CN108114318A - 一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108114318A
CN108114318A CN201810038767.1A CN201810038767A CN108114318A CN 108114318 A CN108114318 A CN 108114318A CN 201810038767 A CN201810038767 A CN 201810038767A CN 108114318 A CN108114318 A CN 108114318A
Authority
CN
China
Prior art keywords
eggshell membrane
composite material
hydroxyapatite
concentration
hydroxyapatite composite
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810038767.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108114318B (zh
Inventor
罗丙红
陈学兴
文伟
周长忍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
University of Jinan
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN201810038767.1A priority Critical patent/CN108114318B/zh
Publication of CN108114318A publication Critical patent/CN108114318A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108114318B publication Critical patent/CN108114318B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/365—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用。该复合材料由具备天然蛋白纤维网络结构的鸡蛋膜和原位矿化沉积的羟基磷灰石组成，其中，鸡蛋膜的质量百分含量为5～95％，羟基磷灰石的质量百分含量为95～5％。本发明充分利用鸡蛋膜天然的蛋白组成和纤维网络结构以及良好的力学性能，并采用反应条件温和的体外模拟矿化方法在鸡蛋膜表面原位矿化沉积一层羟基磷灰石，构建仿人骨成分与结构的一种复合材料。最终获得的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料具有良好的力学性能、优异的生物相容性与成骨活性，有望应用于骨组织修复领域。本发明具有制备方法简单、反应条件温和、原料易得、材料易于大批量制备等显著优点。

Description

一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
高分子骨修复材料主要分为人工合成材料和天然材料，由于人工合成材料存在生物相容性一般、缺乏成骨活性等不足，现有骨修复材料的研究仍然还是以天然材料为主，合成材料为辅，并通过各种加工手段模拟细胞外基质结构诱导骨的形成。常用的天然材料有：胶原蛋白、纤维素、甲壳素和透明质酸等。由于人骨主要由胶原和羟基磷灰石构成，因此胶原蛋白是应用于骨修复最理想的材料，但是胶原蛋白一经提取，原有结构与成份易于受到破坏且提取成本也较为昂贵，而且，胶原蛋白难溶，故难以采用静电纺丝的方法构造模拟细胞外基质的纤维结构。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。
本发明的另一目的是提供一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料在骨修复方面的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料，所述复合材料由质量百分含量为5～95％的鸡蛋膜和95～5％的羟基磷灰石组成；且鸡蛋膜具有天然的蛋白纤维网络结构，羟基磷灰石通过生物矿化的方法在鸡蛋膜表面原位形成。
一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法，所述鸡蛋膜由酸法提取，所述羟基磷灰石通过生物矿化的方法在鸡蛋膜表面原位形成。
优选的，所述的酸法提取鸡蛋膜的具体步骤为：在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳；然后将鸡蛋壳置于酸溶液中，室温下浸泡0.1-72h，壳膜自动分离；取出鸡蛋膜用去离子冲洗干净，使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，置于聚四氟乙烯板上，并真空干燥备用。
优选的，所述的生物矿化的方法的具体步骤为，将鸡蛋膜浸泡在1-10倍的模拟体液中，并于37℃下恒温静态浸泡3h～14d，然后取出用去离子水冲洗，再经冷冻干燥，得到表面含有羟基磷灰石矿物的鸡蛋膜。
优选的，配置所述1-10倍的模拟体液的无机盐为NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O、MgCl2·6H2O、Na2SO4和CaCl2，所述1倍的模拟体液的盐离子组成为：Na+，其浓度是142.0mmol/L；K+，其浓度是5.0mmol/L；Mg2+，其浓度是1.5mmol/L；Ca2+，其浓度是2.5mmol/L；Cl-，其浓度是147.8mmol/L；HCO-，其浓度是4.2mmol/L；HPO4 2-，其浓度是1.0mmol/L；SO4 2-，其浓度是0.5mmol/L。
