CN117025492B - 一种减轻宠物肥胖的嗜热链球菌jyst-81及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种减轻宠物肥胖的嗜热链球菌JYST‑81及其应用，属于微生物技术领域，所述嗜热链球菌JYST‑81于2023年7月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27993，分类命名为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus，所述嗜热链球菌JYST‑81在制备减轻宠物肥胖产品中的应用。本发明所述嗜热链球菌JYST‑81在体外模拟肠胃环境下对油脂具有较好的吸附作用；所述嗜热链球菌JYST‑81能够改善肠道菌群，减轻宠物体重；所述嗜热链球菌JYST‑81能够降低血清中TG、TC、LDL含量，改善血脂代谢紊乱。
Description
技术领域
本发明涉及一种减轻宠物肥胖的嗜热链球菌JYST-81及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
宠物超重和肥胖是宠物行业面临的最大问题之一，宠物们身上的多余体重势必会损害它们的整体健康，增加它们患上糖尿病、脂肪肝、甲状腺功能减退、癌症、高血压、髋关节发育不良等诸多疾病的风险。
现有技术中减轻宠物肥胖的方法主要有以下几种：
饮食控制：通过减少宠物每天的食物摄入量或者使用低热量的食物来实现。缺点是宠物可能会感到饥饿，出现情绪暴躁或者出现营养不良的问题。
加强宠物运动：增加宠物的运动量，例如多散步、玩耍或参加户外活动等增强宠物的代谢率和体力。缺点是某些宠物可能由于年龄、健康状况或行动不便而无法进行高强度的活动，且猫狗等宠物汗腺较少，排汗能力较差，夏季容易出现中暑现象。
宠物减肥药：一些减肥药含有药物成分或化学物质，宠物的身体对药物的反应与人类不同，可能会导致不良反应或副作用，对宠物的健康有潜在风险，甚至危及宠物的生命。某些减肥药通过减少食欲或影响食物吸收来减轻宠物的体重，会导致宠物营养不均衡，对宠物的健康造成负面影响，且一旦停止使用减肥药，宠物会恢复原有的饮食习惯和体重，无法长期维持减肥效果。
目前针对宠物减肥的产品和研究较少。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种减轻宠物肥胖的嗜热链球菌JYST-81及其应用，实现以下发明目的：
吸附油脂，减轻宠物体重，降低血清中血脂、胆固醇的含量。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种减轻宠物肥胖的嗜热链球菌JYST-81，所述嗜热链球菌JYST-81于2023年7月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.27993，分类命名为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus。
所述嗜热链球菌JYST-81经制备得到菌剂。
所述菌剂中，嗜热链球菌JYST-81的数量为1.0×1010cfu/g。
所述菌剂的制备方法为将嗜热链球菌JYST-81经过活化、培养得到菌液，离心后收集菌体，重悬于复原脱脂乳中，冷冻干燥后得到菌粉，再与葡萄糖混合，得到嗜热链球菌的菌剂。
所述嗜热链球菌JYST-81在制备减轻宠物肥胖产品中的应用。
所述嗜热链球菌JYST-81，于2023年7月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCCNo.27993；该菌株具有对宠物减肥的功能。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
本发明所述嗜热链球菌JYST-81在体外模拟肠胃环境下对油脂具有较好的吸附作用；所述嗜热链球菌JYST-81能够改善肠道菌群，增加能量和脂肪的代谢，减轻宠物体重；所述嗜热链球菌JYST-81能够降低血清中TG、TC、LDL含量，改善血脂代谢紊乱。
附图说明
图1为本发明嗜热链球菌JYST-81在模拟肠胃消化液中吸油量的折线图；
图2为本发明嗜热链球菌JYST-81对肥胖宠物犬血清生化指标影响的柱状图；
其中图2A为本发明嗜热链球菌JYST-81对肥胖宠物犬血清中TG含量影响的柱状图；图2B为本发明嗜热链球菌JYST-81对肥胖宠物犬血清中TC含量影响的柱状图；图2C为本发明嗜热链球菌JYST-81对肥胖宠物犬血清中LDL含量影响的柱状图；图2D为本发明嗜热链球菌JYST-81对肥胖宠物犬血清中HDL含量影响的柱状图。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
具体实施方式
实施例1菌种的分离鉴定
1、菌株的分离纯化
（1）菌株的分离：将2022年1月23日在重庆市铜梁区采集的自制酸菜切成小块，取1g加入到10mL无菌生理盐水中振荡混匀，然后用无菌生理盐水进行梯度稀释，从10-1至10-7共稀释7个梯度，分别取10-5、10-6、10-7三个梯度的稀释液100μL涂布到MRS固体培养基平板上，置于厌氧培养箱中37℃恒温静置培养48h。
