CN114716391B

CN114716391B - 一种醋甲唑胺杂质及其制备方法和应用

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Publication number: CN114716391B
Application number: CN202210450074.XA
Authority: CN
Inventors: 沈杞容; 陶颉; 刘玲; 胡秀波; 马小明; 宣燕红; 刘锐; 贺亚平; 胡玉婷; 宋存珍; 李福高
Original assignee: Hangzhou Qianyuan Baoling Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hangzhou Qianyuan Baoling Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2023-12-12
Anticipated expiration: 2042-04-24
Also published as: CN114716391A

Abstract

本发明提供了醋甲唑胺未知杂质及其制备、分析方法和应用，属于有机合成药物化学领域。本发明首次公开了两种醋甲唑胺中新杂质化合物及其制备、分析方法，所述制备方法制备的杂质样品纯度高，操作简单高效，反应条件较适中，安全性强，易于控制，适用于杂质制备作为对照品，以监控产品质量。

Description

一种醋甲唑胺杂质及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及有机合成药物化学领域，更具体而言，涉及一种醋甲唑胺杂质及其制备方法和应用。

背景技术

醋甲唑胺，异名甲氮酰胺，国外商品名：Naptazane，英文名：Methazolamide，美国药典早已收载。该产品是一种碳酸酐酶抑制剂类的抗青光眼药物，临床上主要用于治疗慢性开角性青光眼，急性闭角性青光眼，继发性青光眼以及眼科手术降低眼压等。

例如，中国专利申请200510050599.0公开了一种醋甲唑胺的制备方法，以5-氨基-2-巯基-1，3，4-噻二唑为原料，经过缩合、乙酰化、甲基化、氧化、胺化反应得到醋甲唑胺粗品，再经过精制获得醋甲唑胺精制品，所述的氧化和胺化反应过程中，加入次氯酸钠原料，在催化剂氯化铁存在下进行反应，反应得到的中间体再进行胺化反应，制得醋甲唑胺粗品；所述的醋甲唑胺粗品经加入5％NaOH溶液并在调节pH＝4-5后得到析出物，经洗涤干燥制得成品；其中在氧化反应过程中，控制的反应温度在35-50℃。反应式如下：

在甲唑胺的合成、加工和储存过程中，不可避免地会产生杂质，并可能在使用过程中产生潜在的毒性。因此，有必要对甲唑胺产品中的杂质进行调查，并限制其在最终产品中的含量。在各大药典中，单一杂质的含量要求控制在0.10％以下，因此，部分杂质含量微小，难以分离和确认，因此无法得到标准品对杂质进行质控。需要进一步完善醋甲唑胺杂质谱，提高醋甲唑胺的质量控制水平。

发明内容

如前所述，对杂质进行结构鉴定是药品注册的基本要求，为了进一步提高醋甲唑胺的质量，控制药品醋甲唑胺中的杂质含量。

本发明的目的之一是提供一种如下式(I)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物，

所述式(I)化合物可作为醋甲唑胺成品检测分析中的标准品，有利于加强对药品的安全控制。

发明人发现，式(I)化合物为醋甲唑胺生产中目前尚未被发现的一种未知杂质，其是由磺酰氯中间体与杂质苄胺反应生成。

因此，本发明的另一个目的是提供式(I)杂质化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将磺酰氯中间体、苄胺、碱和溶剂混合，反应，得反应液；

(2)将步骤(1)所得反应液减压浓缩至干，过柱洗脱，得式(I)杂质化合物。

根据本发明的一个具体实施方案，步骤(1)中，所述反应的条件为：室温搅拌2-5小时后升温至40-70℃搅拌0.5-3小时。优选的，所述反应的条件为：室温搅拌3.5小时后升温至50℃搅拌1.5小时。

根据本发明的一个具体实施方案，步骤(1)中，所述碱包括但不限于碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺等，优选为碳酸钠。所述溶剂可以是本领域常规溶剂，如水、醇类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂等，优选为无羟基的溶剂，如四氢呋喃、二氯甲烷等。

根据本发明的一个具体实施方案，步骤(2)中，所用柱子为C18色谱柱。

根据本发明的一个具体实施方案，步骤(2)中，洗脱液为正己烷和乙酸乙酯混合液，优选为正己烷和乙酸乙酯体积比1:1的混合液。

所述磺酰氯中间体的结构式为：

所述苄胺的结构式为：

本发明的再一个目的是提供一种如下式(II)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物，

所述式(II)化合物可作为醋甲唑胺成品检测分析中的标准品，有利于加强对药品的安全控制。

发明人发现，式(II)化合物为醋甲唑胺生产中目前尚未被发现的一种未知杂质，其是由醋甲唑胺与磺酰氯中间体反应生成。

因此，本发明的再一个目的是提供式(II)杂质化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

将醋甲唑胺溶解在溶剂中，通过DAC50***分离得到杂质化合物(II)。

根据本发明的一个具体实施方案，所述溶剂选自甲醇、乙腈、水的至少一种，优选为甲醇，进一步优选为80％甲醇。

根据本发明的一个具体实施方案，所述分离的具体步骤为：进行第一次分离，收集含有杂质化合物(II)的部分，减压浓缩得粗品，然后进行第二次分离，收集得杂质化合物(II)。

进一步的，根据本发明的一个具体实施方案，所述第一次分离的条件为：

色谱柱：反相C18柱；

流速：45.0-55.0mL/min；

紫外波长：285-295nm；

流动相：硫酸钠和乙腈的混合流动相。

优选为：

色谱柱：反相C18柱；

流速：50.0mL/min；

紫外波长：290nm；

流动相：体积比为75：25的20mM硫酸钠和乙腈混合流动相。

进一步的，根据本发明的一个具体实施方案，所述第二次分离的条件为：

色谱柱：反相C18柱；

流速：45.0-55.0mL/min；

紫外波长：285-295nm；

流动相：甲酸-水和乙腈的混合流动相。

优选为：

色谱柱：反相C18柱；

流速：50.0mL/min；

紫外波长：290nm；

流动相：体积比为75：25的0.1％甲酸-水和乙腈的混合流动相。

另一种式(II)结构所示的杂质化合物的制备方法包括以下步骤：醋甲唑胺、三乙胺和溶剂混合，搅拌，加入磺酰氯中间体反应，加水和二氯甲烷进行萃取，有机层浓缩，得到的有机层使用硅胶柱层析，洗脱溶剂为体积比5-15:1的乙酸乙酯和乙醇，收集得杂质化合物(II)。

优选地，洗脱溶剂为体积比10:1的乙酸乙酯和乙醇。

本发明的再一个目的是提供式(I)杂质化合物和式(II)杂质化合物在醋甲唑胺质量控制中的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种醋甲唑胺杂质的检测方法，其特征在于，以式(I)杂质化合物和/或式(II)杂质化合物为标准品，按照以下步骤检测：

样品溶液制备：以流动相A与B比例为18:82的溶液为溶剂，溶解样品，浓度0.1-10mg/ml，优选5mg/ml

标准品溶液制备：溶剂同样品溶液，浓度0.1-10μg/ml，优选5μg/ml

色谱柱：苯基柱

流动相A:乙腈

流动相B:磷酸二氢钾(6.8g/L)

梯度洗脱：

时间	B(％)
		0	80-85
10	80-85
		30	38-42
35	38-42
		35.1	80-85
45	80-85

波长：290/250

流速：0.8-1.2mL/min

进样量：5μL。

本发明取得以下有益的效果：

1)本发明首次公开了醋甲唑胺未知杂质式(I)、(II)化合物的结构，对醋甲唑胺的质量研究具有重要意义；

2)本发明首次公开了醋甲唑胺未知杂质式(I)、(II)化合物的制备方法，所述制备方法制备的杂质样品纯度高，操作简单高效，反应条件较适中，安全性强，易于控制，适用于杂质制备作为对照品，以监控产品质量。

附图说明

图1杂质(I)质谱图；

图2杂质(I)氢谱图；

图3杂质(I)C¹³谱图；

图4杂质(I)红外谱图；

图5杂质(I)紫外谱图；

图6杂质(II)液相谱图；

图7杂质(II)质谱图(正离子)；

图8杂质(II)质谱图(负离子)；

图9杂质(II)红外谱图；

图10杂质(II)紫外谱图；

图11杂质(II)氢谱图；

图12杂质(II)C¹³谱图；

图13杂质(II)DEPT-135碳谱图；

图14杂质(II)二维氢谱(H-H COSY)图；

图15杂质(II)二维碳氢相关(HSQC)图；

图16杂质(II)二维碳氢相关(HMBC)图。

具体实施方式

以下典型反应用来举例说明本发明。在本领域内技术人员对发明所做的简单替换或改进等均属于本发明所保护的技术方案之内。本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。

实施例1式(I)杂质化合物的制备

(1)向反应瓶中加入磺酰氯中间体2.05g、苄胺0.87g、碳酸钠0.86g和四氢呋喃20mL，室温搅拌3.5小时后升温至50℃继续搅拌1.5小时。

(2)减压浓缩干反应液后过硅胶柱纯化，洗脱液为正己烷和乙酸乙酯(1:1)，浓缩干洗脱液后得白色固体杂质化合物(I)0.8g，纯度98％，收率70％。

实施例2杂质化合物(I)的结构表征

2.1波普数据：

UV-Visλ(CH₃OH)nm:258,295(λ_max)；IR(KBr)ν_max cm^-1:3070(s,br),2865(m),2801(m,sh),1590(s),1490(s),1455(s,sh),1400(s),1359(s),1323(s)；¹H NMR(500MHz；DMSO-d6；TMS)ppm:δ_H 2.96(3H,s,H-7),3.84(3H,s,H-8),4.24(2H,d,H-10),7.218-7.302(5H,m,H-12/12’/13/13’/14),9.30(1H,t,9-NH)；¹³C NMR(125MHz；DMSO-d6；TMS)ppm:δ_C 26.38(C-7),38.23(C-8),46.33(C-11),127.37(C-14),127.80and 128.19(C-12/12’/13/13’),155.33(C-5),164.28(C-2),179.74(C-6)；ms([M+H]⁺)m/z:327.0590(Calc.327.0580).

2.2质谱、氢谱、碳谱、红外表征和紫外表征图如图1-5所示。

实施例3式(II)杂质化合物的制备

将醋甲唑胺样品溶解在80％甲醇中，通过DAC50制备***分离得到杂质C。具体为：

(1)第一次分离：分离制备条件为反相C18柱(10um)，流速50.0mL/min，紫外波长290nm,流动相为20mM硫酸钠和乙腈的混合流动相，体积比为75：25，硫酸钠可以改善色谱分离的峰形。收集含有杂质C的部分(RT＝45分钟)，然后减压浓缩得杂质C粗品。

(2)第二次分离：再次通过相同的C18柱，流速50.0mL/min，紫外波长290nm，以体积比为75：25的0.1％甲酸-水和乙腈的混合流动相进一步纯化脱盐，收集杂质C组分(RT＝45分钟)，冻干得纯样品(172mg)。

实施例4式(II)杂质化合物的制备

15g的醋甲唑胺，加7.78g的三乙胺，50ml的DMF，-20度搅拌，之后加入20.32g的磺酰氯中间体反应5h，之后加500ml水，300ml二氯甲烷，萃取，有机层浓缩。得到的有机层使用硅胶柱层析，洗脱溶剂为乙酸乙酯：乙醇＝10:1，收集得杂质化合物(II)，纯度98％，收率60％。

实施例5杂质化合物(II)的结构表征

2.1波普数据：

UV-Visλ(CH₃OH)nm:202,255,292(λ_max)；IR(KBr)ν_max cm^-1:3455(m,br),2931(m),2853(m),1731(s),1495(s),1379(s),1308(s)；¹H NMR(500MHz；DMSO-d6；TMS)ppm:δ_H 2.25(6H,s,H-7/7’),3.86(6H,s,H-8/8’)；¹³C NMR(125MHz；DMSO-d6；TMS)ppm:δ_C26.38(C-7/7’),38.00(C-8/8’),158.88(C-5/5’),164.42(C-2/2’),179.52(C-6/6’)；ms([M+H]⁺)m/z:455.9884(Calc.455.9883)；ms([2M+H]⁺)m/z:910.9678(Calc.910.9693)；ms([M-H]^-)m/z:453.9790(Calc.453.9737)；([M-CH₃CO]^-)m/z:411.9683(Calc.411.9632).

2.2液相谱图、质谱、红外表征、紫外表征、氢谱、碳谱如图6-16所示。

实施例6

以实施例1、4制备的杂质为标准品，检测醋甲唑胺药品中的杂质含量。

检测步骤：醋甲唑胺分析方法

样品溶液制备：以流动相A与B比例为18:82的溶液为溶剂，溶解样品，浓度0.5mg/ml

标准品溶液制备：溶剂同样品溶液，浓度5μg/ml

色谱柱：安捷伦苯基柱

流动相A:乙腈

流动相B:磷酸二氢钾(6.8g/L)

梯度洗脱：

时间	B(％)
		0	82
10	82
		30	40
35	40
		35.1	82
45	82

波长：290/250

流速：1mL/min

进样量：5μL

检测结果：杂质I含量约0.03-0.05％，杂质II含量约0.06-0.12％。本发明提供的杂质制备方法简单，可以作为标准品实现对醋甲唑胺药品中相应杂质的有效检测，进一步加强了对醋甲唑胺药品的质量控制。

实施例6杂质毒性测试

对杂质I和杂质II进行口服途径的小鼠LD50测定，测得醋甲唑胺杂质I小鼠口服的LD50为624mg/kg；醋甲唑胺杂质II小鼠口服的LD50为383mg/kg，均显著低于醋甲唑胺。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种如下式(I)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物，

2.权利要求1所述的式(I)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将步骤(1)所得反应液减压浓缩至干，过柱洗脱，得式(I)杂质化合物；

其中，步骤(1)中所述磺酰氯中间体的结构式为：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的条件为：室温搅拌2-5小时后升温至40-70℃搅拌0.5-3小时；所述碱为碳酸钠；所述溶剂为无羟基的溶剂。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，洗脱液为正己烷和乙酸乙酯混合液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱液为正己烷和乙酸乙酯体积比1:1的混合液。

6.一种如下式(II)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物，

7.权利要求6所述的式(II)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

以5-氨基-2-巯基-1，3，4-噻二唑为原料，经过缩合、乙酰化、甲基化、氧化、胺化反应得到醋甲唑胺，将醋甲唑胺溶解在溶剂中，通过DAC50***分离得到杂质化合物(II)；所述分离的具体步骤为：进行第一次分离，收集含有杂质化合物(II)的部分，减压浓缩得粗品，然后进行第二次分离，收集得杂质化合物(II)；所述溶剂选自甲醇、乙腈、水中的至少一种；

其中，所述第一次分离为反向C18柱分离，所述第二次分离为反向C18柱分离。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述第一次分离的条件为：

流速：45.0-55.0mL/min；

紫外波长：285-295nm；

流动相：硫酸钠和乙腈的混合流动相，

所述第二次分离的条件为：

流速：45.0-55.0mL/min；

紫外波长：285-295nm；

流动相：甲酸-水和乙腈的混合流动相。

9.权利要求6所述的式(II)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：醋甲唑胺、三乙胺和溶剂混合，搅拌，加入磺酰氯中间体反应，加水和二氯甲烷进行萃取，有机层浓缩，得到的有机层使用硅胶柱层析，洗脱溶剂为体积比5-15:1的乙酸乙酯和乙醇，收集得杂质化合物(II)；

其中，所述磺酰氯中间体的结构式为：

10.权利要求1所述的式(I)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物、权利要求6所述的式(II)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物中的任意一项在醋甲唑胺质量控制中的应用。

11.一种醋甲唑胺杂质的检测方法，其特征在于，以权利要求1所述的式(I)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物、权利要求6所述的式(II)结构所示的醋甲唑胺杂质化合物中的任意一项为标准品，按照以下步骤检测：

样品溶液制备：以流动相A与B比例为18:82的溶液为溶剂，溶解样品，浓度0.1-10mg/ml，

标准品溶液制备：溶剂同样品溶液，浓度0.1-10μg/ml，

色谱柱：苯基柱

流动相A:乙腈

流动相B:磷酸二氢钾6.8g/L

梯度洗脱：

时间 B(％) 0 80-85 10 80-85 30 38-42 35 38-42 35.1 80-85 45 80-85

波长：290/250

流速：0.8-1.2mL/min

进样量：5μL。