CN102266585A - 一种用于女性盆底的生物复合补片及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于女性盆底的生物复合补片及其制造方法,该补片在聚丙烯网片的表面包裹有动物供体的膀胱脱细胞基质。对取自于动物供体的膀胱,需要进行脱细胞处理以及冻干处理;消毒后,低温塑封保存;然后将上述获得的膀胱脱细胞基质包裹于所述聚丙烯网片的表面。本发明将生物材料和无机材料进行有效的结合,综合二者的各自优势,获得了明显优良的使用效果。其中,外层的膀胱基质能够起到隔离聚丙烯网片和宿主组织的作用,能显著提高生物相容性。补片被植入后,可诱导患者纤维组织长入,最后形成患者自身纤维组织的修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域,特别是涉及一种用于修复女性盆腔组织缺陷的补片。
背景技术
女性盆底功能障碍性疾病是50岁以上中老年妇女的常见病、多发病,给中老年妇女的生活和健康造成严重的影响。目前的治疗方法是用一些医用聚丙烯类合成材料的网带或片,通过外科手术进行盆底功能重建。相对生物材料,无机材料易引发严重的炎症反应。临床效果显示,聚丙烯网片具有组织侵蚀性的缺点,其生物相容性差,易产生异物刺激的不适和组织侵蚀性、***痛等,而且,单纯聚丙烯网片较难和植入局部发生融合,再加上在体内老化***变脆、摩擦、位移、蚀穿等作用,常发生刺穿膀胱、***等不良并发症。为克服这些弊端曾有学者试用脱细胞尸体筋膜、自体筋膜、人造胶原材料来进行盆底功能重建。但这些材料均有各自特有缺陷难以克服,均处于试验阶段。而替代材料中,异种脱细胞基质材料最具有理想特性,其来源广泛,强度良好,并含有生物活性因子,组织相容性优秀,是未来盆底理想的修复材料,唯一缺陷是自然降解性导致其远期疗效不稳定,现阶段技术条件下,尚无法取代聚丙烯材料的地位。但可以将其用作聚丙烯的辅助材料,目的是提高生物相容性,从而降低聚丙烯并发症。
发明内容
为了克服已有技术中上述缺陷,本发明提供了一种用于修复女性盆腔组织缺陷的补片,将异种脱细胞基质材料作为聚丙烯网片的辅助材料,以提高生物相容性、降低聚丙烯并发症,从而解决植入部位的炎症反应明显的问题。
同时,本发明还提供上述补片的制备方法。
本发明的技术方案是:
一种用于女性盆底的生物复合补片,在聚丙烯网片的表面包裹有动物供体的膀胱脱细胞基质。其中,所述膀胱脱细胞基质优选接种有BMSCs。
可选择地,所述聚丙烯网片为长方形、正方形、圆形或异形体。
进一步地,所述聚丙烯纤维的排列方向与膀胱脱细胞基质的纤维方向呈25-75度,优选40-50度。
进一步地,所述聚丙烯网片内置于两片所述膀胱脱细胞基质之间,可吸收缝合线连接两片所述膀胱脱细胞基质,将聚丙烯网片包裹于内。
本发明还提供了一种用于女性盆底的生物复合补片的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备膀胱脱细胞基质
取动物供体的膀胱,去除粘膜层和浆膜层,获得膀胱基质;
对膀胱基质进行脱细胞处理以及冻干处理;消毒后,低温塑封保存;
(2)取聚丙烯网片,将上述获得的膀胱脱细胞基质包裹于所述聚丙烯网片的表面。
进一步地,所述步骤(2)具体为:将聚丙烯网片内置于两片所述膀胱脱细胞基质之间,用可吸收缝合线将两片所述膀胱脱细胞基质缝合,使得聚丙烯网片包裹于内。
进一步地,所述的膀胱基质的脱细胞过程为:采用脱细胞液和缓冲液对膀胱基质进行反复浸泡和冲洗。
优选地,所述脱细胞液为三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟的混合液。
本发明的多功能生物补片的结构特点采用动物脱细胞膀胱材料(urinarybladder matrix,简称UBM),经过特定工序,除掉动物膀胱的细胞成分,保留动物膀胱的脱细胞基质,并含有细胞生长的各种生物成分,如血管生长因子,TGF-β,VFGF等,然后将聚丙烯网片包裹,构成“三明治”结构。本发明将生物材料和无机材料进行有效的结合,综合二者的各自优势,获得了明显优良的使用效果。其中,外层的膀胱基质能够起到隔离聚丙烯网片和宿主组织的作用,能显著提高生物相容性。同时,还能调节免疫反应向免疫适应性转变,有效降低其免疫排异原性,柔软性与人的组织相近,无异物刺激、蚀穿等弊端,植入后可诱导患者纤维组织长入,最后形成患者自身纤维组织的修复,可用于***前后壁膨出、子宫脱垂,张力性尿失禁等女性盆底功能障碍的手术治疗。同时,本发明的生物复合补片经上述工艺处理可大大提高补片的稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例的立体分解图;
