全自动还原糖检测仪SD-4进行测定。
实施例2-6：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，发酵培养基各组分及其相应重量份数如表1所示。
表1实施例1-6中各组分及其重量份数(kg)
实施例7：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，S4中所述酶为纤维素酶和脂肪酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理10min后，再先控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理20min，最后最后控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
实施例8：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，S4中所述酶为纤维素酶、蛋白质酶和脂肪酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理10min后，再控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理10min，最后控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理10min。酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
实施例9：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，所述S6中发酵培养的过程中，通过补料控制发酵罐中的培养液的还原糖浓度维持在0.8％。
实施例10：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，所述发酵培养基的氮源中含有制备例2中的发酵液残渣1.0kg。
实施例11：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，所述发酵培养基的氮源中含有制备例3中的发酵液残渣1.0kg。
实施例12：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，所述发酵培养基的氮源中含有制备例4中的发酵液残渣1.0kg。
实施例13：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，所述发酵培养基的氮源中含有制备例2中的发酵液残渣2.0kg。
实施例14：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，所述发酵培养基的氮源中含有制备例2中的发酵液残渣3.0kg。
对比例
对比例1：
一种核黄素的发酵方法，与实施例1的不同之处在于，所述发酵培养基中各组分重量份数如下，蔗糖30kg、黄豆粉5kg、玉米浆干粉5kg、NaCl 2kg、水958kg，所述发酵步骤中不含酶解。
对比例2：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例10的不同之处在于，所述发酵培养基中不含碳酸钙。
对比例3：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，所述S6中发酵培养的过程中，通过补料控制发酵罐中的培养液的还原糖浓度维持在0.6％。
对比例4：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，所述S6中发酵培养的过程中，通过补料控制发酵罐中的培养液的还原糖浓度维持在1.2％。
对比例5：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，将发酵培养基按表1各组分比例配制后，向发酵培养基内加入蛋白酶进行酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，再向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理30min，酶的添加量为每克氮源10U，酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例6：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，将发酵培养基按表1各组分比例配制后，向发酵培养基内加入脂肪酶进行酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7.0，再向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理30min，酶的添加量为每克氮源10U，酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例7：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例7的不同之处在于，S4中所述酶为纤维素酶和蛋白酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5.0，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理10min后，再先控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理20min，酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例8：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例7的不同之处在于，S4中所述酶为蛋白酶和纤维素酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理10min后，再先控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5.0，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理20min，酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例9：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例7的不同之处在于，S4中所述酶为蛋白酶和脂肪酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理10min后，再先控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7.0，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理20min，酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例10：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例7的不同之处在于，S4中所述酶为脂肪酶和纤维素酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7.0，