CN109381478A - 一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用 - Google Patents
一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109381478A CN109381478A CN201811284351.4A CN201811284351A CN109381478A CN 109381478 A CN109381478 A CN 109381478A CN 201811284351 A CN201811284351 A CN 201811284351A CN 109381478 A CN109381478 A CN 109381478A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- vegf
- mechanical force
- expression
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供了一种miRNA在制备抑制新生血管生成的试剂中的应用,属于生物医学技术领域,所述miRNA为miR‑204,所述miR‑204的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的miR204能够显著抑制VEGF‑A因子表达,从而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管,抑制新生血管的生成。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,尤其涉及一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用。
背景技术
正常角膜的无血管化对于免疫赦免和屈光非常重要,一些病理情况下,如眼外伤、感染、炎症、角膜缘干细胞缺乏等,角膜中各种炎症细胞和免疫细胞浸润、基质水肿、角膜上皮持续缺损,角膜透明性降低,引起角膜新生血管生长,导致视力下降甚至致盲。
经典的血管生成理论认为,损伤或肿瘤肉芽组织的血管是通过下述三种方式生成的:从先前存在的血管中发出新的分支;内皮细胞出芽生长;微血管的套叠式生长。但是,在2009年,Kilarski等提出一种全新的血管生成理论,他们认为新生血管可以不依赖于已经存在的血管的扩展而生成,组织张力能介导血管的生成。
在正常血管发育和病理性血管形成过程中,血管内皮生长因子(VEGF) 家族发挥着必不可少的作用,VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子,具有增加血管通透性和血管形成等作用,其中VEGF-A是最重要的血管调控因子,在机体中广泛存在,在角膜中,其主要表达于上皮细胞层, VEGF-A通过与其受体VEGFR-1和VEGFR-2结合而促进血管内皮细胞增殖、迁移。
目前尚没有一种有效抑制角膜血管生长的试剂和方法。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用,以及一种非疾病诊断和治疗目的的有效抑制由组织张应力引起的角膜血管生长的方法。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
一种miRNA在制备抑制新生血管生成的试剂中的应用,所述miRNA 为miR-204,所述miR-204的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的,所述miR-204抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管。
本发明提供了所述的miRNA在制备抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用。
优选的,所述miR-204抑制由组织张应力诱导的VEGF-A因子的表达。
优选的,所述miR-204包括miR-204agomir;所述miR-204agomir在所述试剂中的浓度为150~250nmol/l。
本发明还提供了一种诱导的VEGF-A因子表达的方法,包括以下步骤:将机械力间歇性作用于角膜上皮细胞,所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度为4~6%,所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率为0.8~1.2Hz,所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间为5.5~6.5h。
优选的,所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度为5%,所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率为1.9~1.1Hz,所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间为5.8~6.3h。
优选的,所述机械力为组织张应力。
本发明的有益效果:本发明提供了miRNA在制备抑制新生血管生成的试剂中的应用,本发明提供的miR204能够显著抑制VEGF-A因子表达,从而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管,抑制新生血管的生成。
本发明还提供了组织张应力诱导的VEGF-A因子表达的方法,利用本发明所述的方法,将组织张应力间歇性作用于角膜上皮细胞,能够引起VEGF-A 因子表达量的显著提高。
附图说明
图1为角膜新生血管生长及miR-204表达情况,其中A,正常角膜及缝线后10天、20天角膜新生血管生长情况,以CD31标记血管;B,原位杂交检测miR-204主要表达于角膜上皮;C,PCR检测角膜中miR-204的表达, Ctrl,正常对照;*p<0.05;
图2为miR-204agomir抑制角膜新生血管形成,其中左,缝线后10天角膜新生血管分布;中,注射NTC后角膜新生血管分布;右,注射miR-204 agomir后角膜血管分布;
图3为miR-204抑制角膜VEGF-A和VEGFR2的表达,其中A,免疫组化法检测VEGF-A和VEGFR2表达;B,western blot方法分析VEGF-A 和VEGFR2表达;