图2为本发明实施例的结构示意图;
图3为本发明不同实验组植入***粘膜下植入局部组织内CD4细胞免疫组化检测结果;
图4为本发明不同实验组植入***粘膜下植入局部组织内CD8细胞免疫组化检测结果;
图5为本发明不同实验组植入***粘膜下植入局部组织内CCR4细胞免疫组化检测结果;
图6为本发明不同实验组植入***粘膜下植入局部组织内CXCR3细胞免疫组化检测结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案进行详细说明。
对于所属技术领域的技术人员而言,从对本发明的详细说明中,本发明的上述目的、特征和优点将显而易见。
本发明提供一种用于女性盆底的生物复合补片,补片包括聚丙烯网片1和膀胱脱脱细胞基质2。其中,聚丙烯网片为市售产品,本发明不限制聚丙烯网片1的结构和形状,也就是说,聚丙烯网片1可以采用长方形、正方形、圆形或其它异形体。在选取临床应用的聚丙烯网片时,可以增加该网片的孔隙率,即将常规的2mm增加到4-5mm,以减少聚丙烯材料的密度,这种做法能进一步降低免疫反应强度。本发明使用的膀胱脱脱细胞基质2来自于动物供体,并经过脱细胞、杀菌处理,该动物供体包括但不限于猪、牛、羊,优选猪源性。SIS、AP、UBM、ADM、CEM是五种最常用的猪脱细胞基质材料,均可以作为本发明的选择,其中优选UBM,从相关特性检测,包括吸水性、降解周期、抗菌性、细胞相容性、生物力学性能5个方面看,结果发现UBM具有最长的降解周期,最强的抗菌性、最高的吸水性、最好的生物力学性能、以及优秀的组织相容性,非常适合于盆底的特殊环境。
如图1、2所示,本实施例中,膀胱脱脱细胞基质2选自于猪的UBM(为表达清晰,以下出现的UBM 2均是膀胱脱细胞基质2),UBM 2作为复合补片的生物隔离成分,将UBM 2和聚丙烯网片1两种材料复合:将上述聚丙烯网片1内置于两片所述UBM 2之间,用可吸收缝合线(图中未示)采用缝合方式连接两片所述UBM 2,最终将聚丙烯网片1包裹在里面,如图2所示。缝合线可以是现有技术中所采用的任何一种医用级可吸收缝合线,比如聚乙交酯-丙交酯材料制成的缝合线。如图1所示,所述聚丙烯网片1采用长方形,其中的聚丙烯网片1的纤维11的排列方向与UBM 2的大体纤维21方向(图中以虚线表示纤维方向)呈40-50度,最好是45度。采用该结构的补片,聚丙烯纤维11起到“钢筋”的支架作用,而UBM 2居于外面,不仅加强了UBM 2的强度,而且不影响UBM 2的组织相容性,并且聚丙烯网片1的纤维走向基本不会影响补片的顺应性,能达到单纯的UBM的顺应性水平。
上述的UBM 2取自于动物供体的膀胱,去除粘膜层和浆膜层后获得膀胱基质;然后对膀胱基质进行脱细胞处理以及冻干处理;消毒后,采用低温塑封保存。其中,脱细胞处理时,需要用脱细胞液和缓冲液对膀胱基质进行反复浸泡和冲洗。本领域技术人员可以理解的是,该脱细胞液和缓冲液可以为任何一种适合的产品,优选的是脱细胞液采用三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟的混合液,混合重量比控制在80-120∶1。
作为优选的实施例,本发明还可以将干细胞接种到生物材料上构建组织工程材料,即上述的UBM还可以按现有技术接种BMSCs(bone marrowmesenchymal stem cells骨髓间充质干细胞),体外培养一周。下面将要详述的生物学评价,也会将其列为一个对照对象。
下面给出UBM的一个具体制作方法,但不作为本发明的限制,作为本领域技术人员,还可采用现有技术中可行的其它方法。
1、猪膀胱脱细胞基质的制备
取封闭饲养猪(体重约200kg)死后半小时内的新鲜猪膀胱标本,在超净台下用机械方法除去粘膜层和浆膜层。
2、脱细胞处理
第一次处理:取一干净1000ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0.0122g,加入约800ml去离子水,充分搅匀溶解,调PH值至8.0。将溶液到入一干净5000ml烧杯中,并将膀胱基质放入烧杯浸泡。将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时,过夜。
