CN112029676B - 一种有利于提高免疫力的益生菌组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了有利于提高免疫力的益生菌组合物，该组合物包含鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01，鼠李糖乳杆菌NJ551菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016157，凝结芽孢杆菌BC01菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017813。本发明的这种益生菌组合物在较少摄入量的情况下就可以实现或者超越单菌在较大摄入量时才能实现的对小鼠肠道黏膜通透性、NK细胞杀伤率以及血清γ‑干扰素（IFN‑γ）、TNF‑α含量的恢复或者提高效果。本发明的益生菌组合物有助于提高免疫力。

Description

一种有利于提高免疫力的益生菌组合及其应用
技术领域
本发明属于微生物，特别涉及益生菌组合物。
背景技术
免疫力是人体抵抗疾病和维护自身健康的能力。而在人体内执行这一功能的是免疫***。免疫***包括免疫器官、免疫组织、免疫分子，它们交互作用构成了一张巨大的身体防御网络。尽管人类对免疫***还未完全掌握理解，但现有的知识已经证明了人体有70％的免疫细胞聚集于肠道，而免疫***的发育与肠道菌群息息相关。
在人体的肠道黏膜上，栖居着上千种数量达到1000亿的肠道菌群。这些肠道菌群与人体的黏膜免疫***达到了一个动态的平衡，一方面人体的黏膜***调整和维护着肠道菌群的数量和种类，另一方面肠道菌群也在“训练”我们的免疫***，帮助我们的免疫***成熟。
正常的肠道菌群对免疫***的影响至少可以体现在3个方面：(1)刺激肠道上皮细胞分泌黏液，加强黏膜层厚度；(2)参与肠道上皮细胞间的机械锁紧机制，维护肠道黏膜的通透性，避免病原体通过肠道黏膜入侵人体；(3)与肠道黏膜免疫***的免疫细胞交流，提高免疫细胞的活力。而如果免疫***受损，它也可能反过来影响肠道上皮细胞的通透性，黏膜的厚度以及最终影响到肠道菌群的组成[1]。肠道黏膜免疫***与肠道菌群的相互作用是维护身体抗感染和自身健康的第一道防线。
[1]Josie Libertucci and Vincent B.Yong.The role of the microbiota ininfectious disease.Nature microbiology,2019,vol4:35-45
因此，通过益生菌干预肠道菌群组成来达到提高免疫力(包括提高肠道黏膜***的机械屏障)是一个现实可行的方法。而这种干预的效果取决于具体的益生菌菌株[2]，同一菌种的不同菌株对于免疫力可能有着完全不同的效果。筛选能够提高肠粘膜屏障作用和免疫响应的菌株及建立其对免疫力影响的评价方法对利用益生菌干预提高免疫力具有重要的意义。
[2]Cai,M.,Jolley etc.Animal studies on enhancement of immune functionby dietary probiotic supplementation of Lactobacillus acidophilus NCFM andBifidobaterium latics Bi-07.Chinese Journal of Microbiology,2008,20，(1):17-19
现在已经有一些专利已经申请或者正在申请与免疫相关的益生菌运用，比如专利申请号01816819.1等。但这些专利主要是利用过敏模型来评估益生菌干预的效果，对利用免疫抑制模型来评估益生菌干预较少，而且几乎没有评估益生菌对肠道黏膜的通透性的影响。而且这些专利在形成菌株组合物的时候，并没有评估组合物和单菌单独效果的对比。
发明内容
为了解决上述存在的问题本发明提供了有利于提高免疫力的益生菌组合物，该有利于提高免疫力的益生菌组合物包含鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01，鼠李糖乳杆菌NJ551菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016157，凝结芽孢杆菌BC01菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017813。
本发明的鼠李糖乳杆菌NJ551具有如下特性：
1在人工胃液中处理6小时存活率大于50％，在人工小肠液中处理1小时存活率大于26％。
2在免疫抑制小鼠模型中能有效恢复或者提高小鼠肠道黏膜通透性、NK细胞杀伤率以及血清γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(本发明中指TNF-α)含量。