优选的，配置所述模拟体液的倍数改变为所述全体盐离子的浓度比例倍数的改变。
优选的，配置所述模拟体液的倍数改变为所述Ca2+、Cl-、K+、HPO4 2-浓度比例倍数的改变。
优选的，所述酸法提取鸡蛋膜采用的酸溶液为盐酸、硫酸、醋酸、硝酸、乙二胺四乙酸中的至少一种，所述酸溶液的浓度为0.1-10mol/L。
一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料在骨组织修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明充分利用鸡蛋膜天然的蛋白组成和类似细胞外基质结构的蛋白纤维网络结构以及良好的力学性能，并采用反应条件温和的体外模拟矿化方法在鸡蛋膜表面原位矿化沉积一层羟基磷灰石，构建仿人骨成分与结构的一种新型复合材料。
(2)这类鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料具有良好的力学性能、优异的生物相容性与成骨活性。由于碳酸钙质的蛋壳矿化形成于母鸡的子宫部位，并且在24小时内就可以形成，这说明鸡蛋膜本身具有良好的矿化诱导能力。另外，羟基磷灰石具有良好的成骨诱导性，是一种理想的成骨活性材料。
(3)体外模拟矿化是模拟生物体通过生物大分子在温和的条件下调控生成无机矿物的过程，这是在有机质参与调控与诱导下，从周围环境中选择性吸收无机元素并沉积在特定的有机质上，构建体内高度有序和具有特殊功能的矿物质的过程。通过配制与人体组织内部相似离子浓度的模拟体液，在体外进行模拟矿化，有望在材料表面原位矿化出一种有序结构的羟基磷灰石矿物。
(4)鸡蛋膜作为一种天然生物支架材料，具有来源广，价格低廉，易于制取的特点，而且也有相关研究证明鸡蛋膜敷料具有良好的生物相容性以及低的免疫原性。
附图说明
图1是鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的整个制备流程图。
图2是实施例1采用酸法提取的鸡蛋膜内外侧的形貌与能谱图：其中图A是鸡蛋膜内侧的形貌图，图B是鸡蛋膜外侧的形貌图，图C是鸡蛋膜内侧的能谱图，图D是鸡蛋膜外侧的能谱图。
图3是实施例2中鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的扫描电镜图：其中图A是鸡蛋膜内侧/羟基磷灰石的扫描电镜图，图B是鸡蛋膜外侧/羟基磷灰石的扫描电镜图。
图4是实施例3中鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料表面羟基磷灰石的扫描电镜图与能谱图：其中图a是鸡蛋膜内侧/羟基磷灰石的扫描电镜图，图aa是鸡蛋膜内侧/羟基磷灰石的能谱图，图b是鸡蛋膜外侧/羟基磷灰石的扫描电镜图，图bb是鸡蛋膜外侧/羟基磷灰石的能谱图。
图5是实施例5制备的鸡蛋膜和鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的热失重图。
图6是实施例6制备的鸡蛋膜与鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料内外侧表面上小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)的增殖情况图。
图7是实施例7制备的鸡蛋膜与鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料内外侧表面上MC3T3-E1细胞黏附铺展1天的激光共聚焦显微镜照片：其中，图A是鸡蛋膜内侧的激光共聚焦显微镜照片，图B是鸡蛋膜外侧的激光共聚焦显微镜照片，图C是鸡蛋膜内侧/羟基磷灰石的激光共聚焦显微镜照片，图D是鸡蛋膜外侧/羟基磷灰石的激光共聚焦显微镜照片。
图8是实施例8为制备的鸡蛋膜与鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料内外侧表面上MC3T3-E1细胞培养7天与14天碱性磷酸酶(ALP)的分泌情况对比图。
图9是实施例8为制备的鸡蛋膜与鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料内外侧表面上MC3T3-E1细胞培养7天与14天相关成骨基因表达量对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作出进一步详细的描述，如无特别说明，本发明中所有原料和试剂均为市购常规的原料、试剂。
实施例1
(1)在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳,将所得的鸡蛋壳置于5.0mol/L的醋酸溶液中，室温下浸泡0.5h之后，壳膜分离，取出鸡蛋膜用去离子冲洗并轻轻擦洗干净，然后使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，放于聚四氟乙烯板上，置于真空干燥箱干燥24h后，放干燥柜中保存备用。采用扫描电镜联用能谱图对所提取的鸡蛋膜的内外形貌进行了观察，如图2所示。从图中可以看出，鸡蛋膜内侧显示平整而又致密，这是鸡蛋膜的限制层，限制层铺展于鸡蛋膜的纤维网络结构上，鸡蛋膜外侧显示带有一些突起结点的纤维网络结构，且鸡蛋膜的内外侧元素组成均主要C、H、O、N、S。