第二次处理:取一干净1000ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0.0122g,加入约800ml去离子水,充分搅匀溶解,调PH值至8.0,然后到入一干净5000ml烧杯中,并将膀胱基质放入烧杯浸泡。将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时。
第三次处理:取一干净1000ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0.0122g,加入约800ml去离子水,充分搅匀溶解,调PH值至8.0,然后到入一干净5000ml烧杯中,并将膀胱基质放入烧杯浸泡。将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时,过夜。
第四次处理:取一干净1000ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0.0122g,加入约800ml去离子水,充分搅匀溶解,调PH值至8.0,然后到入一干净5000ml烧杯中,并将膀胱基质放入烧杯浸泡。将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时。
第五次处理:取一干净500ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0.0122g,吸取20mlTriton X-100,放入烧杯,加入适量水,充分搅拌溶解,定容至2000ml,并将溶液转入5000ml烧杯。用适量磷酸盐缓冲液洗涤膀胱基质后放入之前配置的溶液,将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时,过夜。
第六次处理:取一干净500ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0.0122g,吸取20mlTriton X-100,放入烧杯,加入适量水,充分搅拌溶解,定容至2000ml,并将溶液转入5000ml烧杯,将膀胱基质放入烧杯浸泡,将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时。
第七次处理:取一干净500ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0.0122g,吸取20mlTriton X-100,放入烧杯,加入适量水,充分搅拌溶解,定容至2000ml,并将溶液转入5000ml烧杯,将膀胱基质放入烧杯浸泡,将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌,过夜。
第八次处理:取一干净500ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0.0122g,吸取20mlTriton X-100,放入烧杯,加入适量水,充分搅拌溶解,定容至2000ml,并将溶液转入5000ml烧杯,将膀胱基质放入烧杯浸泡,将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时。
第九次处理:配置2000ml的DNA酶及RNA酶的双酶消化溶液:1mol/L的NaCl(含DNase及RNA酶各40U/ml),用适量的磷酸盐缓冲液漂洗膀胱基质后,将膀胱基质放入双酶消化液浸泡12小时,过夜。
第十次处理:配置2000ml的DNA酶及RNA酶的双酶消化溶液,并将膀胱基质放入双酶消化液浸泡12小时。
第十一次处理:取一干净500ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和20g十二烷基硫酸钠,放入烧杯,加入适量水,充分搅拌溶解,定容至2000ml。用适量磷酸盐缓冲液漂洗膀胱基质后放入之前配置的溶液,将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时,过夜。