3由此菌株所制备的冻干粉，37℃破坏10天存活率大于50％，-18℃保存12个月存活率＞90％。
本发明的凝结芽孢杆菌BC01具有如下特性：
1在人工胃液中处理6小时存活率大于75％，在人工小肠液中处理4小时存活率大于82％，连续通过人工胃液处理3小时和人工小肠液处理3小时存活率大于63％。
2由此菌株制备的冻干粉(或者喷干粉)37℃破坏10天存活率大于98％，常温保存18个月存活率大于98％。
3在其生命周期中存在营养态和芽孢态两种生命形态。
4体外试验证实其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌效果。
5在免疫抑制小鼠模型中能有效恢复或者提高小鼠肠道黏膜通透性、NK细胞杀伤率以及血清γ-干扰素(IFN-γ)、TNF-α含量。
本发明还提供了由鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01组成的益生菌组合物，这种益生菌组合物在较少摄入量的情况下就可以实现或者超越单菌在较大摄入量时才能实现的对小鼠肠道黏膜通透性、NK细胞杀伤率以及血清γ-干扰素(IFN-γ)、TNF-α含量的恢复或者提高效果。
根据本发明技术的一方面，提供了有利于提高免疫力的益生菌组合物中鼠李糖乳杆菌NJ551具有如下特性：
在人工胃液中处理6小时存活率大于50％，在人工小肠液中处理1小时存活率大于26％；
在免疫抑制小鼠模型中能有效恢复或者提高小鼠肠道黏膜通透性、NK细胞杀伤率以及血清γ-干扰素(IFN-γ)、TNF-α含量；
由此菌株所制备的冻干粉，37℃破坏10天存活率大于50％，-18℃保存12个月存活率＞90％；
凝结芽孢杆菌BC01具有如下特性：
在人工胃液中处理6小时存活率大于75％，在人工小肠液中处理4小时存活率大于82％，连续通过人工胃液处理3小时和人工小肠液处理3小时存活率大于63％：
由此菌株制备的冻干粉或者喷干粉37℃破坏10天存活率大于98％，常温保存18个月存活率大于98％；
在其生命周期中存在营养态和芽孢态两种生命形态；
体外试验证实其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌效果；
在免疫抑制小鼠模型中能有效恢复或者提高小鼠肠道黏膜通透性、NK细胞杀伤率以及血清γ-干扰素(IFN-γ)、TNF-α含量。
根据本发明技术的一方面，提供了有利于提高免疫力的益生菌组合物，上述益生菌组合物中鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01可以单独保存或混合后保存。
根据本发明技术的一方面，提供了有利于提高免疫力的益生菌组合物，有利于提高免疫力的益生菌组合物为含有鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01的混合物，本发明提供的一种益生菌组合物，组合物可以以粉末或者液体的形式提供。这种组合物可以有效提高摄入者的免疫力。该组合物里活菌浓度(用量)可以按满足摄入者按照体重计算，一种优选的方案为：鼠李糖乳杆菌NJ551单菌的摄入浓度(用量)：2.0*105CFU/克(体重)/天；凝结芽孢杆菌BC01单菌的摄入浓度(用量)：6.0*104CFU/克(体重)/天。实际摄入的时候可以根据自身敏感性在合理范围内调整。
根据本发明技术的一方面，提供了一种提高免疫力的益生菌组合方法，该提高免疫力的益生菌组合方法为将鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01组合使用，鼠李糖乳杆菌NJ551，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016157，凝结芽孢杆菌BC01，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017813。
根据本发明技术的一方面，提供了一种鼠李糖乳杆菌NJ551的制备方法，将内蒙古奶酪按1％接种量接种到10％脱脂乳培养基中于37℃培养，待其凝乳后进行10倍梯度稀释，依次稀释至10-8梯度。选择4个适宜稀释度分别取1mL按照倾注法与MRS固体培养基混合倒平板。37℃厌氧罐培养48h，观测菌落形态，挑选不同形态的菌落再次在MRS固体培养基上划线分离，如此重复划线分离3代，得到纯化后的菌株用革兰氏染色法和显微镜观测，挑选出革兰氏染色阳性，显微镜观测呈球状、杆状、多形状的菌株；用MRS培养基将这8株菌厌氧增殖扩培，然后收集菌泥做16s rDNA测试，挑选出鼠李糖乳杆菌NJ551，该鼠李糖乳杆菌NJ551菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016157。该方法亦可作为筛选方法。