(2)配制模拟体液(SBF)。室温下，取800mL的去离子水于1.0L的烧杯中，用磁力搅拌器持续搅拌，然后根据下表1中配制SBF加入无机盐的质量与顺序，依次缓慢加入无机盐；最后加入Tris时，用50mL去离子水先溶解Tris再缓慢滴入1.0L的烧杯中，然后在1.0L的容量瓶中定容，使最终pH控制在7.45，即得澄清透明的SBF，其盐离子组成为：Na+，142.0mmol/L；K+，5.0mmol/L；Mg2+，1.5mmol/L；Ca2+，2.5mmol/L；Cl-，147.8mmol/L；HCO-，4.2mmol/L；HPO4 2-，1.0mmol/L；SO4 2-，0.5mmol/L。
表1配制1.0L的SBF加入无机盐的质量与顺序
(3)进行体外模拟矿化。将步骤(1)制得的鸡蛋膜剪成1.5cm×1.5cm大小分别放入50mL离心管中，然后加入50mL步骤(2)制得的升温至37℃澄清透明的SBF溶液并拧紧盖子，再将离心管放入37℃恒温水浴箱中恒温矿化14天，期间每隔一天更换一次37℃的SBF溶液。矿化14天后取出，用去离子水将矿化后的鸡蛋膜上残留盐离子冲洗干净，最后进行冷冻干燥而制得所述的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。通过热失重分析测得所制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料中羟基磷灰石的质量百分含量为56.5％。
实施例2
(1)在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳,将所得的鸡蛋壳置于0.1mol/L的盐酸溶液中，室温下浸泡48h之后，壳膜分离，取出鸡蛋膜用去离子冲洗并轻轻擦洗干净，然后使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，放于聚四氟乙烯板上，置于真空干燥箱干燥24h后，放干燥柜中保存备用。
(2)配制1.5倍的模拟体液(1.5×SBF)。室温下，取800mL的去离子水于1.0L的烧杯中，用磁力搅拌器持续搅拌，然后根据下表2中配制1.5×SBF加入无机盐的质量与顺序，依次缓慢加入无机盐；最后加入Tris时，用50mL去离子水先溶解Tris再缓慢滴入1.0L的烧杯中，然后在1.0L的容量瓶中定容，使最终pH控制在7.45，即得澄清透明的1.5×SBF，其提高1.5倍的无机盐为K2HPO4·3H2O与CaCl2。
表2配制1.0L的1.5×SBF加入无机盐的质量与顺序
(3)进行体外模拟矿化。将步骤(1)制得的鸡蛋膜剪成1.5cm×1.5cm大小分别放入50mL离心管中，然后加入50mL步骤(2)制得的升温至37℃澄清透明的1.5×SBF溶液并拧紧盖子，再将离心管放入37℃恒温水浴箱中恒温矿化5天，期间每隔一天更换一次37℃澄清透明的1.5×SBF溶液，然后取出，用去离子水将矿化后的鸡蛋膜上残留盐离子冲洗干净，最后进行冷冻干燥而制得所述的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。对鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料进行微观形貌检测，如图3所示，鸡蛋膜内外侧均有大量矿物盐的形成。通过热失重分析测得所制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料中羟基磷灰石的质量百分含量为40.8％。
实施例3
(1)在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳,将所得的鸡蛋壳置于1.0mol/L的盐酸溶液中，室温下浸泡1.5h之后，壳膜自动分离，取出鸡蛋膜用去离子冲洗并轻轻擦洗干净，然后使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，放于聚四氟乙烯板上，置于真空干燥箱干燥24h后，放干燥柜中保存备用。
(2)配制1.5倍的模拟体液(1.5×SBF)。室温下，取800mL的去离子水于1.0L的烧杯中，用磁力搅拌器持续搅拌，然后根据实施例2中表2配制1.5×SBF加入无机盐的质量与顺序，依次缓慢加入无机盐；最后加入Tris时，用50mL去离子水先溶解Tris再缓慢滴入1.0L的烧杯中，然后在1.0L的容量瓶中定容，使最终pH控制在7.45，即得澄清透明1.5×SBF，其提高1.5倍的无机盐为K2HPO4·3H2O与CaCl2。
(3)进行体外模拟矿化。将步骤(1)制得的鸡蛋膜剪开两半置于分别放入500mL烧杯中，然后加入500mL步骤(2)制得的升温至37℃澄清透明的1.5×SBF溶液并用保鲜膜盖住烧杯口，再将该烧杯放入37℃恒温水浴箱中恒温矿化2天后取出，用去离子水将矿化后的鸡蛋膜上残留盐离子冲洗干净，最后进行冷冻干燥而制得所述的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。图4为鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料表面羟基磷灰石的扫描电镜形貌与EDS能谱图。结果显示，矿化2天后，鸡蛋膜的内外两面均有新生成的矿物覆盖，通过联用扫描电镜附带的能谱仪，对鸡蛋膜两侧上的矿物进行点扫，其Ca/P接近1.67，结果证明成功地制备了鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。通过热失重分析测得所制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料中羟基磷灰石的质量百分含量为10.8％。
实施例4
(1)在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳,将所得的鸡蛋壳置于0.1mol/L的硝酸溶液中，室温下浸泡1.0h之后，壳膜分离，取出鸡蛋膜用去离子冲洗并轻轻擦洗干净，然后使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，放于聚四氟乙烯板上，置于真空干燥箱干燥24h后，放干燥柜中保存备用。
(2)配制1.5倍的模拟体液(1.5×SBF)。室温下，取800mL的去离子水于1.0L的烧杯中，用磁力搅拌器持续搅拌，然后根据下表3中配制1.5×SBF加入无机盐的质量与顺序，依次缓慢加入无机盐；最后加入Tris时，用50mL去离子水先溶解Tris再缓慢滴入1.0L的烧杯中，然后在1.0L的容量瓶中定容，使最终pH控制在7.30，即得澄清透明的1.5×SBF，其提高1.5倍的无机盐为NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O、MgCl2·6H2O、Na2SO4与CaCl2。
表3配制1.0L的1.5×SBF加入无机盐的质量与顺序
(3)进行体外模拟矿化。将步骤(1)制得的鸡蛋膜剪成1.5cm×1.5cm大小分别放入50mL离心管中，然后加入50mL步骤(2)制得的升温至37℃澄清透明的1.5×SBF溶液并拧紧盖子，再将离心管放入37℃恒温水浴箱中恒温矿化4天，期间每隔一天更换一次37℃澄清透明的1.5×SBF溶液，然后取出，用去离子水将矿化后的鸡蛋膜上残留盐离子冲洗干净，最后进行冷冻干燥而制得所述的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。通过热失重分析测得所制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料中羟基磷灰石的质量百分含量为30.1％。
实施例5
(1)在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳,将所得的鸡蛋壳置于1.0mol/L的硫酸溶液中，室温下浸泡12h之后，壳膜分离，取出鸡蛋膜用去离子冲洗并轻轻擦洗干净，然后使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，放于聚四氟乙烯板上，置于真空干燥箱干燥24h后，放干燥柜中保存备用。
(2)配制5倍的模拟体液(5×SBF)。室温下，取800mL的去离子水于1.0L的烧杯中，用磁力搅拌器持续搅拌，然后根据下表4中配制5×SBF加入无机盐的质量与顺序，依次缓慢加入无机盐。
表4配制1.0L的5×SBF加入无机盐的质量与顺序
在最后加入1.0mol/L盐酸与Tris时，缓慢滴加，使溶液pH在6.45，最后用1.0L的容量瓶定容，最终pH在6.40即得澄清透明的5×SBF，其提高5倍的无机盐为NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O、MgCl2·6H2O、Na2SO4与CaCl2。
(3)进行体外模拟矿化。将步骤(1)制得的鸡蛋膜剪开两半置于分别放入500mL烧杯中，然后加入500mL步骤(2)制得的升温至37℃澄清透明的5×SBF溶液并用保鲜膜盖住烧杯口，再将该烧杯放入37℃恒温水域箱中恒温矿化12h后取出，用去离子水将矿化后的鸡蛋膜上残留盐离子冲洗干净，最后进行冷冻干燥而制得所述的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。如图5所示，通过热失重分析测得所制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料中羟基磷灰石的质量百分含量为32.5％。
实施例6
(1)在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳,将所得的鸡蛋壳置于2.0mol/L的乙二胺四乙酸溶液中，室温下浸泡3.0h之后，壳膜分离，然后使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，放于聚四氟乙烯板上，置于真空干燥箱干燥24h后，放干燥柜中保存备用。
(2)配制10倍的模拟体液(10×SBF)。室温下，取800mL的去离子水于1.0L的烧杯中，用磁力搅拌器持续搅拌，然后根据下表5中配制10×SBF加入无机盐的质量与顺序，依次缓慢加入无机盐。在最后加入1.0mol/L盐酸与Tris时，缓慢滴加，使溶液pH在6.10左右，最后用1.0L的容量瓶定容，最终pH在6.0，即得澄清透明的10×SBF，其提高10倍的无机盐为K2HPO4·3H2O与CaCl2。
表5配制1.0L的10×SBF加入无机盐的质量与顺序
(3)进行体外模拟矿化。将步骤(1)制得的鸡蛋膜剪开两半置于分别放入500mL烧杯中，然后加入500mL步骤(2)制得的升温至37℃澄清透明的10×SBF溶液并用保鲜膜盖住烧杯口，再将该烧杯放入37℃恒温水浴箱中恒温矿化24h后取出，用去离子水将矿化后的鸡蛋膜上残留盐离子冲洗干净，最后进行冷冻干燥而制得所述的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。通过热失重分析测得所制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料中羟基磷灰石的质量百分含量为57.9％。
采用CCK-8法来测试MC3T3-E1细胞在材料表面的增殖。细胞培养1、4、7天后移除培养基，用无菌PBS清洗两次，再加入现配的含10％的CCK-8培养基500μL培养3h后，吹打均匀，再每孔取3个100μL放于96孔板中用酶标仪在450nm处测定其吸光度，吸光度值越高表明细胞活性越好。如图6结果显示，随着时间的延长，所有材料表面上的MC3T3-E1细胞的OD值均增加，且鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料表面细胞的OD值显著优于鸡蛋膜组，且以鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料内侧这组材料的OD值最高。