第十二次处理:取一干净500ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和20g十二烷基硫酸钠,放入烧杯,加入适量水,充分搅拌溶解,定容至2000ml后到入5000ml的烧杯中,将膀胱基质放入烧杯浸泡,将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时。
第十三次处理:取一干净500ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和20g十二烷基硫酸钠,放入烧杯,加入适量水,充分搅拌溶解,定容至2000ml后到入5000ml的烧杯中,将膀胱基质放入烧杯浸泡,将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时,过夜。
第十四次处理:取一干净500ml的烧杯,称取12.11g三羟甲基氨基甲烷和20g十二烷基硫酸钠,放入烧杯,加入适量水,充分搅拌溶解,定容至2000ml后到入5000ml的烧杯中,将膀胱基质放入烧杯浸泡,将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌12小时。
第十五次处理:配置2000ml的磷酸盐缓冲液,并将膀胱基质放入漂洗12小时,过夜。
第十六次处理:配置2000ml的磷酸盐缓冲液,并将膀胱基质放入漂洗12小时。
第十七次处理:配置2000ml的磷酸盐缓冲液,并将膀胱基质放入漂洗12小时,过夜。
第十八次处理:配置2000ml的磷酸盐缓冲液,并将膀胱基质放入漂洗12小时。
3、冻干处理:
上述处理后的膀胱已经成为脱细胞UBM,取出后程序性降温到-80摄氏度16小时。
4、消毒处理:
CO60γ射线照射除菌,4℃保存备用。
下面以动物为实验对象进入植入试验,对本发明获得的复合补片材料作体内生物学反应评价。主要包括单纯UBM、接种BMSCs的UBM、复合聚丙烯的UBM以及单纯聚丙烯网片等四种不同材料作为盆底修复生物补片植入体内的生物反应性。
一、实验动物
SD大鼠:SPF级,200±10g,第三军医大学实验动物中心提供。
二、主要试剂及材料
三、主要试剂配制
1.0.25%胰蛋白酶溶液
胰蛋白酶0.25g用D-Hank`s液100ml溶解混匀,经0.22μm微孔滤膜过滤除菌,分装成4ml/瓶,-20℃保存备用。
2.PBS溶液
成品PBS粉末,加ddH2O 100ml、搅拌使之完全溶解,转入2000ml容量瓶中,加ddH2O至刻度线,混匀,测量pH值为7.5。分装至500ml、100ml玻璃瓶中,高压蒸汽消毒灭菌后,4℃冰箱保存备用。
3.青霉素、链霉素双抗培养基
青霉素溶液的配制:青霉素80万单位加生理盐水至80ml,依照公式计算其浓度为10000U/ml,0.22um微孔滤器过滤后分装,-20℃储存备用。使用时按1%的比例加入培养基中。链霉素溶液的配制:取链霉素1.0g,加无菌生理盐水至100ml,则浓度为:10000μg/ml,0.22μm微孔滤器过滤后分装,-20℃储存备用。使用时按1%的比例加入培养基中。
4.DMEM-F12全培养基
DMEM-F12+10%胎牛血清+1%青/链霉素
四、试验方法
(一)植入补片
1.实验分为5组,每组12只大鼠,分别植入UBM,接种BMSCs的UBM,复合聚丙烯网片的UBM(上述实施例获得),单纯聚丙烯网片,假手术组。
2.用手术剪剪开***粘膜,将UBM,接种BMSCs的UBM,复合聚丙烯网片的UBM,单纯聚丙烯网片植入***粘膜下方,假手术组不植入任何材料,其余操作程序相同;
3.缝合创口,在创口上涂抹金霉素,防止感染。
4.在手术后1,2,3,4周处死大鼠,每次3只,观察植入具备的大体变化,取植入组织及周围组织,10%中性甲醛固定,进行组织学检测和免疫组化检测。
(二)植入组织的组织学检测和免疫组化检测
1.固定的组织进行石蜡切片和HE染色,同时制备白片进行免疫组化检测;
2.免疫组化检测
1)取白片于60℃恒温箱中烘烤20分钟;
2)将组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟;
3)无水乙醇中浸泡五分钟;
4)95%乙醇中浸泡五分钟;
5)75%乙醇中浸泡五分钟;
6)蒸馏水冲洗,置PBS浸泡5分钟;
7)用水浴锅将0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)加热至95℃左右,放入组织切片加热10-15分钟,进行抗原修复;