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理10min后，再控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5.0，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理20min，酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例11：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例7的不同之处在于，S4中所述酶为脂肪酶和蛋白酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7.0，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理10min后，再控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理20min，酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例12：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例8的不同之处在于，S4中所述酶为纤维素酶、蛋白质酶和脂肪酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5.0，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理10min后，再控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7.0，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理10min，最后控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理10min，酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例13：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例8的不同之处在于，S4中所述酶为纤维素酶、蛋白质酶和脂肪酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理10min后，再控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5.0，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理10min，最后控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7.0，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理10min，酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例14：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例8的不同之处在于，S4中所述酶为纤维素酶、蛋白质酶和脂肪酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理10min后，再控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7.0，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理10min，最后控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5.0，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理10min。酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例15：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例8的不同之处在于，S4中所述酶为纤维素酶、蛋白质酶和脂肪酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7.0，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理10min后，再控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5.0，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理10min，最后控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理10min。酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
对比例16：
一种核黄素的发酵方法及所用发酵培养基，与实施例1的不同之处在于，S4中所述酶为纤维素酶、蛋白质酶和脂肪酶的组合，且酶的用量均为每克氮源添加10U，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为30℃、pH为7.0，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理10min后，再控制发酵培养基的温度为40℃、pH为6.0，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理10min，最后控制发酵培养基的温度为50℃、pH为5.0，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理10min。酶解完成后，控制温度120℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30min，得到培养液。
性能检测试验
分别以实施例1-14和对比例1-16中制得的发酵液作为测试对象，记录出料体积记入表2中，并分别称取1g加入至30组100mL烧杯中，加入2mL冰醋酸和20mL水，加热煮沸5min，冷却后移入250mL容量瓶并定容。摇匀后过滤，取滤液用分光光度计于444nm条件下比色测定，根据标准曲线(y＝0.03x+0.008，其中y为吸光度，x为核黄素质量浓度)计算核黄素含量，再乘以出体积，得到单罐产出，测试结果记入表2中。
设置对照组：待测样液为去离子水。
表2性能检测结果
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由实施例1-9并结合表2可以看出，采用本申请中培养基所发酵产生的核黄素生产水平较高，均高于相关技术中的20g/L,提高了9-20％，实际装液量均高于70％，提高了6-16％，且配合纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶的使用后，培养液中还原糖浓度在0.8-1.0％时，核黄素的生产水平和实际装液量提高明显，其中实施例5和实施例8为优选实施例，采用实施例5中的培养基配比时发酵单罐产出最高为932.0kg，采用实施例8中酶解工艺处理后的发酵单罐产出最高为1032kg。