图4为周期性张应力刺激引起人角膜上皮细胞高表达VEGF、低表达 miR-204,其中A,PCR检测VEGF-A表达;B,PCR检测miR-204表达; C,western blot检测VEGF-A蛋白表达;D,VEGF-A蛋白表达统计图, *p<0.05);
图5为MiR-204抑制人微血管内皮细胞的迁移和成管,其中A,细胞迁移图;B,细胞迁移面积统计图;C,细胞成管图;D,细胞成管统计图, *p<0.05。
具体实施方式
本发明提供了一种miRNA在制备抑制新生血管生成的试剂中的应用,所述miRNA为miR-204,所述miR-204的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,具体为uucccuuugucauccuaugccu。本发明中所述miR-204位于人染色体 9q21.12;所述miR-204能够抑制新生血管的生成,所述miR-204能够抑制机械力引起的新生血管的生成,还能够抑制碱烧伤诱导的新生血管生成;所述机械力优选为组织张应力。本发明中,所述miR-204能够显著抑制VEGF-A 和VEGFR2因子表达,从而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管,抑制新生血管的生成。
在本发明中,所述miR-204优选的包括miR-204agomir;所述miR-204 agomir在所述试剂中的浓度优选为150~250nmol/l,更优选为180~220nmol/l,最优选为200nmol/l。本发明中,所述miR-204agomir优选的购自广州锐博公司,为粉末状物。所述miR-204agomir在使用时,优选的用无RNA酶去离子水溶解稀释,配制成上述优选浓度。
本发明还提供了一种诱导的VEGF-A因子表达的方法,包括以下步骤:将机械力间歇性作用于角膜上皮细胞,所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度为4~6%,所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率为0.8~1.2Hz,所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间为5.5~6.5h。在本发明中,所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度优选为5%,所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率优选为1.0Hz;所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间优选为6h。本发明中,所述机械力优选为组织张应力,所述组织张应力优选的通过加力仪提供,更优选为周期性张应力加载装置,所述周期性张应力加载装置由计算机控制的应力加载***和圆形应力加载平台构成,所述加载平台上的橡胶密封垫使平台基座与细胞培养板之间行成密封腔,对此密封腔进行真空抽吸时,产生负压,弹性膜被拉伸,从而为细胞提供双轴向应力。在本发明具体实施过程中,优选的包括以下步骤:1)将角膜上皮细胞,用0.25wt%胰酶-0.02wt% EDTA消化后接种于细胞培养板中,贴壁培养,2)将所述细胞培养板安置于加力仪的加载平台上,设定加力参数进行拉伸后收集细胞。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
组织张应力对小鼠角膜新生血管的影响
1.小鼠角膜新生血管模型的建立及组织张应力对角膜新生血管的影响
将12只成年BALB/C小鼠全身麻醉成功后,固定小鼠右眼球,用直径1.5mm的角膜环钻在角膜中央轻压作角膜压痕,将11-0线垂直于压痕放射状缝入角膜基质层,打结,线结暴露,缝合2针。角膜新生血管生长情况及 miR-204表达情况如图1所示,miR-204表达明显降低,新生血管旺盛生长。将小鼠随机分为治疗组和对照组,手术当日、术后3、6天分别结膜下注射 miR-204为治疗组(PBS、NTC为对照组),治疗后观察角膜新生血管生长情况,结果如图2所示建模后10天角膜出现旺盛的新生血管,结膜下注射 miR-204后角膜新生血管明显减少。
2.miR-204对小鼠角膜缝线新生血管模型VEGF-A、VEGFR2表达的影响
取治疗后的BALB/C小鼠眼球,制作石蜡样本,石蜡切片机切取6μm 厚度石蜡组织切片,以免疫组织化学方法检测miR-204对VEGF-A、VEGFR2 的影响。具体包括以下步骤:
1)石蜡切片烤片、脱蜡、乙醇梯度脱水;
2)抗原修复:切片置于抗原修复液(1:100)中,煮3分钟,室温冷却; PBS洗5分钟,晾干;
3)玻片上滴3%H2O2,20分钟;PBS洗3次,5分钟/次;
4)5%BSA封闭1小时;
5)滴加一抗,4℃,过夜;PBS洗3次,5分钟/次;
6)滴一滴增强剂,37℃水浴锅,15分钟;PBS洗3次,5分钟/次;
7)加二抗,37℃,37℃,1小时;PBS洗3次,5分钟/次;
8)DAB显色(1ml H2O+1滴A+1滴B+1滴C),苏木素复染20秒;自来水冲洗30秒;吹干,中性树胶封片;光学显微镜下观察照相。
结果如图3A所示,miR-204治疗组能明显减少角膜中VEGF-A、VEGFR2 的表达。另外收集治疗组和对照组的角膜,提取蛋白,以western blot方法分析VEGF-A、VEGFR2表达情况,具体包括以下步骤:
Western blot方法:
1)蛋白样本提取:2个角膜+60μl RIPA(含1%PMSF),冰上超声粉碎组织;离心,12000转,5分钟;取上清,加4×loading buffer,95℃,5分钟; -80℃冰箱保存。
2)配胶:取分离胶缓冲液和分离胶溶液各2.7ml混匀,加60μl的改良型过硫酸铵溶液,混匀;将溶液注入制胶玻璃板中;待分离胶凝固后,取浓缩胶缓冲液和浓缩胶溶液各0.75ml混匀,加入15μl的改良型过硫酸铵溶液,混匀;注入制胶玻璃板中,***梳齿;
3)电泳:加样10μl/孔;80V,0.5小时;120V,1.5小时。
4)转膜:100mA,冰上2~3小时。
5)封闭,加抗体:5%脱脂奶粉封闭1小时;加一抗+1%脱脂奶粉 (1:1000),4℃轻摇过夜;TBST洗膜,加二抗(1:2000~1:3000)+2.5%脱脂奶粉,室温平摇1小时;TBST洗膜;
6)化学发光:吸取适量的发光液滴至膜上,置于仪器中进行显影。
结果如图3B,miR-204治疗组VEGF-A、VEGFR2表达明显降低,表明 miR-204能抑制角膜新生血管。
实施例2
研究组织张应力对人角膜上皮细胞VEGF表达的影响