8)滴加3%H2O2,室温孵育15min以阻断内源性过氧化物酶;
9)PBS冲洗,每次2分钟,共3次;
10)加10%山羊血清封闭,室温孵育10分钟;
11)倾去血清,滴加一抗,37℃孵育2h后,4℃湿盒过夜。
12)取孵育过夜的切片,PBS冲洗,每次2分钟,共3次;
13)滴加生物素标记山羊抗兔IgG(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育20分钟;
14)PBS冲洗,每次2分钟,共3次;
15)滴加辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育20分钟;
16)PBS冲洗,每次2分钟,共3次;
17)用二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木精复染,镜下观察显色结果;
18)自来水充分冲洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。
五、试验结果
(一)大体观察
植入试验1周后,可见单纯植入的UBM颜色轻微淡黄,接种BMSCs的UBM颜色较单纯的UBM颜色稍浅,而单纯聚丙烯网片组有轻微感染现象,复合聚丙烯网片的UBM颜色较深,肉眼观察效果较UBM和接种BMSCs的UBM要差,但明显优于单纯聚丙烯网片,假手术组没有明显异常,未见感染。植入后第2周,植入的UBM与1周前无显著变化,接种BMSCs的UBM与大鼠自身组织有融合现象,植入组织变轻微淡黄,单纯聚丙烯网片组未与大鼠组织融合,界限清楚,复合聚丙烯网片的UBM变为轻微淡黄,聚丙烯网片与组织镶嵌长在一起。植入后第3周,单纯植入的UBM已无法在体内明显分辩,植入部分有轻微淡黄变化,植入的UBM大部分可能发生了降解,接种BMSCs的UBM也已无法辨别,单纯聚丙烯网片的植入部分有结痂出现,复合聚丙烯的UBM补片未找到植入的UBM,可见聚丙烯网片融合于植入局部。第4周的观察结果与第3周无明显差异。
(二)植入部位的组织学变化
单纯UBM植入组植入一周后可见明显的炎症反应,此后随时间的延长,炎症反应逐渐减轻,但至第四周时,任有轻微的炎症反应。接种BMSCs的UBM植入一周后亦发生明显的炎症反应,但其程度明显低于单纯UBM植入组,此后随时间延长,炎症反应逐渐降低,至第四周时,植入局部的组织内仅有极少量的炎症细胞,其在植入后的各阶段,炎症反应皆明显低于单纯UBM植入组。单纯聚丙烯网片植入组具有较强的炎症反应,明显高于其他各组,且这种强烈的炎症反应伴随于整个试验观察阶段。复合聚丙烯网片的UBM植入组的炎症反应与单纯UBM植入组类似,初期较为强烈,此后逐渐降低。假手术组未见明显的炎症反应。
(三)免疫组化检测结果
(1)CD4免疫组化检测结果
单纯UBM植入组植入第1周和第2周CD4细胞比例分别为37.1±9.4%和27.9±8.1%,此后其比例迅速下降,第3周和第4周比例分别为10.6±5.1%和8.3±2.9%。接种BMSCs的UBM植入后反应与单纯UBM组类似,但CD4细胞在植入后各阶段均低于UBM组,其第1周至第4周植入局部组织的CD4细胞比例分别为:28.5±4.7%,18.2±3.5%,8.3±3.2%和5.6±2.4%。而单纯聚丙烯网片组在植入后各阶段的CD4细胞比例均维持在一个较高的水平,其第1周至第4周植入局部组织的CD4细胞比例分别为:62.9±11.7%,43.5±8.7%,39.2±7.4%和38.7±6.9%。复合聚丙烯的UBM组植入后的反应趋势与UBM组合接种BMSCs的UBM类似,但植入后各阶段CD4细胞比例均高于以上两组,而显著低于单纯聚丙烯网片组,其第1周至第4周植入局部组织的CD4细胞比例分别为:46.3±10.5%,32.6±5.4%,28.9±4.3%和16.4±3.5%。对照组在各阶段的CD4细胞比例均显著低于其他各组,其第1周至第4周植入局部组织的CD4细胞比例分别为:5.6±2.3%,4.8±2.7%,6.4±2.9%和5.3±1.7%。参见图3。
(2)CD8免疫组化检测结果