实施例7
(1)在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳,将所得的鸡蛋壳置于3.0mol/L的盐酸溶液中，室温下浸泡0.5h之后，壳膜自动分离，取出鸡蛋膜用去离子冲洗并轻轻擦洗干净，然后使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，放于聚四氟乙烯板上，置于真空干燥箱干燥24h后，放干燥柜中保存备用。
(2)配制5倍的模拟体液(5×SBF)。室温下，取800mL的去离子水于1.0L的烧杯中，用磁力搅拌器持续搅拌，然后根据下表6中配制5×SBF加入无机盐的质量与顺序，依次缓慢加入无机盐。
表6配制1.0L的5×SBF加入无机盐的质量与顺序
在最后加入1.0mol/L盐酸与Tris时，缓慢滴加，使溶液pH在6.45，最后用1.0L的容量瓶定容，最终pH在6.40，即得澄清透明的5×SBF，其提高5倍的无机盐为NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O、MgCl2·6H2O、Na2SO4与CaCl2。
(3)进行体外模拟矿化。将步骤(1)制得的鸡蛋膜剪开两半置于分别放入500mL烧杯中，然后加入500mL步骤(2)制得的升温至37℃澄清透明的5×SBF溶液并用保鲜膜盖住烧杯口，再将该烧杯放入37℃恒温水浴箱中恒温矿化4天，期间每隔一天更换一次37℃澄清透明的5×SBF溶液，达到4天后取出，用去离子水将矿化后的鸡蛋膜上残留盐离子冲洗干净，最后进行冷冻干燥而制得所述的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。通过热失重分析测得所制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料中羟基磷灰石的质量百分含量为60.5％。
用激光聚焦显微镜观察MC3T3-E1细胞培养1天后的粘附与铺展情况。细胞培养1天后移出培养基，用PBS清洗三次；加入4％的多聚甲醛固定15分钟再移出，再用PBS清洗三次；然后用0.1％的Tritonx-100摇晃清洗三次，每次摇晃5min，再移出；每个孔加入200μL现配的罗丹明标记的鬼笔环肽(按所购买的试剂说明书操作)避光染色1h再移出；用0.1％的Tritonx-100摇晃清洗两次，再移出，每次摇晃5min；再每孔加入300μL现配的DAPI染剂(按所购买的试剂说明书操作)避光染色20min再移出，用PBS清洗两次，再将对细胞染色好的材料倒扣于激光共聚焦显微镜培养皿中，并加少量PBS润湿，最后在激光共聚焦显微镜下观察。如图7结果显示MC3T3-E1细胞在鸡蛋膜内侧表面铺展粘附较为良好，细胞铺展面积较大；相比于细胞在矿化前的鸡蛋膜表面的铺展，细胞在鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料表面的黏附和铺展较好，细胞铺展面积大。
实施例8
(1)在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳,将所得的鸡蛋壳置于1.5mol/L的硝酸溶液中，室温下浸泡36h之后，壳膜分离，取出鸡蛋膜用去离子冲洗并轻轻擦洗干净，然后使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，放于聚四氟乙烯板上，置于真空干燥箱干燥24h后，放干燥柜中保存备用。
(2)配制1.5倍的模拟体液(1.5×SBF)。室温下，取800mL的去离子水于1.0L的烧杯中，用磁力搅拌器持续搅拌，然后根据下表7中配制1.5×SBF加入无机盐的质量与顺序，依次缓慢加入无机盐；最后加入Tris时，用50mL去离子水先溶解Tris再缓慢滴入1.0L的烧杯中，然后在1.0L的容量瓶中定容，使最终pH控制在7.45，即得澄清透明的1.5×SBF，其提高1.5倍的无机盐为K2HPO4·3H2O与CaCl2。
表7配制1.0L的1.5×SBF加入无机盐的质量与顺序
(3)进行体外模拟矿化。将步骤(1)制得的鸡蛋膜剪成1.5cm×1.5cm大小分别放入50mL离心管中，然后加入50mL步骤(2)制得的升温至37℃澄清透明的1.5×SBF溶液并拧紧盖子，再将离心管放入37℃恒温水浴箱中恒温矿化10天，期间每隔一天更换一次37℃澄清透明的1.5×SBF溶液，然后取出，用去离子水将矿化后的鸡蛋膜上残留盐离子冲洗干净，最后进行冷冻干燥而制得所述的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。通过热失重分析测得所制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料中羟基磷灰石的质量百分含量为49.2％。
利用ALP试剂盒和BCA蛋白试剂盒来评价细胞的早期分化情况。将细胞培养7、14天后，每孔加入300μL的1.0％的Tritonx-100裂解40min，每10min摇晃均匀，得到均匀的细胞裂解液；再每孔取30μL的细胞裂解液于96孔板中，根据ALP试剂盒说明书进行操作加样，然后在492nm处测定其吸光度；同时取20μL的细胞裂解液于96孔板，根据BCA蛋白试剂盒说明书进行操作加样，在570nm处测定吸光度，并根据说明书绘制相应的吸光度与BCA蛋白浓度标准曲线；最后根据说明书公式，用两个吸光度值计算出每单位质量蛋白质中ALP的量。如图8，MC3T3-E1细胞在不同材料表面上于7天和14天分泌的ALP量，结果表明鸡蛋膜的外侧表面更有利于细胞的成骨分化，而经过矿化后含有羟基磷灰石的复合材料表面又进一步促进了MC3T3-E1细胞的成骨分化。
实施例9
(1)在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳,将所得的鸡蛋壳置于3.0mol/L的盐酸溶液中，室温下浸泡0.5h之后，壳膜分离，然后使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，放于聚四氟乙烯板上，置于真空干燥箱干燥24h后，放干燥柜中保存备用。
(2)配制2.5倍的模拟体液(2.5×SBF)。室温下，取800mL的去离子水于1.0L的烧杯中，用磁力搅拌器持续搅拌，然后根据下表8中配制2.5×SBF加入无机盐的质量与顺序，依次缓慢加入无机盐。在最后加入1.0mol/L盐酸与Tris时，缓慢滴加，使溶液pH在7.35左右，最后用1.0L的容量瓶定容，最终pH在7.30，即得澄清透明的2.5×SBF，其提高2.5倍的无机盐为K2HPO4·3H2O与CaCl2。
表8配制1.0L的2.5×SBF加入无机盐的质量与顺序
(3)进行体外模拟矿化。将步骤(1)制得的鸡蛋膜剪开两半置于分别放入500mL烧杯中，然后加入500mL步骤(2)制得的升温至37℃澄清透明的2.5×SBF溶液并用保鲜膜盖住烧杯口，再将该烧杯放入37℃恒温水浴箱中恒温矿化3天后取出，用去离子水将矿化后的鸡蛋膜上残留盐离子冲洗干净，最后进行冷冻干燥而制得所述的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料。通过热失重分析测得所制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料中羟基磷灰石的质量百分含量为37.9％。
将同样密度的细胞在材料上分别培养7天和14天后，吸去孔板中的培养基，用PBS清洗三次，用胰蛋白酶将样品膜上的细胞消化下来并离心收集。利用逆转录PCR(RT-PCR)技术，以β-actin为内参，对在样品膜上培养的MC3T3-E1细胞的成骨分化相关基因Runx-2、ALP、COL-I和OCN表达情况进行检测。如图9，MC3T3-E1细胞在不同材料表面上于7天和14天不同基因的相对表达结果，结果表明鸡蛋膜相对于空白样品的表达效果要略好，矿化后鸡蛋膜内外两侧培养的细胞的基因表达区别虽然不明显，但矿化后制备的鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料更有利于细胞的成骨基因表达，这也进一步证明了经过矿化后含有羟基磷灰石的复合材料能促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。
需理解，本发明的实施方式仅限于说明本发明，不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据本发明内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的修正与选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

Claims (10)

1.一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料，其特征在于，所述复合材料由质量百分含量为5～95％的鸡蛋膜和95～5％的羟基磷灰石组成；且鸡蛋膜具有天然的蛋白纤维网络结构，羟基磷灰石通过生物矿化的方法在鸡蛋膜表面原位形成。
2.根据权利要求1所述的一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，所述鸡蛋膜由酸法提取，所述羟基磷灰石通过生物矿化方法在鸡蛋膜表面原位形成。
3.根据权利要求2所述的一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，所述的酸法提取鸡蛋膜的具体步骤为：在鸡蛋钝端处开一小口，去除蛋清和蛋黄，用水冲洗干净鸡蛋壳；然后将鸡蛋壳置于酸溶液中，室温下浸泡时间是0.1-72h，壳膜自动分离；取出鸡蛋膜用去离子冲洗干净，使鸡蛋膜保持鸡蛋的椭球状，置于聚四氟乙烯板上，并真空干燥备用。
4.根据权利要求3所述的一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，所述浸泡时间是0.5-3h。
5.根据权利要求2所述的一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，所述的生物矿化方法的具体步骤为，将鸡蛋膜浸泡在1-10倍的模拟体液中，并于15-40℃下恒温静态浸泡3h～14d，然后取出用去离子水冲洗，再经冷冻干燥，得到表面含有羟基磷灰石矿物的鸡蛋膜。
6.根据权利要求5所述的一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，将鸡蛋膜浸泡在1-3倍的模拟体液中，于37℃下恒温静态浸泡。
7.根据权利要求5所述的一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，配置所述1-10倍的模拟体液的无机盐为NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O、MgCl2·6H2O、Na2SO4和CaCl2，所述1倍的模拟体液的盐离子组成为：Na+，其浓度是142.0mmol/L；K+，其浓度是5.0mmol/L；Mg2+，其浓度是1.5mmol/L；Ca2+，其浓度是2.5mmol/L；Cl-，其浓度是147.8mmol/L；HCO-，其浓度是4.2mmol/L；HPO4 2-，其浓度是1.0mmol/L；SO4 2-，其浓度是0.5mmol/L。
