CN107723257A - 一种动物双歧杆菌及其食品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物菌类，具体地涉及一种对胃酸具有良好耐受性的动物双歧杆菌。该动物双歧杆菌CG‑B1于2016年09月05日，申请中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。保藏号：CGMCCNo.12943。本发明产品来源百岁健康老人肠道。经动物试验证明，可以促进便秘小鼠肠道蠕动速度，缓解小鼠便秘症状。可以显著缓解小鼠溃疡性结肠炎，降低肠道炎症水平，降低血清炎症因子，通过提高肠道紧密连接蛋白表达，提高肠道屏障完整性，对Ⅱ型糖尿病有预防和改善作用。适用于食品、药品和/或保健品中。

Description

一种动物双歧杆菌及其食品组合物

技术领域

本发明属于食品科学技术领域，具体属于微生物领域，主要涉及一种动物双歧杆菌菌株及食品组合物。

背景技术

糖代谢是人体代谢的一个重要方面，它在维持人体能量代谢中起着重要的作用，如今糖代谢紊乱及其相关的慢性病已成为一个世界性的难题，Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的高发已被列为癌症之后的第二号杀手。Ⅰ型糖尿病是由于分泌胰岛素的β细胞被直接破坏而导致胰岛素分泌不足引起的，Ⅱ型糖尿病则是因为在长期的胰岛素抵抗过程中，胰岛素失去敏感性而诱发的。Ⅱ型糖尿病属于慢性代谢性疾病，在糖尿病患者中，占了觉得多数，所占比例约为95％。

动物双歧杆菌(Bifidobacterium)也称乳双歧杆菌，是人和许多哺乳动物肠道中的优势菌之一。在微生态学上属于菌群。1899年法国巴斯德研究院的蒂瑟尔(Tissier)首次从母乳喂养的婴儿大便中分离到了该菌，并指出它对乳儿的营养和预防肠道疾病具有重要作用。该菌是人和动物肠道中重要的生理性细菌。参与免疫、营养、消化和保护等一系列的生理过程，发挥着重要的功能。

很多研究证明，动物双歧杆菌有改善肠道菌群，提高免疫力，减轻炎症的功效，还有一些研究表明，动物双歧杆菌还有降低血糖的效果，研究发现在饮食中补充动物双歧杆菌可对葡萄糖耐受性产生积极的影响。还可以改善葡萄糖耐受性，还有降低模型大鼠血糖的作用。

发明内容

本发明的目的是获得一种来源健康人群肠道，对Ⅱ型糖尿病有预防和改善作用的动物双歧杆菌CG-B1。

本发明的第一方面，提供了一种双歧杆菌。在一优先例中，它是动物双歧杆菌CG-B1，保藏号：CGMCCNo.12943。保藏日期：2016年09月05日。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地点：中国，北京，中国科学院微生物研究所。

在另一优选例中，所述动物双歧杆菌对胃酸具有良好的耐受性。

本发明的第二方面，提供了本发明所述的动物双歧杆菌的用途，它被用于制备组合物，所述的组合物对Ⅱ型糖尿病动物有预防和改善作用。

上述组合物包括奶粉100-112.5kg或鲜奶800-900kg、乳清蛋白粉0-8kg，稳定剂0-5kg、发酵剂100-200DUC、CG-B1菌种100-200DUC、白砂糖70-80kg、水1吨。

本发明的动物双歧杆菌菌株可以促进便秘小鼠肠道蠕动速度，缓解小鼠便秘症状。

本发明的动物双歧杆菌菌株可以显著缓解小鼠溃疡性结肠炎，降低肠道炎症水平，降低血清炎症因子，通过提高肠道紧密连接蛋白表达，提高肠道屏障完整性。

附图说明

图1为本发明实施例2动物双歧杆菌CG-B1对胃酸的耐受性实验柱状图；

图2为本发明实施例3动物双歧杆菌CG-B1对各组大鼠空腹血糖的影响线性图；

图3为本发明实施例3动物双歧杆菌CG-B1对各组大鼠餐后2h血糖的影响线性图；

图4为本发明实施例4造模成功时各组大鼠口服葡萄糖糖耐量曲线图；

图5为本发明实施例4造模成功时各组大鼠口服葡萄糖糖耐量曲线下面积图；

图6为本发明实施例5动物双歧杆菌CG-B1对各组大鼠口服葡萄糖改善糖耐量曲线图；

图7为本发明实施例5动物双歧杆菌CG-B1对各组大鼠口服葡萄糖改善糖耐量曲线下面积图；

图8为本发明实施例6动物双歧杆菌CG-B1对各组大鼠糖化血红蛋白的影响柱状图。

其中：+<0.05正常组，＊<0.05对照组

具体实施方式

本发明人经多次筛选和培育，从百岁老人粪便中分离得到一株动物双歧杆菌菌株CG-B1，该菌株对胃酸具有良好的耐受性。经动物试验证明，可以促进便秘小鼠肠道蠕动速度，缓解小鼠便秘症状。可以显著缓解小鼠溃疡性结肠炎，降低肠道炎症水平，降低血清炎症因子，通过提高肠道紧密连接蛋白表达，提高肠道屏障完整性。

动物双歧杆菌CG-B1于2016年09月05日，申请中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。保藏号：CGMCCNo.12943。

文中所用“本发明双歧杆菌”指动物双歧杆菌CG-B1，保藏号：CGMCCNo.12943。应理解这些术语还包括衍生自动物双歧杆菌CG-B1菌株，尤其是对胃酸具有良好耐受性特性的衍生菌株。

动物双歧杆菌CG-B1的基本生物学特性与已知的该种属的典型微生物基本相同，其属于动物双歧杆菌乳酸亚种，革兰氏阳性，杆状，形态不规则，无牙雹，严格厌氧菌，不同点在于本发明微生物菌株对胃酸具有良好耐受性特性，可以促进便秘小鼠肠道蠕动速度，缓解小鼠便秘症状。可以显著缓解小鼠溃疡性结肠炎，降低肠道炎症水平，降低血清炎症因子，通过提高肠道紧密连接蛋白表达，提高肠道屏障完整性。

具体而言，耐酸性能试验证明，本发明的动物双歧杆菌CG-B1在PH2.5条件下处理3小时，活菌数不发生显著变化。

动物试验证明，在给予糖尿病大鼠4周CG-B1后，空腹血糖和餐后2h血糖水平无明显降低，但口服葡萄糖糖耐量曲线以及曲线下面积表明CGB1可以显著降低糖尿病大鼠90min和 120min的血糖值并且能够显著改善糖耐量。同时CG-B1能够明显改善Ⅱ型糖尿病大鼠体重减轻的症状且各剂量组间呈现剂量依赖效应。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

2007年从健康百岁老人肠道分离获得动物双歧杆菌CG-B1。

分离方法：收集老人粪便后置于厌氧稀释液于4℃保存，2小时内完成菌株分离。利用 NPNL琼脂培养基37℃厌氧培养48小时，分离双歧杆菌菌株。

鉴定方法：挑取疑似菌落进行革兰氏染色，于1000×油镜观察，菌株呈现G+，不产芽孢，形状呈短杆或不规则形状。将菌落利用MRS培养基厌氧增菌，利用细菌基因组提取试剂盒提取菌株总DNA，利用细菌16s rDNA通用引物扩增菌株16s rDNA全长，将PCR产物纯化后，送至测序公司进行序列分析，将序列结果利用NCBI数据库Blast程序进行检索，鉴定为Bifidobacterium animalis subsp.lactis，命名为CG-B1。

动物双歧杆菌CG-B1的生理生化特性：

动物双歧杆菌CG-B1的基本生物学特性与已知的该种属的典型微生物基本相同，其属于动物双歧杆菌乳酸亚种，革兰氏阳性，杆状，形态不规则，无牙雹，严格厌氧菌。

实施例2

动物双歧杆菌CG-B1对胃酸的耐受性

在图1中可以看出，在PH2.5条件下处理3小时，活菌数不发生显著变化。

实施例3

CG-B1对空腹血糖及餐后2h血糖的影响

(a)试验材料

受试菌株：Bifidobacterium animalis subsp.lactisCG-B1(CGMCC No.12943)，由深圳市晨光乳业有限公司保藏。

菌数测定：将CG-B1菌株培养12h的菌液用灭菌生理盐水进行梯度稀释，以平板倾注法， MRS固体培养基，37℃厌氧培养48h，测定菌液的活菌数为1.0×10⁹CFU/mL。

菌株处理：将CG-B1从甘油管中以1.0×10⁷CFU/mL的接种量接种到MRS液体培养基，活化至第三代，37℃厌氧培养12h，培养结束后4000g离心15min，收集菌体。收获的菌体以PBS洗涤两次并重悬于生理盐水中，获得活菌悬液。使用时，菌悬液调整到实验所需浓度。

实验动物

SPF级雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重240±10g，6～8周龄。大鼠饲养于中国农业大学转基因生物食用安全监督检验测试中心SPF级动物房中，动物合格证号：SCXK(京)2012–0001。

(b)实验指标与检测方法

(1)空腹血糖值(Fasting blood glucose，FBG)及餐后2h血糖值(Postprandial2h blood glucose，PBG)的测定

每周一次，各组大鼠禁食不禁水12h，以血糖仪测定尾静脉血糖值，为空腹血糖值；测定空腹血糖后给予相应饲料，给予饲料2h后，再次以血糖仪测定尾静脉血糖值，为餐后2h血糖值。

(2)口服葡萄糖耐量(OGTT)测定

在造模判断后第一天与处死大鼠前三天进行。各组大鼠禁食不禁水12h，按2g/kg体重灌胃50％(w/v)的葡萄糖溶液，并分别测定0min、15min、30min、60min、90min、 120min鼠尾静脉血糖值。绘制血糖变化曲线，并计算出糖耐量曲线下面积(Area Under Curve，AUC)。

(3)血液标本的留取

第二次OGTT试验后第三天，禁食不禁水12h，***麻醉，内眦静脉取血，血样分别置于5mL EDTA抗凝管和1.5mL肝素钠抗凝管中，EDTA抗凝管中的血样用于测定糖化血红蛋白，1.5mL肝素钠抗凝管中的血样3000g离心10min分离血浆，-80℃冰箱内保存待测。

(4)糖化血红蛋白测定

将保存在EDTA抗凝管中的血样送至北京中同蓝博临床检验所有限公司使用生化分析仪测定。

(c)数据及统计分析

所有实验数据结果以平均数±标准差(Mean±SD)的形式表示。组间数据显著性差异采用统计软件SPSS 20.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，以p<0.05或p<0.01表示差异具有统计学意义。

自饲喂高脂饲料开始至治疗四周后处死，正常组、模型组、CG-B1各剂量组大鼠血糖水 平变化情况如图2和图3所示。

由图2可以看出，在高脂饲料饲喂期间，各组大鼠空腹血糖均无明显变化；STZ诱导成模两周内，所有造模组大鼠空腹血糖均显著增高(p<0.01)，这是因为高糖高脂饮食诱导四周时虽然大鼠的外周组织出现了胰岛素抵抗，但此时代偿性高胰岛素血症抑制了血糖上升；注射STZ后，由于STZ对大鼠胰岛β细胞的选择性杀伤作用，影响了胰岛素的分泌，故造模组大鼠表现出空腹血糖明显上升。模型组和CGB1低剂量组在造模后空腹血糖变化平稳，无明显波动。CGB1中、高剂量组的变化趋势相同，在造模后第三周开始下降，到实验结束时，CGB1 中、高治疗组大鼠空腹血糖分别为18.6±1.2mmol/L和18.7±0.9mmol/L，均低于模型组大鼠空腹血糖20.1±1.0mmol/L，但无显著差异(p>0.05)。

由图3可以看出，模型组和CG-B1各剂量组大鼠餐后2h血糖水平变化趋势相同，无明 显波动(p>0.05)，说明益生菌CG-B1对治疗糖尿病大鼠餐后2h血糖无明显作用。

实施例4

CG-B1对口服葡萄糖耐受量的影响

造模成功时各组大鼠糖耐量

造模成功后各组大鼠糖耐量情况如图4和图5所示。

由图4和图5可以看出，在灌胃葡萄糖后的15～30min内，各组大鼠血糖均呈上升趋势， 正常组大鼠表现出正常的耐糖现象，正常组大鼠的血糖在0～30min内上升幅度平缓，在30min 后逐渐降低，2h后回到空腹水平；其余各组大鼠的血糖在30min内显著上升(p<0.01)， 均在30min时达到最高峰，血糖在30min后逐渐降低，2h后血糖水平依然较高。此外，曲线下面积统计结果显示，模型组和CGB1各剂量治疗组AUC显著高于正常组(p<0.01)，说明造模组大鼠均出现严重糖耐量受损的情况(p<0.01)，符合Ⅱ型糖尿病糖耐量降低的特征。 同时，模型组和CGB1各剂量组大鼠糖耐量曲线变化趋势相同，组间无显著性差异(p>0.05)。 表明造模成功时，所有大鼠发病程度相当。

实施例5

CG-B1对大鼠糖耐量的改善作用

图6和图7为处死大鼠前，各组大鼠糖耐受性的比较。

如图6和图7所示，模型组和CG-B1各剂量组口服糖耐量曲线峰值(30min)均显著高于 正常组，表明仍存在明显的糖耐量受损。CG-B1低、中剂量组与模型组口服糖耐量曲线峰值 (30min)差异不显著。CG-B1高剂量组口服糖耐量曲线峰值(30min)为31.5±1.0mmol/L，低于模型组32.7±1.1mmol/L，但无显著性差异。CGB1高剂量组口服糖耐量曲线90min 和120min的血糖值显著低于模型组(p<0.05)。曲线下面积统计结果显示，模型组AUC显 著大于正常组AUC(p<0.01)，CGB1低、中剂量组AUC与模型组AUC差异不显著(p>0.05)， CGB1高剂量组AUC显著低于模型组AUC(p<0.01)。

实施例6

CG-B1对糖化血红蛋白的影响

糖化血红蛋白(HbA1c)是诊断糖尿病最重要的指标之一，糖化血红蛋白红细胞内的血红 蛋白与血糖结合的产物，该反应不可逆，并与血糖浓度成正比，且可稳定保持120天左右， 故糖化血红蛋白可以反映3个月以内的血糖情况。各组大鼠糖化血红蛋白水平变化情况如附 图8所示。

如图8所示，模型组和CG-B1各剂量组HbA1c水平均显著高于正常组(p<0.01)。与模型组比较，CG-B1各剂量组血浆HbA1c水平有所降低且存在组间剂量效应，但差异不显著。

实施例7

含有动物双歧杆菌CG-B1的食品组合物

1、配方：

鲜奶110kg、白砂糖75kg、稳定剂3kg、乳清蛋白粉5kg、发酵剂100DCU、CG-B1菌种150DUC、水1吨。

2、生产工艺步骤说明：

(1)、接好管道，抽鲜奶并升温60-80℃；

(2)、将白糖、稳定剂等加入奶中，搅拌均匀后，通知化验人员检测；

(3)、消毒设备清洗后用热水循环消毒，保证设备处于无菌状态，再用冰水冷却；

(4)、将原料预热至70℃左右后均质，均质压力200bar；

(5)、均质后的物料经95℃保持300s消毒后，过冷排，冷却至40-45℃后过奶至缓冲缸；

(6)、用无菌水溶解菌种后，进行接种，搅拌10-15min后，过热排使奶温升至40～45℃进行灌装；

(7)、灌装好后经42～44℃保温，约5小时左右发酵，经化验合格后，推入冷库冷藏。

Claims (3)

1.一种动物双歧杆菌，其特征在于：它是动物双歧杆菌乳亚种CG-B1，保藏号：CGMCCNo.12943。保藏日期：2016年09月05日。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的一种动物双歧杆菌，其特征在于：所述动物双歧杆菌对胃酸具有良好的耐受性。

3.一种含有权利要求1所述动物双歧杆菌的食品组合物，其特征在于：包括奶粉100-112.5kg或鲜奶800-900kg、白砂糖70-80kg、乳清蛋白粉0-8kg，稳定剂0-5kg、发酵剂100-200DUC、CG-B1菌种100-200DUC、水1吨。