所述MRS固体培养基的制备方法为：取蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸三铵2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、吐温-80 1mL、琼脂粉15g，用去离子水溶解，定容至1L，调整pH为6.3，115℃高压蒸汽灭菌20min，倒入平皿中，冷却成固体。
（2）菌株的纯化：根据菌落直径1~2mm、边缘整齐、白色不透明的菌落特征，挑取单菌落在MRS固体培养基平板上进行三区划线，划线后在37℃、厌氧条件下培养48h，重复上述操作，共经过3次划线，纯化得到纯菌株，将纯菌株加入到甘油管中于-80℃保藏。
2、菌株鉴定
将上一步分离纯化所得单菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行16SrDNA测序，使用的引物如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（如序列表中的SEQ ID NO.1所示）；
1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'（如序列表中的SEQ ID NO.2所示）。
该菌株的16S rDNA核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示。
将所得的16S rDNA与GenBank网站中已知菌株的序列进行BLAST分析，用MEGA-X软件构建***发育树。
经***发育树分析该菌株鉴定为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），命名为嗜热链球菌JYST-81。
将上述嗜热链球菌JYST-81送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下：
嗜热链球菌JYST-81，分类命名为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus，于2023年7月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.27993。
实施例2嗜热链球菌JYST-81菌剂的制备
将-80℃保藏的嗜热链球菌JYST-81在实施例1所述的MRS固体培养基平板上活化，挑取活化后的1个单菌落转接到100mL 的MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养12h制得种子液，将种子液按照1%（v/v）接种量接种于MRS液体培养基中，然后在厌氧条件下37℃恒温静置培养48h，获得菌液。
将菌液离心，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得浓度为1.0×1010cfu/mL的菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
将菌粉与葡萄糖混合，制成嗜热链球菌JYST-81菌剂；葡萄糖购自山东西王糖业有限公司；在本实施例中，制备的嗜热链球菌JYST-81菌剂中菌体数量为1.0×1010cfu/g。
所述MRS液体培养基是在实施例1的MRS固体培养基的配方中省略琼脂的加入。
实施例3嗜热链球菌JYST-81在模拟肠胃消化液中对油脂的吸附作用
（1）模拟胃液的制备：用9.5%（w/v）盐酸加蒸馏水稀释至pH值为2，每100mL稀释后的盐酸溶液中加入1.0g胃蛋白酶，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，得到模拟胃液，现配现用。
（2）模拟肠液的制备：将6.8g的KH2PO4溶于500mL蒸馏水中，加入3g胆盐（购自上海阿拉丁生化科技股份有限公）和10g胰蛋白酶，用浓度为4g/L的NaOH溶液调节溶液pH值至6.8，用蒸馏水定容至1L后，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，得到模拟肠液，现配现用。
（3）在模拟肠胃消化液中对油脂的吸附作用：
实验组：在90mL模拟胃液中加入10g食用花生油，然后将实施例2的嗜热链球菌JYST-81菌剂按照4%、8%、12%、16%、20%、24%（w/w）的添加量添加到含花生油的模拟胃液中，37℃、80rpm恒温振荡处理2h，抽滤得到菌体油脂复合物；然后将复合物加入到90mL模拟肠液中，同时加入10g食用花生油，37℃、80rpm恒温振荡处理2h，抽滤得到最终的菌体油脂复合物，将菌体油脂复合物烘干，测量得到实验组菌体油脂复合物干重A2。
对照组：和实验组的区别为菌剂添加到不含食用花生油的模拟肠胃消化液中，其他处理方法同实验组，得到菌体干重A1，每个处理三个平行。按照下列公式计算嗜热链球菌JYST-81在模拟肠胃消化液中对油脂的吸附量：
；
嗜热链球菌JYST-81在模拟肠胃消化液中对油脂的吸附情况如图1所示，随着菌剂添加量的增加，嗜热链球菌JYST-81对油脂的吸附作用先增强后减弱，在添加量为16%（w/w）时，嗜热链球菌JYST-81对油脂的吸附作用最好，吸油量为0.74g/g，嗜热链球菌JYST-81在体外模拟肠胃环境下对油脂具有较好的吸附作用。
嗜热链球菌JYST-81对油脂的吸附作用先增强后减弱，可能是因为嗜热链球菌JYST-81自身会产生脂肪酶对油脂进行分解，添加量少时产生的脂肪酶较少对油脂的分解能力弱；添加量多时产生的脂肪酶较多，菌体吸附的油脂被大量分解，导致菌体油脂复合物减少。
实施例4嗜热链球菌JYST-81对肥胖宠物犬体重的影响
与宠物医院进行合作，由一位专业的宠物营养师根据9分制BCS（Body ConditionScore）体况评分***挑选5只健康犬、20只肥胖犬，健康犬为空白对照组（NC），肥胖犬随机分为4组，分别为肥胖对照组（OC）、低剂量组（LD）、中剂量组（MD）和高剂量组（HD），试验开始前记录宠物犬初始空腹体重，按照下列方式饲喂8周，每两周记录一次空腹体重数据，结果见表1。
空白对照组（NC）：健康犬，饲喂普通饲料。
肥胖对照组（OC）：肥胖犬，饲喂普通饲料。
低剂量组（LD）：肥胖犬，按照犬的体重添加菌剂2×108cfu/kg/d，与普通饲料混匀饲喂。
中剂量组（MD）：肥胖犬，按照犬的体重添加菌剂1×109cfu/kg/d，与普通饲料混匀饲喂。
高剂量组（HD）：肥胖犬，按照犬的体重添加菌剂5×109cfu/kg/d，与普通饲料混匀饲喂。
表1嗜热链球菌JYST-81对肥胖宠物犬体重的影响
注：与空白对照组相比，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01，###表示P＜0.001。与肥胖对照组相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
由表1可知，肥胖对照组体重显著高于空白对照组（P＜0.001），低剂量、中剂量、高剂量三组体重试验8周后体重均显著降低（P＜0.05），其中中剂量组试验6周后体重开始降低（P＜0.05），高剂量组试验4周后体重开始降低（P＜0.05），说明嗜热链球菌JYST-81菌剂具有显著的减肥效果。
实施例5宠物犬血清生化指标的检测
实施例4中的宠物犬试验结束时由宠物医生进行静脉抽血，收集血液，3000rpm离心15min得到血清。用购自生工生物工程（上海）股份有限公司的试剂盒检测血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）含量。
由图2可知，肥胖对照组的TG、TC、LDL水平显著高于空白对照组（P＜0.001），HDL水平显著低于空白对照组（P＜0.001），说明肥胖宠物犬血脂代谢紊乱。与肥胖对照组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组的TG、TC、LDL水平均显著降低（P＜0.05），HDL水平显著升高（P＜0.05）。高剂量组在TG、TC、LDL及HDL水平与肥胖对照组差异极显著（P＜0.001），说明嗜热链球菌JYST-81菌剂能够降低血清中TG、TC、LDL含量，改善血脂代谢紊乱。
实施例6嗜热链球菌JYST-81对宠物身体状况的评价
实施例4试验结束后，由一位专业的宠物营养师根据9分制BCS评分***对25只宠物犬进行身体状况评价，评分结果如下：
表2宠物犬的体况评分
注：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
通过BCS体况评分可知，饲喂嗜热链球菌JYST-81菌剂的肥胖宠物犬的体型、脂肪堆积情况均得到明显改善（P＜0.05），说明嗜热链球菌JYST-81菌剂能够有效减轻宠物肥胖情况。
Claims (4)
1.一种嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）JYST-81在制备减轻宠物肥胖产品中的应用，其特征在于：所述嗜热链球菌JYST-81于2023年7月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27993。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述嗜热链球菌JYST-81经制备得到菌剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述菌剂中，嗜热链球菌JYST-81的数量为1.0×1010cfu/g。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述菌剂的制备方法为将嗜热链球菌JYST-81经过活化、培养得到菌液，离心后收集菌体，重悬于复原脱脂乳中，冷冻干燥后得到菌粉，再与葡萄糖混合，得到嗜热链球菌的菌剂。
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