根据本发明技术的一方面，提供了一种鼠李糖乳杆菌NJ551，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016157。
根据本发明技术的一方面，提供了一种上述鼠李糖乳杆菌NJ551的应用，上述鼠李糖乳杆菌NJ551应用于制备有利于提高免疫力的益生菌组合物中。
根据本发明技术的一方面，提供了上述有利于提高免疫力的益生菌组合物的制备方法，上述有利于提高免疫力的益生菌组合物包含上述的鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01，上述鼠李糖乳杆菌NJ551菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016157，上述凝结芽孢杆菌BC01菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017813，上述有利于提高免疫力的益生菌组合物的制备方法包含如下步骤：
利用上述鼠李糖乳杆菌NJ551的冻干粉和上述凝结芽孢杆菌BC01的活菌粉，稀释成含凝结芽孢杆菌BC01和鼠李糖乳杆菌NJ551的混合菌液。上述两种菌可以干粉冲饮，也可以加到液体饮料里一起，也可以用于发酵后饮用。
根据本发明技术的一方面，提供了上述有利于提高免疫力的益生菌组合物的应用，上述有利于提高免疫力的益生菌组合物应用于制备提高免疫力的药品、食品或保健品中。该应用中涉及的鼠李糖乳杆菌NJ551菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016157，涉及的凝结芽孢杆菌BC01菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017813，其中含量只要能提供鼠李糖乳杆菌NJ551 2.0*105CFU/克(体重)/天；凝结芽孢杆菌BC01单菌6.0*104CFU/克(体重)/天的摄入量即可。
本发明涉及的两种菌优选的摄入量为每天鼠李糖乳杆菌NJ551 2.0*105CFU/克(体重)/天；凝结芽孢杆菌BC01单菌6.0*104CFU/克(体重)/天。
本发明提供了由鼠李糖乳杆菌和凝结芽孢杆菌构成的益生菌组合物，该益生菌组合物物可以有效加强肠道黏膜屏障，提高NK细胞杀伤率以及血清IFN-γ、TNF-α的含量。而且与单菌相比，这种组合物仅需较少的剂量就可以实现或者超越单菌较大剂量才能达到的效果，体现了良好的协同作用。
本发明还提供了上述益生菌组合物的筛选和制备方法及其应用。
附图说明
图1.为本发明其中一个实施例中鼠李糖乳杆菌NJ551的显微镜图片；
图2.为本发明其中一个实施例中鼠李糖乳杆菌NJ551在人工胃酸和人工小肠液中的耐受性；
图3.为本发明其中一个实施例中鼠李糖乳杆菌NJ551的存储期活菌保存能力；
图4.为本发明其中一个实施例中凝结芽孢杆菌BC01的营养体形态；
图5.为本发明其中一个实施例中凝结芽孢杆菌BC01的芽孢态形态；
图6.为本发明其中一个实施例中结芽孢杆菌BC01在人工胃液和小肠液中的存活率；
图7.为本发明其中一个实施例中凝结芽孢杆菌BC01的储存期稳定性。
图8.为本发明其中一个实施例中凝结芽孢杆菌BC01对金黄色葡萄球菌的抑制作用；
图9.为本发明其中一个实施例中乳果糖与甘露醇标准品在高效液相色谱上的保留时间。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1鼠李糖乳杆菌NJ551的分离鉴定及冻干粉制备
1、试验材料：
来源于3份内蒙古天然发酵奶酪以及四川农家自然发酵泡菜老坛发酵液
2、分离方法：
2.1分别将3份内蒙古奶酪按1％接种量接种到10％脱脂乳培养基中于37℃培养，待其凝乳后进行10倍梯度稀释，依次稀释至10-8梯度。选择4个适宜稀释度分别取1mL按照倾注法与MRS固体培养基混合倒平板。37℃厌氧罐培养48h，仔细观测菌落形态，挑选不同形态的菌落再次在MRS固体培养基上划线分离，如此重复划线分离3代，得到纯化后的菌株用革兰氏染色法和显微镜观测，挑选出革兰氏染色阳性，显微镜观测呈球状、杆状、多形状的菌株。
2.2按照2.1的方法共挑选出的8株菌株，利用MRS培养基将这8株菌厌氧增殖扩培，然后收集菌泥做16s rDNA测试。经过测试挑选出3株植物乳杆菌、2株鼠李糖乳杆菌、1株双歧杆菌、1株耐久肠球菌、1株乳酸片球菌。根据***《可用于食品的益生菌种名单》的规定，将挑选出的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌和乳酸片球菌留下做进一步测试。耐久肠球菌作为菌株保藏，但不使用。
2.3将2.2挑选的菌株进行进一步的研究发现鼠李糖乳杆菌的发酵液离心无法形成结实的菌泥沉淀，菌泥松散，表明其胞外多糖产生较多。查阅文献发现多篇文献表明胞外多糖产生较多的菌株可能有较强的调节免疫力作用，因此采用负染色发对三种菌(植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、和双歧杆菌)进行负染色，发现鼠李糖乳杆菌的荚膜染色最厚，同时利用鼠李糖发酵的酸奶冰箱冷藏保存15天而不变质，因此选择鼠李糖乳杆菌进行下一步试验。并将此鼠李糖乳杆菌命名为鼠李糖乳杆菌NJ551。该鼠李糖乳杆菌NJ551菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016157
3、鼠李糖乳杆菌NJ551的冻干粉制备
3.1将鼠李糖乳杆菌NJ551在MRS培养基按2.5％的接种量，37℃逐级放大增殖。最后离心发酵液，收集菌泥，菌泥与冻干保护剂混合，真空冷冻干燥可以得到鼠李糖乳杆菌NJ551的冻干活菌粉。对冻干活菌粉计数，以备需要的时候稀释使用。
3.2上述MRS培养基的配方为：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母膏5克、磷酸氢二氨2克、葡萄糖20克、吐温-80 1.0mL、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.25克、蒸馏水1000mL、pH6.2～6.5；MRS固体培养基：在MRS培养基的基础上加入18克琼脂；以上培养基在使用前均高温灭菌。
实施例2鼠李糖乳杆菌NJ551的生理生化特性
1、***、呈短杆(0.5～1.2μm X 3.0～10.0μm)，不同的营养条件下性状有所不同、在显微镜条件下观测主要呈链状、交叉排列(图1)。
如图1所示：鼠李糖乳杆菌NJ551的显微镜图片。
2、在人工胃酸和人工小肠液中的耐受性
鼠李糖乳杆菌NJ551具有良好的耐人工胃酸和人工小肠液的特性，在37℃pH3.0的人工胃液中2h存活率大于75％，6h存活率大于50％；在37℃pH7.0的人工小肠液中1h存活率大于26％，2h存活率大于13％(见图2)。体现了较强的活着到达结肠的潜能。
3、鼠李糖乳杆菌NJ551冻干粉的存储期活菌保
通过加速破坏试验和-18℃冰箱冷冻保存试验的结果表明，鼠李糖乳杆菌NJ551在-18℃环境中能稳定保存其活菌，在-18℃环境下保存12个月活菌数存活率＞90％(图3)。有利于对其进行的进一步研究。
如图3所示：鼠李糖乳杆菌NJ551的存储期活菌保存能力
实施例3凝结芽孢杆菌BC01
凝结芽孢杆菌BC01的活菌制剂制备
1.采集可能含有凝结芽孢杆菌的样本，样本来源于土壤、发酵食品、植物、人体肠道等，然后将样本置于灭菌后的无菌瓶中，然后采取如下两种方法获得纯种菌株：
1.1获得纯种菌株方法1：在无菌瓶中加入含菌样品和100mL无菌生理盐水制备成含菌原液，然后将原液梯度稀释101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍。将上述原液和各稀释倍数的稀释液涂布于凝结芽孢杆菌富集固体培养基上，在恒温箱中40℃培养48小时，挑选分离充分、长势良好的单菌落再次接种于凝结芽孢杆菌富集液体培养基上，在摇床中以220rpm的转速40℃培养24小时。将液体培养基以10000rpm的转速离心，收集菌泥进行16S rDNA分析，通过NCBI比对后鉴定出凝结芽孢杆菌，再对纯种进行保藏进行进一步的生理生化、耐抗生素、耐胃酸小肠液等试验分析。
1.2获得纯种菌株方法2：在无菌瓶中加入含菌样品(四川豆瓣酱)和100mL无菌生理盐水制备成含菌原液，直接将含菌原液接种于凝结芽孢杆菌富集液体培养基中，在摇床上以220rpm的转速40℃培养48小时。然后将液体培养液80℃处理20分钟，再将液体培养液涂布于凝结芽孢杆菌富集固体培养基中，挑选充分分离，长势良好的菌落接种进凝结芽孢杆菌富集固体培养斜面在恒温箱中40℃培养48小时。将获得的菌泥先进行16S rDNA分析，通过NCBI比对后鉴定出凝结芽孢杆菌，再对纯种进行保藏进行进一步的生理生化、耐抗生素、耐胃酸小肠液等试验分析。
2.凝结芽孢杆菌富集液体培养基的组成为(g/L)：玉米淀粉10，牛肉膏10，酵母粉OXIDE 5，氯化钠5。用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸调PH值6.0-6.2(固体培养基在此基础上添加2％的琼脂)
3.获得凝结芽孢杆菌的纯种以后，再利用发酵罐扩增培养，通过发酵过程调控手段待发酵液中凝结芽孢杆菌的OD600大于45，芽孢率大于80％以后，10000rpm离心，收集菌泥，将收集到的菌泥以生理盐水适当稀释后利用喷雾干燥、沸腾床干燥以及真空干燥等方法获得凝结芽孢杆菌的活菌粉，检测活菌粉的芽孢率以及活菌含量，添加适量的麦芽糊精、低聚异麦芽糖等辅料将凝结芽孢杆菌活菌粉制备成不同活菌浓度的制剂。
4.凝结芽孢杆菌的扩增培养基(g/L)为：葡萄糖5，玉米淀粉10，牛肉膏10，酵母粉OXIDE 5，硫酸镁·7H2O 0.4，硫酸锰·1H2O 0.1，硫酸亚铁·7H2O 0.1，氯化钠5。
5.凝结芽孢杆菌的扩增培养条件为：发酵温度40℃，转速300rpm，DO＞80％，pH5.6-6.0。
本发明提供的凝结芽孢杆菌BC01保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017813。菌株来源于四川豆瓣酱。
本发明的凝结芽孢杆菌BC01细菌呈细长杆状、革兰氏染色阳性、芽孢端生，芽孢态犹如小“羽毛球拍”，有的芽孢会脱落。
平板形态：乳白色菌落、边缘整齐，大小约2-4mm。
本发明的凝结芽孢杆菌BC01具备如下特征：
1、凝结芽孢杆菌BC01的生理生化鉴定结果如下(表1)：
Figure BDA0002443657340000081
表1：凝结芽孢杆菌的生理生化鉴定结果。“+”：阳性，“-”：阴性
该菌株可以制成活菌冻干粉(或者喷干粉)。
本发明的凝结芽孢杆菌BC01菌株的16SrDNA鉴定Sanger测序显示从测序比对结果看出BC01菌株为凝结芽孢杆菌。
实施例4、凝结芽孢杆菌BC01的生理生化特性
1、***、生长周期有两种生命形态：营养体和芽孢体。营养体多单杆分散分布，染色清晰，两端浑圆(图4)。芽孢体为端生芽孢，显微镜下观测有如一个个小羽毛球拍(图5)。如图4所示：凝结芽孢杆菌BC01的营养体形态；如图5所示：凝结芽孢杆菌BC01的芽孢态形态。
2、凝结芽孢杆菌BC01在人工胃液以及人工小肠液中的耐受性
凝结芽孢杆菌BC01在人工胃液和人工小肠液中的耐受性十分优秀。在37℃，pH3.0的人工胃液中处理2h和6h，存活率大于90％和73％；在37℃，pH7.0的人工小肠液中处理1h和4h，存活率分别大于92％和82％；连续通过人工胃液3h和人工小肠液3h，存活率大于63％(图6)。对人工胃液和小肠液的耐受性远超其他所有乳酸菌。如图6所示：凝结芽孢杆菌BC01在人工胃液和小肠液中的存活率。
3、凝结芽孢杆菌BC01在存储期的活菌稳定性
凝结芽孢杆菌BC01在存储期十分稳定，37℃加速破坏10天以及常温保存12个月的存活率均大于98％(图7)，十分有利于对其进行进一步的研究。
利用动物模型测试鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01
如图7所示：凝结芽孢杆菌BC01的储存期稳定性
4、凝结芽孢杆菌BC01体外试验体现了良好的对金黄色葡萄球菌的抑制作用(图8)金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为++(1.28cm)，但对大肠杆菌没有体现出抑制能力。
图8：凝结芽孢杆菌BC01对金黄色葡萄球菌的抑制作用
实施例5
利用动物模型试验鼠李糖乳杆菌NJ551、凝结芽孢杆菌BC01以及由这两种单菌组成的组合菌对免疫力的影响，具体的技术路线如下：
1、实验动物：为SPF级小鼠，雄性，体重约18～22克。
2、测试指标：小鼠脾脏NK细胞杀伤率、小鼠血清IFN-γ和TNF-α浓度、小鼠肠黏膜通透率
3、试验步骤：
3.1共有28只SPF级昆明小鼠，分为7个试验组。这7个试验组分别为：空白组、模型组、鼠李糖乳杆菌NJ551单菌组(下文称NJ551组)、凝结芽孢杆菌BC01单菌组(下文称BC01组)、鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01组合组(下文称组合组)高、中、低3个浓度试验组；
3.2造模：除空白组以外，其余各组每天按照体质量腹腔注射免疫抑制剂环磷酰胺(50mg/kg/d)，连续3天。空白组每天按照体质量腹腔注射等量生理盐水，连续3天；
3.3益生菌干预：造模结束后，空白组和模型组每天灌胃生理盐水2mL,NJ551组每天灌胃NJ551单菌液1mL，BC01组每天灌胃BC01单菌液1mL,组合高剂量组每天灌胃混合菌液2mL，组合中剂量组每天灌胃混合菌液1mL，组合低剂量组每天灌胃混合菌液0.5mL，所有试验组都连续灌胃15天；
3.4第16天给所有试验组的小鼠都经口灌喂2mL的乳果糖和甘露醇混合溶液(含乳果糖100mg,甘露醇50mg)，罐胃后24小时收集小鼠的尿液，每20mL尿液加入4mg硫柳汞于-20℃保存待测。
3.5第18天，所有小鼠取颈静脉血测定外周血γ-IFN和TNF-α含量。然后所有小鼠处死，取脾脏测定NK细胞活性。
4、上诉鼠李糖乳杆菌NJ551菌液、凝结芽孢杆菌BC01菌液以及NJ551和BC01组合菌液的配置方法如下：
4.1鼠李糖乳杆菌NJ551单菌液的配置：先制备鼠李糖乳杆菌NJ551冻干粉，测定冻干粉的活菌数，然后按照测定的冻干粉活菌数称取适当重量用生理盐水稀释成含鼠李糖乳杆菌NJ551浓度为4*106CFU/mL的菌液(称NJ551单菌液)；
4.2凝结芽孢杆菌BC01单菌液的配置：先制备凝结芽孢杆菌BC01活菌粉，测定活菌粉的活菌数，然后按照测定的活菌数称取适当重量用生理盐水稀释成含凝结芽孢杆菌BC01浓度为1.2*106CFU/mL的菌液(称BC01单菌液)；
4.3鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01混合菌液的配置：利用上述鼠李糖乳杆菌NJ551冻干粉和凝结芽孢杆菌BC01活菌粉，称取一定重量用生理盐水稀释成含凝结芽孢杆菌BC01浓度为6*105CFU/mL和鼠李糖乳杆菌NJ551浓度为2*106CFU/mL的菌液(称混合菌液)。
5、小鼠脾脏NK细胞杀伤率的测定方法：
利用LDH法测定NK细胞的活性：
5.1LDH基质液的配制
乳酸锂 5×10-2mol/L
硝基氯化四氮唑(INT) 6.6×10-4mol/L
吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) 2.8×10-4mol/L
氧化型辅酶Ⅰ(NAD) 1.3×10-3mol/L
将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH8.2)
5.2靶细胞的传代(YAC-1细胞，小鼠淋巴瘤细胞)
实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以RPMI1640完全培养液洗2次，每次洗涤完后以1000rpm，离心5分钟。最后用10％RPMI1640完全培养液洗涤后再悬浮细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL。
5.3脾细胞悬液的制备(效应细胞)
解剖小鼠，取出脾脏。用PBS清洗干净；在玻璃皿中用注射器针芯经200目不锈钢细胞筛研磨，制成细胞悬液；5ml PBS混匀，收取细胞悬液。1000r/min离心10min，弃上清。5ml红细胞裂解液室温静止5min；1000r/min离心10min，弃上清；5ml PBS重悬离心洗涤一次，弃上清。用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
5.4NK细胞杀伤率检测
反应测试组：取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50：1)，加入96孔培养板中；
自然释放组：取靶细胞和培养液各100μL，加入96孔培养板中；
最大释放组：取靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100μL，加入96孔培养板；
上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
按下式计算NK细胞杀伤率：
NK细胞杀伤率＝(反应组吸光度-自然释放组吸光度)/(最大释放组吸光度-自然释放组吸光度)*100％
6、外周血IFN-γ以及TNF-α含量测定：利用ELISA试剂盒(上海酶联生物科技
有限公司)，按照试剂盒上的使用方法测定。
7、肠道黏膜通透性的测定：
两糖探针法，利用乳果糖和甘露醇在肠道不同位置的吸收特性不同，甘露醇一般在黏膜上皮顶部吸收，乳果糖一般在上皮细胞紧密连接处较为松弛的隐窝部吸收。正常时，甘露醇的通透率大于乳果糖，肠黏膜通透性发生变化时肠绒毛脱落而隐窝部链接松弛，乳果糖的吸收率将大于甘露醇，这两者吸收的变化可以在小鼠尿液中体现出来，因此可以用尿液中乳果糖与甘露醇的比值(L/M)值的变化来反应肠道黏膜通透性的变化。
具体的测定方法为：
在干预结束后的最后一天，给所有测试组的小鼠经口灌喂乳果糖和甘露糖溶液，每只小鼠灌喂2mL(含乳果糖100mg,甘露糖50mg)。灌喂之后收集每只小鼠24小时内的尿液，每20mL尿加4mg硫柳汞于-20℃保存待测。利用高效液相色谱测定小鼠尿中乳果糖和甘露糖的含量，用乳果糖和甘露醇的比值(L/M)来表征肠道黏膜通透性。检测时，取0.4mL尿液，4℃条件下12000rpm离心30min，取上清。色谱条件为：柱型为氨基色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相:乙腈:水为72:28(v/v)；流速1mL/min；柱温30℃；检测器为示差折光检测器；内加热温度37℃,进样量10μL。根据标准曲线计算样品中甘露醇和乳果糖的浓度，再根据两者的灌胃剂量计算出大鼠体内乳果糖(lactulose，L)和甘露醇(mannitol，M)的排出率比值(L/M)。
图9：乳果糖与甘露醇标准品在高效液相色谱上的保留时间
8、测试结果
8.1各试验组NK细胞杀伤率变化
结果表明：在使用环磷酰胺造模以后，模型组的NK细胞杀伤率相对于空白组显著降低，说明造模是成功的。在用益生菌干预后，所有干预组相对于空白组和模型组，NK细胞的杀伤率都出现了显著性的增加，即便是使用鼠李糖乳杆菌NJ551单菌和凝结芽孢杆菌BC01单菌，它们的NK细胞杀伤率相对于模型组分别提高了42％和39.5％，说明这两种单菌单独使用也能起到提高免疫力的效果。但NJ551和BC01的组合组对NK细胞杀伤率的提高更为明显，且组合组所用的益生菌剂量越高，对NK细胞的杀伤率提升作用更为明显，即便是低剂量组相对于模型组，NK细胞的杀伤率也提高了49.3％(表2)。组合组的中高剂量组相对于NJ551和BC01单菌组的NK细胞杀伤率也有显著性增加。尽管组合组的低剂量组在NK细胞杀伤率对比NJ551单菌组没有显著性提高，但平均NK细胞杀伤率也提高了约4.8％。这些结果综合说明了NJ551和BC01都有单独提高NK细胞杀伤率，恢复被抑制的免疫力的作用，但两者的组合可以使这种提高效果更明显，在较低的剂量摄入就能达到单菌高剂量的效果。
Figure BDA0002443657340000121
表2：各试验组NK细胞杀伤率测定结果(*：与模型组比较有显著差异p＜0.05；#：与空白组比较有显著差异p＜0.05；@：与单菌组比较有显著差异p＜0.05)
8.2各试验组对肠道黏膜通透性的影响
结果表明，造模小鼠的肠道黏膜通透性相对于空白组有显著的增高，使用益生菌干预能够修复被破坏的肠道黏膜通透性。益生菌干预组，除了NJ551组以外，其余干预组在干预期结束后，相对于模型组，其肠粘膜通透率都显著性的降低了，基本恢复到了空白组的水平。尽管从整体看，益生菌干预组的肠粘膜通透性与空白组相比没有显著差异，但组合高剂量组和低剂量组其肠道黏膜通透性相对于空白组也有一定程度的降低，这种降低虽然没有达到显著差异的水平，但也能在一定程度上说明组合组高、中剂量能够增强肠道黏膜屏障(表3)。
Figure BDA0002443657340000131
表3：各试验组对肠粘膜通透性的影响(*：与模型组比较有显著差异p＜0.05；#：与空白组比较有显著差异p＜0.05；@：与单菌组比较有显著差异p＜0.05)
8.3各试验组对外周血IFN-γ、TNF-α含量的影响
结果表明，与空白组相比，模型组的血清IFN-γ以及TNF-α含量显著下降。益生菌干预组能恢复这两种细胞因子的含量，总体来说，相较于TNF-α，益生菌更加能刺激机体产生IFN-γ。NJ551单菌组的IFN-γ含量相较于空白组和模型组分别显著性(p＜0.05)提高了6％和72％；能将TNF-α的水平提高到空白组以上，但这种提高相对于模型组来说有具有显著性，但相对于空白组来说则没有显著性。BC01单菌组的IFN-γ含量相较于空白组和模型组分别提高了2.3％和66.1％，但这种提高对于空白组没有显著性，对于模型组来说具备显著性；相较于模型组能提高TNF-α的含量，这种提高具有显著性。而组合组的高剂量组和中剂量组，无论是相较于模型组还是空白组，均能显著性的提高IFN-γ以及TNF-α的含量；相较于单菌组(NJ551组以及BC01组)也能显著性提高IFN-γ含量，对于TNF-α的含量较BC01单菌组也能显著提高。而组合组低剂量组相对于模型组也能显著性提高血清IFN-γ和TNF-α的含量，但这种提高相较于单菌组并不提体现出显著性的优势。总的来说，益生菌干预组均能恢复或者提高被环磷酰胺抑制的血清细胞因子浓度，但组合组可以利用较低的益生菌摄入量就能达到甚至超过单菌组较高的摄入量，体现出了明显的优势。益生菌单菌组也能有效将IFN-γ或者TNF-α的含量恢复甚至超越空白组的水平，体现了有效提高免疫力的效果(表4)。
Figure BDA0002443657340000141
表4：各试验组对外周血IFN-γ以及血清TNF-α含量的影响(*：与模型组比较有显著差异p＜0.05；#：与空白组比较有显著差异p＜0.05；@：与单菌组比较有显著差异p＜0.05)
9、由于上述动物实验证明了鼠李糖乳杆菌NJ551、凝结芽孢杆菌BC01以及两种菌的组合在恢复被破坏的免疫力甚至提高免疫力上有显著的帮助，尤其是组合菌相较于单菌更有明显的优势。由于这两种菌都在中国***批准的可以用于食品的菌种名单中，因此这两种单菌及其组合可以应用于食品、保健品或者药品。这种应用方式可以有如下几种：
1、利用这两种菌的冻干粉，单独或者组合与其他辅料比如益生元、麦芽糊精等混合成固体粉剂、片剂、颗粒、胶囊等形式的产品。
2、将此两种菌或者组合加入到发酵食品中，比如酸奶、泡菜、发酵果蔬汁、酵素等食品中。这种加入方式可以在上述液体产品发酵完成后再添加以上两种菌或者其组合的冻干粉，也可以在发酵开始时就加入，在发酵过程中增殖。
3、将此两种菌或者组合加入到诸如果冻、奶酪等半固体食品或者其他半固体产品中。
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

Claims (6)

1.有利于提高免疫力的益生菌组合物，其特征在于，所述组合物包含鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01，所述鼠李糖乳杆菌NJ551菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2016157，所述凝结芽孢杆菌BC01菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017813。
2.根据权利要求1所述的有利于提高免疫力的益生菌组合物，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌NJ551具有如下特性：
在人工胃液中处理6小时存活率大于50％，在人工小肠液中处理1小时存活率大于26％；
在免疫抑制小鼠模型中能有效恢复或者提高小鼠肠道黏膜通透性、NK细胞杀伤率以及血清γ-干扰素、TNF-α含量；
由此菌株所制备的冻干粉，37℃破坏10天存活率大于50％，-18℃保存12个月存活率＞90％；
所述凝结芽孢杆菌BC01具有如下特性：
在人工胃液中处理6小时存活率大于75％，在人工小肠液中处理4小时存活率大于82％，连续通过人工胃液处理3小时和人工小肠液处理3小时存活率大于63％；
由此菌株制备的冻干粉或者喷干粉37℃破坏10天存活率大于98％，常温保存18个月存活率大于98％；
在其生命周期中存在营养态和芽孢态两种生命形态；
体外试验证实其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌效果；
在免疫抑制小鼠模型中能有效恢复或者提高小鼠肠道黏膜通透性、NK细胞杀伤率以及血清γ-干扰素、TNF-α含量。
3.根据权利要求1所述的有利于提高免疫力的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物中所述鼠李糖乳杆菌NJ551和所述凝结芽孢杆菌BC01单独保存或混合后保存。
4.根据权利要求3所述的有利于提高免疫力的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物为含有所述鼠李糖乳杆菌NJ551和所述凝结芽孢杆菌BC01的混合物，所述鼠李糖乳杆菌NJ551用量为2.0*105CFU/克(体重)/天；所述凝结芽孢杆菌BC01用量为6.0*104CFU/克(体重)/天。
5.一种提高免疫力的益生菌组合物的制备方法，其特征在于，所述组合物包含所述鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01，所述鼠李糖乳杆菌NJ551菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2016157，所述凝结芽孢杆菌BC01菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2017813，所述提高免疫力的益生菌组合物的制备方法包含如下步骤：
利用所述鼠李糖乳杆菌NJ551的冻干粉和所述凝结芽孢杆菌BC01的活菌粉，稀释成混合菌液。
6.一种提高免疫力的益生菌组合物的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌NJ551和凝结芽孢杆菌BC01的组合物应用于制备提高免疫力的药品、食品或保健品中，所述鼠李糖乳杆菌NJ551菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2016157，所述凝结芽孢杆菌BC01菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2017813。
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