8.根据权利要求7所述的一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，配置所述模拟体液的倍数改变为所述全体盐离子的浓度比例倍数的改变；或配置所述模拟体液的倍数改变为所述Ca2+、Cl-、K+、HPO4 2-浓度比例倍数的改变。
9.根据权利要求2或3所述的一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，所述酸法提取鸡蛋膜采用的酸溶液为盐酸、硫酸、醋酸、硝酸、乙二胺四乙酸中的至少一种，所述酸溶液的浓度为0.1-10mol/L，所述酸溶液的浓度为0.5-5mol/L。
10.权利要求1所述的一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料在骨组织修复材料中的应用。
CN201810038767.1A 2018-01-16 2018-01-16 一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用 Active CN108114318B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810038767.1A CN108114318B (zh) 2018-01-16 2018-01-16 一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810038767.1A CN108114318B (zh) 2018-01-16 2018-01-16 一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108114318A true CN108114318A (zh) 2018-06-05
CN108114318B CN108114318B (zh) 2021-03-19

Family

ID=62232809

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810038767.1A Active CN108114318B (zh) 2018-01-16 2018-01-16 一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108114318B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109569586A (zh) * 2018-12-29 2019-04-05 泉州师范学院 一种基于鸡蛋膜的光催化复合材料及其制备方法与应用
CN111330078A (zh) * 2020-03-18 2020-06-26 华中农业大学 一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用
CN112899808A (zh) * 2021-01-15 2021-06-04 泉州师范学院 一种多功能纳米纤维及其制备方法与应用
CN114470326A (zh) * 2021-12-06 2022-05-13 中国人民解放军空军军医大学 一种仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法及其应用
CN116440330A (zh) * 2023-04-12 2023-07-18 山东第一医科大学附属省立医院(山东省立医院) 一种多功能防粘连生物膜及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006045181A (ja) * 2003-11-18 2006-02-16 Sekisui Chem Co Ltd 皮膚外用組成物
CN101974133A (zh) * 2010-10-30 2011-02-16 绥化学院 一种利用鸡蛋膜制备可降解高吸水性树脂的方法
CN102225777A (zh) * 2011-04-02 2011-10-26 哈尔滨工程大学 一种以蛋膜为模板的生长水滑石的方法
CN102274738A (zh) * 2011-06-16 2011-12-14 华东理工大学 一种易回收纳米复合催化剂及其制备方法
CN106310385A (zh) * 2016-08-23 2017-01-11 中国人民解放军第三军医大学第附属医院 一种用于人工皮肤的鸡蛋膜复合纳米银薄膜的制备方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006045181A (ja) * 2003-11-18 2006-02-16 Sekisui Chem Co Ltd 皮膚外用組成物
CN101974133A (zh) * 2010-10-30 2011-02-16 绥化学院 一种利用鸡蛋膜制备可降解高吸水性树脂的方法
CN102225777A (zh) * 2011-04-02 2011-10-26 哈尔滨工程大学 一种以蛋膜为模板的生长水滑石的方法
CN102274738A (zh) * 2011-06-16 2011-12-14 华东理工大学 一种易回收纳米复合催化剂及其制备方法
CN106310385A (zh) * 2016-08-23 2017-01-11 中国人民解放军第三军医大学第附属医院 一种用于人工皮肤的鸡蛋膜复合纳米银薄膜的制备方法及应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARMITAGE, OE等: "Biomimetic calcium carbonate-gelatin composites as a model system for eggshell mineralization", 《JOURNAL OF MATERIALS RESEARCH》 *
YING ZHANG等: "Flower-like agglomerates of hydroxyapatite crystals formed on an egg-shell membrane", 《COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES》 *
刘琳等: "预处理对丝素蛋白膜调控羟基磷灰石晶体生长的影响", 《高等化学学报》 *
曾戎，屠美: "《生物医用仿生高分子材料》", 31 October 2010, 广州：华南理工大学出版社 *
杨小红等: "简易模板法仿生合成碳酸钙纳米球", 《池州师专学报》 *
钱君超: "生物鸡蛋内膜结构氧化铈材料的合成与表征", 《高等学校化学学报》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109569586A (zh) * 2018-12-29 2019-04-05 泉州师范学院 一种基于鸡蛋膜的光催化复合材料及其制备方法与应用
CN111330078A (zh) * 2020-03-18 2020-06-26 华中农业大学 一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用
CN112899808A (zh) * 2021-01-15 2021-06-04 泉州师范学院 一种多功能纳米纤维及其制备方法与应用
CN112899808B (zh) * 2021-01-15 2022-09-20 泉州师范学院 一种多功能纳米纤维及其制备方法与应用
CN114470326A (zh) * 2021-12-06 2022-05-13 中国人民解放军空军军医大学 一种仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法及其应用
CN114470326B (zh) * 2021-12-06 2022-09-13 中国人民解放军空军军医大学 一种仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法及其应用
CN116440330A (zh) * 2023-04-12 2023-07-18 山东第一医科大学附属省立医院(山东省立医院) 一种多功能防粘连生物膜及其制备方法和应用
CN116440330B (zh) * 2023-04-12 2023-11-14 山东第一医科大学附属省立医院(山东省立医院) 一种多功能防粘连生物膜及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108114318B (zh) 2021-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108114318A (zh) 一种鸡蛋膜/羟基磷灰石复合材料及其制备方法与应用
CN105412987B (zh) 一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法
Shen et al. Tough biodegradable chitosan–gelatin hydrogels via in situ precipitation for potential cartilage tissue engineering
CN111330078B (zh) 一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用
CN106075579B (zh) 鱼皮衍生组织修复材料及其制造方法
CN101385870B (zh) 一种改良去细胞组织工程瓣膜/血管支架的方法
CN104888273B (zh) 一种双层复合型硬脑膜及其制备方法
CN107115565B (zh) 一种羟基磷灰石/相转变溶菌酶涂层杂化材料及其制备方法
CN111214705B (zh) 软骨复合支架及其制备方法
CN102293688B (zh) 一种蚕丝支架及其制备与应用
CN103585678A (zh) 一种酪蛋白-碳酸钙微球改性聚乳酸膜材料及其制备方法和应用
CN106011815A (zh) 用于镁基生物材料表面改性的杂化复合涂层的制备方法
CN104826163B (zh) 一种有效提高骨损伤修复的复合支架材料
CN102100927B (zh) 多孔羟基磷酸钙纳米颗粒修饰的钛基钛酸盐纳米线生物支架材料及其制备方法
CN106563173B (zh) 一种脱细胞生物真皮材料及其制备方法和应用
Ventura et al. Bone regeneration using hydroxyapatite sponge scaffolds with in vivo deposited extracellular matrix
CN1846793B (zh) 一种组织工程骨及其构建与应用
KR20200010344A (ko) 실 및 그 제조 방법
CN104129113A (zh) 含有生物活性涂层的镍钛合金及其制备方法和应用
CN108853590A (zh) 一种人工真皮
CN105031724B (zh) 一种组织工程软骨支架及其制备方法
CN102302807A (zh) 负载干细胞的壳聚糖挂膜聚丙烯网片及其制备方法
CN101601871A (zh) 矿化电纺明胶超细纤维仿生骨修复材料及其制备方法
CN100393369C (zh) 明胶、蒙脱土和壳聚糖多孔组织工程支架材料及制备方法
CN107412855A (zh) 具有涂层的3d打印支架及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant