CN114470326B - 一种仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了仿生矿化胶原‑糖胺聚糖材料制备方法及其应用。所公开的方法包括将胶原‑糖胺聚糖材料在矿化液中浸泡后得到仿生矿化胶原‑糖胺聚糖材料，所述矿化液是含有乙酰丙酮铈的溶液。本发明所制备的材料作为仿生骨膜具有促进局部神经血管生长、提高骨缺损修复效果的作用。

Description

一种仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料技术，具体涉及氧化铈仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料的制备方法及应用。
背景技术
仿生矿化材料是指有机支架材料内部以分级有序的方式沉积无机元素的材料。目前利用仿生矿化原理，已实现胶原纤维内的仿生钙化、仿生硅化，以及氧化锆的胶原纤维内仿生矿化。这类仿生矿化材料已在骨缺损修复填充材料领域展现出良好的运用前景。
发明内容
本发明提供了一种仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法。
为此，所提供的方法包括：将胶原-糖胺聚糖材料在矿化液中浸泡后得到仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料，所述矿化液是含有乙酰丙酮铈的溶液。
进一步，所述浸泡包括先在常温下浸泡，之后在55-65℃条件下浸泡。
可选的，所述矿化液的溶剂为甲醇和水、或者为乙醇和水。
进一步，所述胶原-糖胺聚糖材料在矿化液中浸泡前经过预处理，所述预处理包括依次在预处理Ⅰ液和预处理Ⅱ液中预处理浸泡，所述预处理Ⅰ液由胶原酶或巯基丙酸配置而成，所述预处理Ⅱ液由聚丙烯酸或聚磷酸铵配置而成。
进一步，所述聚丙烯酸的分子量小于等于450000。
进一步，所述预处理浸泡在常温下进行。
可选的，所述胶原-糖胺聚糖材料为膜材料。
可选的，所述胶原-糖胺聚糖材料选自畜禽蛋膜。
本发明制备的仿生矿化胶原-糖胺聚糖膜材料用于制备仿生骨膜。本发明制备的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料还用于制备骨缺损修复材料。
附图说明
图1为矿化后鸡蛋膜与小鼠颅骨骨膜扫描电镜图；(a)为氧化铈仿生矿化鸡蛋膜扫描电镜图；(b)为小鼠颅骨骨膜扫描电镜图。
图2为矿化后鸡蛋膜与未矿化鸡蛋膜红外光谱图，该图中Ce-ESM表示矿化处理后鸡蛋膜；ESM表示未处理鸡蛋膜；P-ESM表示经预处理液(I和II)处理后鸡蛋膜；AmideA表示标准化处理的参考酰胺A峰；AmideⅠ表示酰胺I峰；AmideⅡ表示酰胺II峰。
图3为矿化后鸡蛋膜与未矿化鸡蛋膜拉曼光谱图。
图4为矿化第2天和第7天鸡蛋膜纤维透射电镜图。
图5矿化后鸡蛋膜纤维横截面能谱分析。
图6为矿化后鸡蛋膜与未矿化鸡蛋膜X射线衍射分析图谱。
图7为矿化后鸡蛋膜与未矿化鸡蛋膜热重曲线。
图8为矿化后鸡蛋膜与未矿化鸡蛋膜X衍射光电子能谱图；(a)图为完整谱；(b)图为铈元素精细谱；Ce 3d的能谱可以用不同参数描述，它们分别与Ce3+(u0,v0,u'和v')和Ce4 +(u,v,u″,v″,u″′和v″′)有关，从其所占的峰强度比例获得Ce3+与Ce4+比例。
图9为原子力显微镜表征未矿化鸡蛋膜与矿化后鸡蛋膜表面形貌与弹性性能；(a)为未矿化鸡蛋膜原子力显微镜三维重建图；(b)为矿化后鸡蛋膜原子力显微镜三维重建图；(c)为未矿化鸡蛋膜与矿化后鸡蛋膜表面弹性性能柱状图。
图10为矿化后鸡蛋膜0-14天铈元素释放曲线。
图11为流式细胞分析术后第7日和第14日血液淋巴细胞CD4/CD8比值，Ctrl代表对照。
图12为术后第14日术区苏木精-伊红染色(HE染色)与血管数定量分析，ⅰ表示假手术对照组及局部放大图；ⅱ表示矿化鸡蛋膜植入组与局部放大图。
图13为术后第1天、第7天、第14天血液炎性因子含量酶联免疫吸附测定(Elisa)分析。
图14为CCK8分析不同铈刺激浓度、培养不同时间对细胞活性的影响。
图15为流式细胞术分析铈元素对细胞凋亡的影响。
图16为体外细胞培养验证矿化后鸡蛋膜物理屏障作用，图16中带绿色荧光显示细胞骨架，说明细胞存在。
图17为术后4周新生骨膜区域HE染色和van Gieson染色与新生骨膜厚度定量分析。
图18为术后4周新生骨膜区域Periostin免疫荧光染色与定量分析。
图19为MicroCT三维重建和定量分析评价术后4周和8周骨缺损修复情况。
图20为von Kossa染色和定量分析评价术后8周骨缺损修复情况。
图21为免疫荧光染色和定量分析评价术后2周和4周新生骨膜区域与新生骨区域神经血管长入情况。
具体实施方式
除非有特殊说明，本文中的术语或方法根据相关领域普通技术人员的认识理解或采用已有相关方法实现。
胶原-糖胺聚糖材料是指主要成分为胶原蛋白和糖胺聚糖的材料，如畜禽蛋膜(鸡蛋膜、鸭蛋膜、鹅蛋膜等)，其成分主要为胶原蛋白和糖胺聚糖(即胶原-糖胺聚糖材料)，具有良好的生物相容性和一定的生物活性，在创伤敷料等方面已有相关运用。
本发明采用仿生矿化的原理将氧化铈负载于胶原-糖胺聚糖材料内，选择初始膜材料，矿化后的材料可作为仿生骨膜材料，在兼具物理屏障功能的同时促进缺损区域神经血管长入，有利于提高骨缺损修复效果。
以下实施例选用鸡蛋膜为初始膜材料，鸡蛋膜是日常农业副产品，绿色环保、容易获取。以下实施例所用试剂、材料均为市售产品。
实施例1：
该实施例是将鸡蛋膜在矿化液中浸泡制备矿化胶原材料，具体方案如下：
(1)从市售鸡蛋膜壳内侧剥取鸡蛋膜，去离子水充分洗涤三次后使用；
(2)经步骤(1)处理后的鸡蛋膜依次在预处理I液(处理2小时)和预处理II液(处理8小时)中浸泡处理；其中预处理I液为I型胶原酶(#C0130；MilliporeSigma,Burlington,MA,USA)以100mU/μL浓度溶于Hank’s平衡盐溶液，预处理II液为6.67×10-4M高分子聚丙烯酸溶液(HPAA,CAS#9003-01-4；分子量:～450000；MilliporeSigma)；
(3)经步骤(2)处理的膜材料在矿化液中浸泡处理，所述矿化液由3mL的24mg/mL乙酰丙酮铈(CAS#206996-61-4；MilliporeSigma)甲醇溶液和0.03mL的去离子水配置而成，矿化液每天更换一次，持续7天；之后保持密封状态下，浸泡于矿化液的鸡蛋膜于60摄氏度处理48小时；
(4)洗涤、干燥、环氧乙烷消毒后，为可直接应用的氧化铈仿生矿化鸡蛋膜。
实施例2：实施例1所制备材料的表征
1.扫描电子显微镜观察矿化后鸡蛋膜和自然骨膜表面结构：
经医学伦理委员会批准，从C57BL/6J小鼠颅骨上获取骨膜，然后在2％戊二醛缓冲液中固定12小时；氧化铈仿生矿化鸡蛋膜和骨膜通过梯度乙醇(50-100％)脱水，并在六甲基二硅氮烷中孵育过夜；然后用金/钯溅射试样，并用扫描电子显微镜(S-4800,Hitachi,Tokyo,Japan)进行观察，结果如图1所示，发现矿化鸡蛋膜表面的纤维走行，纤维直径分布与骨膜相似。
2.傅立叶红外光谱分析矿化后鸡蛋膜成分：
将氧化铈仿生矿化鸡蛋膜，未处理鸡蛋膜以及预处理后鸡蛋膜用无水硫酸钙干燥24小时；使用傅立叶红外光谱(Shimadzu 8400S,Shimadzu Corp.,Kyoto,Japan)，以4厘米-1的分辨率(扫描次数：32次)从4000厘米-1到400厘米-1收集扫描；在酰胺A峰处(～3300cm-1)将光谱进行标化；使用IR solution软件(Shimadzu)进行光谱分析，结果如图2所示，预处理后，与未处理鸡蛋膜相比，红外光谱中酰胺I的峰值和1440cm-1处的峰值更高，对应羧基中的C＝O伸缩振动峰。当比较矿化后鸡蛋膜和预处理后鸡蛋膜时，酰胺I峰(1630cm-1)和原本1440cm-1左右的峰分别漂移到1520cm-1和1450cm-1，这可能是由于羧基与铈的螯合作用。同时，矿化处理后的鸡蛋膜在1390cm-1左右(由1382cm-1峰漂移产生)吸光度增加，在500～650cm-1范围内吸光度增加，对应于O-Ce-O伸缩振动。这些结果表明，鸡蛋膜的预处理可能会给鸡蛋膜带来更多的羧基，然后这些羧基可以与铈螯合，从而有利于氧化铈的充分渗透和矿化。
3.拉曼光谱分析矿化后鸡蛋膜成分：
氧化铈仿生矿化鸡蛋膜和未矿化鸡蛋膜用无水硫酸钙干燥24小时；运用拉曼光谱仪(LabRAM HR Evolution,Horiba Scientific,Horiba Ltd.,Kyoto,Japan)，使用785nm连续半导体激光器(Toptica Photonics,
Figure GDA0003725658410000061
Germany)作为激发源测得图3所示结果，矿化处理后462cm-1处峰明显，提示铈原子周围氧原子的对称振动。
4.透射电子显微镜观察：
在矿化第2天和第7天，将试样固定在2％戊二醛中，用上升梯度的乙醇系列脱水，浸入环氧丙烷作为过渡介质，并用环氧树脂包埋成块；在聚醋酸甲基乙烯脂和碳涂层镍网格上制备超薄透射电镜切片(90纳米厚度)，并用透射电子显微镜进行检查，结果如图4所示，发现鸡蛋膜纤维内均匀高密度显影，提示矿化存在于胶原蛋白核心和糖胺聚糖外壳部位，实现了充分的矿化渗透度和均匀的矿化分布。
5.能谱分析进一步明确元素成分与分布：
上述超薄透射电镜切片(90纳米厚度)通过扫描透射电子显微镜进行元素能谱分析(Talos-F200X，Thermo Fisher Scientific)，结果如图5所示，进一步证实氧化铈在胶原纤维内的充分渗透与分布状况。
6.X线衍射分析：
对氧化铈仿生矿化鸡蛋膜和未矿化鸡蛋膜进行干燥后，将其研磨成粉，使用X射线衍射仪(Rigaku America,Woodlands,TX,USA)进行检查；检测参数为：镍过滤铜靶辐射：30kv，20ma，2θ角：5-90°，扫描速度4°/min，扫描步长0.02°；结果如图6所示，未观察到明显尖锐的晶体峰，说明氧化铈在鸡蛋膜内未实现充分结晶，是独特的无定形状态。
7.热重分析：
使用Thermo Hake TG/DTA 320仪器(Seiko Instruments USA Inc.,Torrence,CA,USA)对氧化铈仿生矿化鸡蛋膜和未矿化鸡蛋膜进行热重分析：
将约10mg膜材料置于铂盘中，并在空气中以5℃/min的速率加热至1000℃；数据表示为重量损失与温度的关系，如图7所示，矿化处理后鸡蛋膜燃烧后剩余重量为27.31％，高于未矿化鸡蛋膜的8.49％剩余重量，提示鸡蛋膜矿化的程度保守。
8.X射线光电子能谱分析：
先使用无水硫酸钙将氧化铈仿生矿化鸡蛋膜和鸡蛋膜干燥24小时，氧化铈仿生矿化鸡蛋膜和鸡蛋膜使用X射线光电子能谱(K-Alpha,Thermo Fisher Scientific)(n＝3)检测；在C1s吸附碳的C-C/C-H能量位置284.8ev处校准了光谱峰；根据XPS数据手册和NIST X射线光电子能谱数据库分析了ce3d的化学状态(https://srdata.nist.gov/xps/)；结果如图8所示，观察到铈特征峰，进一步精细谱分峰拟合分析得到，铈由三价的铈和四价的铈组成，这与氧化铈结构中氧空位导致的独特的自还原功能有关。
9.原子力显微镜分析：
氧化铈仿生矿化鸡蛋膜和未矿化鸡蛋膜的表面形貌成像由原子力显微镜(Keysight 5500,Keysight Technologies,Santa Rosa,CA,USA)在轻敲模式下，使用NT-MDT的NSG01探针(典型力常数为5.1N m-1)和150kHz的经典共振频率；使用基于原子力显微镜的纳米压痕对机械性能进行实时监测，在氧化铈仿生矿化鸡蛋膜和鸡蛋膜表面进行原子力显微镜纳米压痕，具有13kHz共振频率和0.2N/m标称弹簧常数(PPP-NCL-11；Nanosensors)的硅原子力显微镜探针用于轻敲模式下的纳米压痕；在300nm的压痕深度处量化每个位置的弹性模量，测得每个试样5个分离位置的弹性模量并进行平均。结果如图9所示，鸡蛋膜矿化前后表面形貌，观测到矿化后纤维的直径有所增加；力学分析模式下测得矿化后鸡蛋膜弹性性能有明显提升。
10.铈释放曲线：
将氧化铈仿生矿化鸡蛋膜(100mg)浸入10mL细胞培养液(10mg/mL)中并置于37℃(n＝3)下；通过每天使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测量浸出液中的铈浓度，获得14天内氧化铈仿生矿化鸡蛋膜中铈的累积释放曲线(Agilent 7700；Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)。如图10所示。
实施例3：实施例1所制备材料的生物相容性评价
该实施例对实施例1制备的氧化铈仿生矿化鸡蛋膜进行了系列生物安全性能评价，发现其生物安全性能良好。采用皮下植入实验初步探究材料对小鼠免疫***刺激性发现：相比于未处理组，植入组小鼠血液中炎性因子含量未见明显变化；组织形态未见明显炎性表现；血液中淋巴细胞炎性反应轻微。体外细胞实验也证实一定浓度范围内材料生物安全性能良好。
1.小鼠皮下植入：
(1)将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为两组(每组小鼠数量n＝24)进行皮下植入；消毒和麻醉后，在小鼠背部进行切口；皮肤下惰性分离形成空洞，植入10mm×10mm的氧化铈仿生矿化鸡蛋膜，伤口被仔细地缝合，所有手术均在无菌条件下进行；假手术组作为对照组。
(2)术后第7天和第14天，使用流式细胞术(FACSCalibur；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)检测血清淋巴细胞的CD3、CD4和CD8表达(n＝5)；具体是将使用淋巴细胞分离液(购自北京索莱宝科技有限公司)离心分离的淋巴细胞稀释至1×106个细胞/mL的密度，然后在4℃下与荧光标记CD3-cy5抗体、CD4-PE抗体和CD8-FITC抗体(BioLegendInc.,San Diego,CA,USA)孵育30分钟；用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞两次去除多余的抗体并重新悬浮在300μL PBS中进行检测；非特异性同型匹配对照用于测定背景荧光；使用CellQuest Pro软件(BD Biosciences)测定CD4+/CD8+比率，结果如图11所示，发现在第7日CD4/CD8比值有上升，提示早期轻微炎性反应，在第14日CD4/CD8比值恢复与对照组(假手术组)无统计学差异，提示炎性反应消退。
(3)术后第14天，将小鼠麻醉致死后，采集手术区组织(n＝5)进行组织学分析：将标本固定在10％中性缓冲***中后，将其包埋在石蜡中并切成5μm厚的切片，然后用苏木精和曙红(H&E)(中国湖北武汉Servicebio)染色，并通过BX53显微镜(日本OlympusCorp.)进行检查；在三个随机选择的非重叠视野中测量毛细血管的数量，然后使用ImageJ软件对每个样本(n＝5)进行平均(http://imagej.net/ImageJ)。结果如图12所示，说明氧化铈仿生矿化鸡蛋膜皮下植入未引起明显的局部炎症反应，且能够促进局部血管形成。
(4)术后第1天、第7天和第14天，从小鼠眼眶静脉丛(n＝3)采血；应用小鼠白细胞介素-2(IL-2)定量因子ELISA试剂盒、小鼠白细胞介素-4(IL-4)定量因子ELISA试剂盒和小鼠γ干扰素(IFN-γ)定量因子ELISA试剂盒(美国R&D systems公司)测定小鼠外周血中血浆炎症因子的浓度。结果如图13所示，发现植入矿化鸡蛋膜组血液中炎性相关因子含量未见明显变化，提示植入矿化鸡蛋膜未造成明显机体炎症反应。
2.体外细胞实验：
(1)将铈元素释放趋于稳定的浸泡7天后的材料浸提液(10mg/mL)用DMEM细胞培养液分别稀释10倍(1000μg/mL)、100倍(100μg/mL)、1000倍(10μg/mL)，以获得不同铈浓度的培养基；然后，使用200μL DMEM细胞培养液、10μg/mL浸提液、100μg/mL浸提液或1000μg/mL浸提液在37℃(n＝3)下将3×103人口腔黏膜成纤维细胞(ATCC细胞库)接种在96孔板中4、12、24和48小时(5％CO2和100％湿度)；向孔中添加20uL CCK-8试剂，并在37℃下培养1小时；通过微孔板读取器(BioTek，Winooski，VT，USA)记录450nm处的吸光度值。结果如图14所示，发现在一定浓度范围内(100μg/mL浸提液浓度范围内)细胞活性没有统计学差异。
(2)培养人口腔黏膜成纤维细胞，每组约1×105个人口腔黏膜成纤维细胞(Ce-ESM组：人口腔黏膜成纤维细胞在100μg/mL浸出液中培养12和48小时；Ctrl组：人口腔黏膜成纤维细胞在普通细胞完全培养基中培养12和48小时；n＝3)在4℃下与FITC标记的膜联蛋白V和碘化丙啶(美国Cell Signaling Technology)一起培养20分钟；洗涤三次后，用流式细胞仪(BD Biosciences)检测细胞，结果如图15所示，发现在细胞凋亡比例没有统计学差异。
实施例4：将实施例1所制备材料作为仿生骨膜物理屏障功能研究
该实施例将氧化铈仿生矿化鸡蛋膜试样放置在24孔板的每个孔底部，内表面朝上，在膜的内表面(n＝5)种植约5×103个人口腔黏膜成纤维细胞；3天后，用FITCphalloidin(Abcam；ab235137)对细胞F-肌动蛋白进行染色；用共聚焦激光扫描显微镜观察膜的内表面和外表面；使用ImageJ软件，在每个切片的三个随机选择的非重叠视野中测量内表面和外表面上的细胞数量。结果如图16所示，观察发现细胞不能穿过膜从一面到另一面，说明膜具有良好的物理屏障作用。
实施例5：将实施例1所制备材料作为仿生骨膜治疗骨缺损促进血管神经长入，提高骨缺损修复效果：
该实施例将氧化铈复合鸡蛋膜运用于骨缺损修复取得了良好的骨修复效果，且伴随充足的神经血管化。Micro-CT检测成骨情况，组织形态分析，免疫荧光染色实验均证实铈化鸡蛋膜配合骨粉胶原植入组能够实现明显更多的神经长入和血管长入，实现良好的骨再生。
(1)经伦理审批后，8周雄性C57BL/6J小鼠随机分为四组(n＝20)；消毒和麻醉后，使用手术刀进行6mm的切口，并使用无菌环钻钻在头盖骨中心区制造直径为3.5mm的全层缺损(精密工具有限公司，中国上海)；将
Figure GDA0003725658410000111
胶原蛋白(瑞士盖氏)植入缺损区，缺损表面覆盖不同的膜：(1)Ce-ESM组，表面覆盖氧化铈仿生矿化鸡蛋膜；(2)ESM组，表面覆盖鸡蛋膜(I型胶原酶预处理)；(3)对照组表面无覆膜；(4)表面覆盖
Figure GDA0003725658410000121
(瑞士盖氏)的BG组；最后，用4-0可吸收缝线缝合头皮，术后连续注射青霉素2天。
(2)小鼠颅骨缺损模型4周后，进行组织学分析以评估骨膜再生：术后4周(n＝5)采集颅骨标本，并进行固定和脱钙(在4％多聚甲醛中固定24小时，并在超声波快速脱钙器(中国香港Pro-Cure医疗科技有限公司)中用25％(w/v)EDTA-2Na脱钙7天)；然后将标本脱水，包埋在石蜡中，并切成7μm的切片；进行H&E染色和van Gieson染色(Servicebio)，并在BX53显微镜下观察所有载玻片；使用ImageJ软件分析染色切片的数字化图像；新形成的骨膜区域(当骨膜区域可以区分时)用虚线分成四个等宽的部分，测量并平均虚线长度，以表示一个视野的骨膜厚度；在每个切片的三个随机选择的非重叠视野中测量骨膜厚度，并对每个样本取平均值，然后将其标准化为对照组的骨膜厚度。结果如图17所示，发现矿化鸡蛋膜组有序性类骨膜组织的长入，且类似于自然骨膜的双层结构，在上层较为致密，在下层为疏松的富含血管的结构。
(3)术后4周，收集颅骨标本(n＝5)，在4％多聚甲醛中固定24小时，并在超声波快速脱钙器(中国香港Pro-Cure医疗科技有限公司)中用25％(w/v)EDTA-2Na脱钙7天；然后将试样嵌入冰冻切片包埋剂(OCT)(中国北京，Solarbio)中，并使用冷冻切片机(CM1950，德国魏茨拉尔莱卡)切成厚度为7μm的切片；在0.3％Triton X-100处理和10％血清阻断后，切片在4℃下在抗骨膜素抗体(1:500；ab215199；Abcam)中孵育；然后将相应的二级抗体(1:400；ab150080，ab150113，ab150077；Abcam)加入切片进行特异性结合，并在室温下用DAPI(ab228549；Abcam)对细胞核染色15分钟；最后，使用共焦激光扫描显微镜(日本东京弥敦区尼康公司尼康A1R)拍摄染色切片；通过ImageJ在每个切片的三个随机选择的非重叠视野中测量骨膜素平均荧光强度，并对每个样本进行平均，然后将其标准化为对照组，结果如图18所示，观察发现矿化鸡蛋膜组有高表达量的骨膜素。
(4)在手术后4周和8周，使用Inveon micro CT***(德国慕尼黑西门子公司)(n＝5)对每组5只小鼠进行检查；每只小鼠用1％戊巴比妥(5mL/kg体重)麻醉，并在80keV、500mA和19微米精确度下扫描，生成各向同性分辨率二维影像并用于三维重建；进一步对缺陷周围3×3×0.5mm的区域(ROI)计算分析缺损部位的骨小梁厚度(Tb.Th.)、新骨体积分数(骨体积/总体积，BV/TV)和骨密度(BMD)，结果如图19所示，发现矿化鸡蛋膜组骨缺损在4周和8周有明显优于其他组别的早期修复再生效果。
(5)小鼠颅骨缺损模型8周后取材VK染色分析：在手术后8周(n＝5)采集颅骨标本，然后进行化学脱水并用纯化的甲基丙烯酸甲酯渗透。埋入标本以约50μm的厚度切片(LeicaSP1600,Mannheim,Germany)，并用von Kossa染色(Servicebio)染色，ROI中的黑色颗粒区域被视为阳性；使用ImageJ软件计算阳性面积与总视野面积的比率；小鼠颅骨缺损模型8周后取材VK染色分析，结果如图20所示，发现矿化鸡蛋膜组实现了明显更好的骨缺损修复效果，定量分析进一步验证。
(6)小鼠颅骨缺损模型2周、4周后取材免疫荧光染色分析神经血管化水平并进行定量分析，结果如图21所示，发现矿化鸡蛋膜组促进神经血管长入新生类骨膜区和新生骨区域。

Claims (10)

1.一种仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法，其特征在于，方法包括：将胶原-糖胺聚糖材料在矿化液中浸泡后得到仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料，所述矿化液是含有乙酰丙酮铈的溶液。
2.如权利要求1所述的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法，其特征在于，所述浸泡包括先在常温下浸泡，之后在55-65℃条件下浸泡。
3.如权利要求1所述的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法，其特征在于，所述矿化液的溶剂为甲醇和水、或者为乙醇和水。
4.如权利要求1所述的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法，其特征在于，所述胶原-糖胺聚糖材料在矿化液中浸泡前经过预处理，所述预处理包括依次在预处理Ⅰ液和预处理Ⅱ液中预处理浸泡，所述预处理Ⅰ液由胶原酶或巯基丙酸配置而成，所述预处理Ⅱ液由聚丙烯酸或聚磷酸铵配置而成。
5.如权利要求4所述的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法，其特征在于，所述聚丙烯酸的分子量小于等于450000。
6.如权利要求4所述的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法，其特征在于，所述预处理浸泡在常温下进行。
7.如权利要求1所述的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法，其特征在于，所述胶原-糖胺聚糖材料为膜材料。
8.如权利要求1所述的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法，其特征在于，所述胶原-糖胺聚糖材料选自畜禽蛋膜。
9.权利要求8所述方法制备的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料用于制备仿生骨膜的应用。
10.权利要求1所述方法制备的仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料用于制备骨缺损修复材料的应用。
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