单纯UBM植入组植入第1周和第2周CD8细胞比例分别为21.6±3.3%和21.5±2.7%,此后其比例迅速下降,第3周和第4周比例分别为6.2±2.4%和5.5±2.8%。接种BMSCs的UBM植入后反应与单纯UBM组类似,其第1周至第4周植入局部组织的CD8细胞比例分别为:23.4±3.9%,21.3±3.5%,8.1±2.7%和7.5±2.7%。而单纯聚丙烯网片组在植入后各阶段的CD8细胞比例均维持在一个较高的水平,其第1周至第4周植入局部组织的CD8细胞比例分别为:37.3±4.6%,34.4±3.5%,32.6±2.8%和30.7±3.6%。复合聚丙烯的UBM组植入后的反应趋势与UBM组合接种BMSCs的UBM类似,但植入后各阶段CD8细胞比例均高于以上两组,而显著低于单纯聚丙烯网片组,其第1周至第4周植入局部组织的CD8细胞比例分别为:25.7±2.9%,23.4±3.2%,12.6±2.7%和10.4±3.6%。对照组在各阶段的CD8细胞比例均显著低于其他各组,其第1周至第4周植入局部组织的CD8细胞比例分别为:6.1±2.3%,5.4±2.8%,6.8±1.9%和6.3±1.2%。参见图4。
(3)CCR4免疫组化检测结果
单纯UBM植入组植入第1周CCR4细胞比例为12.3±2.1%,第2周迅速增加至55.5±5.6%,第3周和第4周发生回落,分别为13.2±2.2%和12.3±3.7%。接种BMSCs的UBM植入后反应趋势与单纯UBM组类似,其第1周至第4周植入局部组织的CCR4细胞比例分别为:13.4±2.3%,62.3±5.3%,17.9±2.5%和15.7±2.3%,除第一周外,其与各周的比例均显著高于UBM组。单纯聚丙烯网片组在植入后各阶段的CCR4细胞比例均维持在一个较低的水平,其第1周至第4周植入局部组织的CCR4细胞比例分别为:6.3±1.4%,8.4±2.3%,6.2±2.7%和7.3±1.8%。复合聚丙烯的UBM组植入后的反应趋势与UBM组合接种BMSCs的UBM类似,但植入后各阶段CCR4细胞比例均低于以上两组,而显著高于单纯聚丙烯网片组,其第1周至第4周植入局部组织的CCR4细胞比例分别为:9.3±2.7%,24.6±3.5%,9.6±2.3%和8.4±3.1%。对照组在各阶段的CCR4细胞比例均显著低于其他各组,其第1周至第4周植入局部组织的CCR4细胞比例分别为:2.3±1.6%,3.8±2.4%,1.9±1.5%和3.2±1.2%。见图5。
(4)CXCR3免疫组化检测结果
单纯UBM植入组植入第1周CXCR3细胞比例为23.8±4.6%,第2周回落至16.6±3.2%,第3周和第4周分别为9.6±2.4%和5.3±2.6%。接种BMSCs的UBM植入后反应趋势与单纯UBM组类似,其第1周至第4周植入局部组织的CXCR3细胞比例分别为:8.9±2.3%,7.8±2.1%,6.3±2.1%和3.2±1.3%,各周的比例均显著低于UBM组。单纯聚丙烯网片组在植入后各阶段的CXCR3细胞比例均维持在一个较高的水平,其第1周至第4周植入局部组织的CXCR3细胞比例分别为:43.7±6.4%,38.9±7.3%,26.4±5.4%和17.6±6.3%。复合聚丙烯的UBM组植入后的反应趋势与UBM类似,但植入后各阶段CXCR3细胞比例均高于UBM组,而显著低于单纯聚丙烯网片组,其第1周至第4周植入局部组织的CXCR3细胞比例分别为:32.6±7.3%,29.3±5.7%,18.6±4.3%和12.1±2.5%。对照组在各阶段的CXCR3细胞比例均显著低于其他各组,其第1周至第4周植入局部组织的CXCR3细胞比例分别为:4.6±1.3%,5.3±1.8%,4.3±2.1%和4.6±1.8%。见图6。
上述的检测结果表明:不同的材料作为盆底修复补片,其与植入组织的融合程度各不相同。UBM和接种BMSCs的UBM至第三周时已不能从植入部位分辨出来,仅能在植入部位观察到有微黄变化,可能是未降解的组织与体内组织发生融合所致。接种BMSCs的UBM相对单纯的UBM材料,其更易与植入部位的组织发生融合,其原因可能是接种有细胞的材料在植入初期相对未接种细胞的材料,材料内部具有较多的细胞,能表达更多的纤维连接蛋白等基质蛋白,因此更易于与植入局部组织发生融合。至试验观察期结束时,单纯的聚丙烯材料仍无法和植入部位发生融合,而通过夹心方法将聚丙烯材料夹在UBM材料之间有助于聚丙烯材料与植入部位的组织发生融合,在植入后第二周时,就与植入部位的组织发生融合。植入材料与植入部位的有效融合,将有利于促进植入材料修复作用的发挥,因此复合聚丙烯网片的UBM,相对单纯的UBM或聚丙烯材料,具有明显的使用优势。
材料植入初期皆有一定的炎症反应,但UBM和接种BMSCs的UBM的炎症反应随植入时间的延长而逐渐降低,但单纯的聚丙烯材料,在整个植入周期均表现出强烈的炎症反应。复合聚丙烯的UBM的炎症反应与UBM反应趋势移植,其炎症反应程度要显著低于单纯聚丙烯材料组,表明复合聚丙烯的UBM材料中UBM具有一定的炎症隔离作用。相对单纯的UBM,接种有BMSCs的UBM引发的炎症反应程度要低,原因可能是植入的干细胞与不同的免疫细胞相互作用发生免疫调节,在部分程度上抑制了免疫排斥的发生。
在材料植入体内的免疫排斥方面,接种BMSCs的UBM是本试验评价的四种不同材料中具有较低免疫反应性材料,其次为单纯的UBM,最差的为单纯聚丙烯网片。通过对植入局部组织内的细胞免疫组化染色结果显示,UBM组在植入初期CD4细胞比值较高,至第3周时才逐渐降低,接种BMSCs的UBM在植入初期尽管CD4细胞比例有所升高,但显著低于UBM组,单纯的聚丙烯网片组在整个植入期内均维持一个较高的CD4比例,而复合聚丙烯网片的UBM植入后CD4细胞比例趋势与UBM类似,但在植入后各阶段均显著高于UBM组,且显著低于单纯居丙烯补片组。各组植入后CD8细胞的趋势与CD4类似,但比值显著低于CD4细胞比值。结果显示接种BMSCs的UBM和单纯UBM组在第二周时CCR4细胞比值较高,而聚丙烯网片在植入后各阶段的CCR4细胞比值均较低,复合聚丙烯网片的UBM介于二者之间,CXCR3细胞比值在各组中与CCR4正好相反,表明UBM作为盆底修复补片具有移植适应的作用,并且可以利用UBM的这种特性改进聚丙烯网片的免疫排斥反应,同时利用干细胞接种技术还可进一步诱导植入材料向免疫适应分化。
总之,UBM作为盆底修复补片具有引发的炎症和免疫反应较小,且诱导免疫反应向免疫适应转变,且UBM还可修饰聚丙烯网片,起到炎症隔离和免疫调节的作用,本发明中的复合聚丙烯网片的UBM是盆底修复材料的一种优秀选择。
值得注意的是,以上所述仅为本发明的较佳实施例,并非因此限定本发明的专利保护范围,本发明还可以对上述各种零部件的构造进行材料和结构的改进,或者是采用技术等同物进行替换。故凡运用本发明的说明书及图示内容所作的等效结构变化,或直接或间接运用于其他相关技术领域均同理皆包含于本发明所涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种用于女性盆底的生物复合补片,其特征在于,在聚丙烯网片的表面包裹有动物供体的膀胱脱细胞基质。
2.根据权利要求1所述的补片,其特征在于,所述膀胱脱细胞基质还接种有BMSCs。
3.根据权利要求1所述的补片,其特征在于,所述聚丙烯网片为长方形、正方形、圆形或异形体。
4.根据权利要求1-3中任一所述的补片,其特征在于,所述聚丙烯纤维的排列方向与膀胱脱细胞基质的纤维方向呈25-75度。
5.根据权利要求4所述的补片,其特征在于,所述聚丙烯网片的纤维的排列方向与膀胱脱细胞基质的纤维方向呈40-50度。
6.根据权利要求1所述的补片,其特征在于,所述聚丙烯网片内置于两片所述膀胱脱细胞基质之间,可吸收缝合线连接两片所述膀胱脱细胞基质,将聚丙烯网片包裹于内。
7.一种用于女性盆底的生物复合补片的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)制备膀胱脱细胞基质
取动物供体的膀胱,去除粘膜层和浆膜层,获得膀胱基质;
对膀胱基质进行脱细胞处理以及冻干处理;消毒后,低温塑封保存;
(2)取聚丙烯网片,将上述获得的膀胱脱细胞基质包裹于所述聚丙烯网片的表面。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)具体为:将聚丙烯网片内置于两片所述膀胱脱细胞基质之间,用可吸收缝合线将两片所述膀胱脱细胞基质缝合,使得聚丙烯网片包裹于内。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述的膀胱基质的脱细胞过程为:采用脱细胞液和缓冲液对膀胱基质进行反复浸泡和冲洗。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述脱细胞液为三羟甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟的混合液。
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