由实施例10-14并结合表2，可以看出，实施例13为优选实施例，加入制备例3中发酵残渣2kg后，相比实施例1，发酵罐中核黄素的生产水平又进一步提高了2％，实际装液量进一步提高了4％。
结合实施例1和对比例1并结合表2可以看出，采用该培养基和酶解工艺的发酵方法，其发酵水平较高，提高了9％，且不易起泡，实际装液量也提升了6％。
结合实施例10和对比例2并结合表2可以看出，通过将发酵液残渣配合适量碳酸钙的使用，发酵液残渣可作为培养基中直接氮源，其不易起泡，消泡效果显著提高，且实际装液量也较高。
结合实施例9和对比例3-4并结合表2可以看出，S4中发酵培养的过程中，通过补料控制发酵罐中的培养液的还原糖浓度维持在0.8％以上，1.0％以下时，发酵水平最高，有利于核黄素的生产。
结合实施例1和对比例5-6并结合表2可以看出，加入单一酶时，加入纤维素酶对培养基进行酶解时，其效果最佳，通过将植物天然氮源的外层细胞壁软化裂解，使其核黄素素浓度和出料体积均有提升。
结合实施例7和对比例7-11并结合表2可以看出，如仅加入两种酶时，纤维素酶与脂肪酶的配合效果较好，且先加入纤维素酶对培养基进行酶解，再加入脂肪酶共同酶解后，其核黄素素浓度和出料体积提升较为明显，通过先将植物天然氮源的外层细胞壁软化裂解，再通过脂肪酶将缓缓油脂裂解成小分子状态，使得培养基中营养物质便于吸收的同时，不易起泡，实际出液体积较高。
结合实施例8和对比例12-16并结合表2可以看出，加入三种酶时，先加入纤维素酶对培养基进行酶解，再加入蛋白酶酶解，最终加入脂肪酶共同酶解的效果最佳，其核黄素素浓度和出料体积提升较为明显，通过先将植物天然氮源的外层细胞壁软化裂解，再裂解大分子蛋白和细胞膜，使得培养基中营养物质便于吸收，且脂肪酶将缓缓油脂裂解成小分子状态，可在发酵过程中可起到天然消泡剂的作用，实际出液体积较高，且分步酶解时，通过调控温度使得该阶段对应的酶活性最高，其余酶仅保持酶活的方式，使得分步酶解效果更充分。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种核黄素的发酵方法,其特征在于，包括以下步骤：
S1、种子活化：将甘油管保存的枯草芽孢杆菌自然解冻，挑取0.5-1.0mL枯草芽孢杆菌菌落接至装有活化培养基的三角瓶中,于培养箱中200-300r/min，37℃培养20-24h，得到活化种子；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC 20872，保藏日期2007年2月9日；
S2、种子培养：吸取S1中得到的活化种子按体积比计算，即活化种子：种子培养基的体积比为5-10：100，将活化种子接种于培养罐中的种子培养基，然后通过控制通气量在1V/V.M，溶氧量DO为20-40％，37℃进行培养20-24h，得到种子液；
S3、发酵培养基配制：
所述发酵培养基，按重量百分比计算，其原料组成及含量如下：
蔗糖3-5％
酵母浸粉0.5-1.5％
豆粕粉0.5-0.8％
玉米蛋白粉0.5-0.8％
棉籽饼粉0.3-0.4％
甜菜碱0.15-0.30％
氯化钠0.20-0.30％
碳酸钙0.15-0.40％
余量为水；
将所述发酵培养基各原料组分混合完成后，加入发酵罐内，控制发酵罐的装液量按体积比计算，即发酵培养基：发酵罐的体积比为50-60：100；
S4、酶解处理：室温条件下，向发酵罐中加入酶，并对发酵培养基进行酶解处理10-30min，得到酶解后的发酵培养基；
所述酶为纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶中的一种或两种及以上，酶的添加量按发酵培养基中的氮源计算，酶10-30U/克氮源，其中所述的氮源为豆粕粉、玉米蛋白粉、棉籽饼粉；
S5、灭菌处理：控制温度120-125℃对酶解后的发酵培养基进行灭菌处理30-45min，得到培养液；
S6、发酵培养：将发酵罐内的培养液降温至37℃后，将培养好的种子液按体积比计算，即种子液：培养液的体积比为5-10：100的比例，将种子液接种于发酵罐的培养液中控制通气量在1V/V.M，溶氧量为20-40％，pH为6.8-7.2，进行发酵72h，得到发酵液；
上述发酵过程中通过补料控制发酵罐中的培养液的还原糖浓度维持在1.0％以下，所述补料采用的补料培养基为质量百分比浓度为40-60％的葡萄糖水溶液。
2.根据权利要求1所述的核黄素的发酵方法，S3中所述发酵培养基中按重量百分比计算，还包括0.10-0.30％的发酵液残渣；
所述发酵液残渣是对权利要求1所述的发酵方法最终得到的发酵液提取核黄素后剩余的残液采用电渗析除去盐分后，用双锥卧螺离心机在4000-5000r/min下离心30-60min，再经过滤、控制温度为200-350℃烘干得到的残渣。
3.根据权利要求1所述的核黄素的发酵方法，S4中所述酶的酶解温度为25-55℃。
4.根据权利要求2所述的核黄素的发酵方法，S4中所述酶由纤维素酶、脂肪酶或蛋白酶中任意两种按质量比1：1组成。
5.根据权利要求4所述的核黄素的发酵方法，S4中所述酶为纤维素酶和脂肪酶或纤维素酶和蛋白酶的组合，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为45-55℃、pH为4.5-5.5，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理8-12min后，再加入脂肪酶或蛋白酶；
当加入蛋白酶时，上述纤维素酶进行酶解处理结束后，先控制发酵培养基的温度为35-45℃、pH为5.5-6.5，再向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理18-22min；
当加入脂肪酶时，上述纤维素酶进行酶解处理结束后，先控制发酵培养基的温度为25-35℃、pH为6.5-7.5，再向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理18-22min。
6.根据权利要求4所述的核黄素的发酵方法，S4中所述酶为脂肪酶和蛋白酶的组合，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为35-45℃、pH为5.5-6.5，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理8-12min后，再控制发酵培养基的温度为25-35℃、pH为6.5-7.5，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理18-22min。
7.根据权利要求1所述的核黄素的发酵方法，S4中所述酶由纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶按质量比1：1：1组成。
8.根据权利要求7所述的核黄素的发酵方法，S4中所述酶为纤维素酶、蛋白质酶和脂肪酶的组合，酶解处理时，先控制发酵培养基的温度为45-55℃、pH为4.5-5.5，向发酵培养基中加入纤维素酶进行酶解处理8-12min后，再控制发酵培养基的温度为35-45℃、pH为5.5-6.5，向发酵培养基中加入蛋白酶进行酶解处理8-12min，最后控制发酵培养基的温度为25-35℃、pH为6.5-7.5，向发酵培养基中加入脂肪酶进行酶解处理8-12min。
9.根据权利要求1所述的核黄素的发酵方法，S6的发酵过程中发酵罐内培养液的还原糖浓度维持在0.8-1.0％。
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