以2.4U/ml Dispase(溶于DMEM培养基中)消化角膜环,37℃,2小时;取角膜上皮层,用0.25wt%胰酶+0.02wt%EDTA消化,37℃,15分钟;将原代人角膜上皮细胞用条件培养基重悬,接种于培养板中,为P0代,将 P2-P4代细胞接种于flexcell细胞培养板中(1×105细胞/孔),所述flexcell细胞培养板为弹性6孔细胞培养板,底部的弹性硅胶膜柔韧性好、透明度高;硅胶表面由I型胶原包被,以增加细胞的贴壁能力。
分组:空白对照组,加力+200nmol/l阴性对照(NTC)组,加力+200nmol/l miR-204agomir组;将flexcell细胞培养板安置于加力仪的加载平台上,设定加力参数(拉伸度5%,频率为1Hz),6小时后收集细胞以PCR、western blot方法检测VEGF-A表达结果见图4,如图4所示,周期性张应力刺激引起人角膜上皮细胞中的VEGF表达上升、miR-204低表达,而外源性增加 miR-204后,这种高表达明显被抑制。外源性miR-204对人微血管内皮细胞的迁移和成管的影响结果如图5所示,增加miR-204后细胞的迁移和成管能力都明显下降。
由上述实施例可知,本发明提供的miR204能够显著抑制VEGF-A因子表达,从而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管,抑制新生血管的生成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛大学附属医院
<120> 一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uucccuuugu cauccuaugc cu 22
Claims (8)
1.一种miRNA在制备抑制新生血管生成的试剂中的应用,所述miRNA为miR-204,所述miR-204的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述miR-204抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述miR-204抑制VEGF-A因子表达。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述miR-204抑制由组织张应力诱导的VEGF-A因子的表达。
5.根据权利要求3或4所述的应用,其特征在于,所述miR-204包括miR-204agomir;所述miR-204agomir在所述试剂中的浓度为150~250nmol/L。
6.一种诱导的VEGF-A因子表达的方法,包括以下步骤:将机械力间歇性作用于角膜上皮细胞,所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度为4~6%,所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率为0.8~1.2Hz,所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间为5.5~6.5h。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述机械力作用于角膜上皮细胞的拉伸度为5%,所述机械力作用于角膜上皮细胞的频率为1.9~1.1Hz,所述机械力作用于角膜上皮细胞的时间为5.8~6.3h。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述机械力为组织张应力。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811284351.4A CN109381478A (zh) | 2018-10-31 | 2018-10-31 | 一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811284351.4A CN109381478A (zh) | 2018-10-31 | 2018-10-31 | 一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109381478A true CN109381478A (zh) | 2019-02-26 |
Family
ID=65428078
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811284351.4A Pending CN109381478A (zh) | 2018-10-31 | 2018-10-31 | 一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109381478A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112094808A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-18 | 中山大学中山眼科中心 | 一种包含miR-204的外泌体及其制备方法和应用 |
CN116286628A (zh) * | 2023-05-15 | 2023-06-23 | 四川大学华西医院 | 一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1460024A (zh) * | 1999-07-14 | 2003-12-03 | 诺沃挪第克公司 | FVIIa或组织因子拮抗剂在调节基因表达和细胞迁移或趋化中的应用 |
CN102656153A (zh) * | 2009-10-29 | 2012-09-05 | 韩独药品株式会社 | 新型血管渗漏阻断剂 |
CN108618753A (zh) * | 2017-03-23 | 2018-10-09 | 王继宏 | 一种持续牵张应力刺激修复兔跟腱损伤的方法 |
-
2018
- 2018-10-31 CN CN201811284351.4A patent/CN109381478A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1460024A (zh) * | 1999-07-14 | 2003-12-03 | 诺沃挪第克公司 | FVIIa或组织因子拮抗剂在调节基因表达和细胞迁移或趋化中的应用 |
CN102656153A (zh) * | 2009-10-29 | 2012-09-05 | 韩独药品株式会社 | 新型血管渗漏阻断剂 |
CN108618753A (zh) * | 2017-03-23 | 2018-10-09 | 王继宏 | 一种持续牵张应力刺激修复兔跟腱损伤的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JOEL D. BOERCKELA ET AL: "Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo", 《PNAS》 * |
XIAOPING ZHANG ET AL.: "Epithelium-derived miR-204 inhibits corneal neovascularization", 《EXPERIMENTAL EYE RESEARCH》 * |
YAN ZHAO ET AL: "miRNA-directed regulation of VEGF in tilapia under hypoxia condition", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
张卫兵等: "机械张应力对兔腭中缝血管内皮生长因子mRNA 表达的影响", 《口腔医学》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112094808A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-18 | 中山大学中山眼科中心 | 一种包含miR-204的外泌体及其制备方法和应用 |
CN116286628A (zh) * | 2023-05-15 | 2023-06-23 | 四川大学华西医院 | 一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fields et al. | Interactions of the choroid, Bruch's membrane, retinal pigment epithelium, and neurosensory retina collaborate to form the outer blood-retinal-barrier | |
CN105483081B (zh) | miRNA145-5p修饰脐带间充质干细胞分泌的外泌体及其制备与应用 | |
Koizumi et al. | Cultivated corneal endothelial cell sheet transplantation in a primate model | |
CN104263697B (zh) | 一种诱导培养基及诱导人脂肪间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的方法 | |
Hitani et al. | Transplantation of a sheet of human corneal endothelial cell in a rabbit model | |
CN102712900A (zh) | 干细胞分化成为视网膜细胞的方法 | |
CZ2004694A3 (cs) | Buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně pro opravu korneálních a intraorbitálních defektů a použití těchto buněk | |
Wan et al. | Cell delivery with fixed amniotic membrane reconstructs corneal epithelium in rabbits with limbal stem cell deficiency | |
JP2006187281A (ja) | ヒト角膜内皮細胞由来の前駆細胞、細胞凝集体及びそれら作製方法、並びに前駆細胞および細胞凝集体の移植方法 | |
CN108057116A (zh) | 干细胞组合物在皮肤损伤治疗药物中的应用 | |
CN107073041A (zh) | 糖尿病性皮肤溃疡治疗的多功能性干细胞 | |
Huang et al. | Rat epidermal stem cells promote the angiogenesis of full-thickness wounds | |
CN109381478A (zh) | 一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用 | |
CN105874060A (zh) | 间皮细胞在组织生物工程和人造组织中的用途 | |
CN109998992B (zh) | 治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法 | |
JP5305066B2 (ja) | 組織幹細胞/組織前駆細胞からの角膜内皮細胞の生成方法 | |
CN104450606B (zh) | 汗腺细胞诱导培养基及其应用 | |
CN102552979B (zh) | 一种角膜板层材料的制备方法 | |
Revoltella et al. | Epithelial stem cells of the eye surface | |
Zhang et al. | Spontaneous evolution of human skin fibroblasts into wound-healing keratinocyte-like cells | |
CN108066750A (zh) | 干细胞及其分泌物用于治疗皮肤烧烫伤的新用途 | |
CN108601810A (zh) | 用于修复心脏组织的心外膜衍生的旁分泌因子 | |
CN116426469B (zh) | LAP2α在间充质干细胞成脂向分化中的应用 | |
Li et al. | Effect of porcine corneal stromal extract on keratocytes from SMILE‐derived lenticules | |
CN105087466B (zh) | 诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190226 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |