CN1143115A

CN1143115A - 生产3-甲基-7-烷基黄嘌呤的微生物方法

Info

Publication number: CN1143115A
Application number: CN96106844A
Authority: CN
Inventors: 小出芳直; 今井丰; 中根诚治
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1992-05-20
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 1997-02-19
Also published as: US5550041A; CN1088259A; DE4316882A1

Abstract

公开了含有由属于假单胞菌属并能同化咖啡碱的微生物产生的咖啡碱脱甲基酶基因的DNA片段以及生产3-甲基-7-烷基黄嘌呤的方法，所说的方法包括在含有1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的营养培养基中培养用其中已整合了上述DNA片段的重组DNA转化的假单胞菌属的新细菌菌株，以在培养物中产生3-甲基-7-烷基黄嘌呤，并从培养物中回收所产生的3-甲基-7-烷基黄嘌呤，本文还公开了生产3-甲基-7-丙基黄嘌呤的方法。

Description

生产3-甲基-7-烷基黄嘌呤的微生物方法

本发明涉及含有由假单胞菌属(Pseudomonas)微生物产生并能代谢咖啡碱之咖啡碱脱甲基酶基因的DNA片段；用含所说的DNA片段之重组DNA转化而得到的新的假单胞菌属的菌株；以及产生3-甲基-7-烷基黄嘌呤的微生物方法。

3-甲基-7-烷基黄嘌呤是一种重要的用于制备成药的中间产品。例如，3，7-二甲基黄嘌呤(可可碱)是1-(5-氧代己基)-3，7-二甲基黄嘌呤(Pentoxyfyl line)的重要中间产品，3-甲基-7-丙基黄嘌呤是1-(5-氧代己基)-3-甲基-7-丙基黄嘌呤(Propentophyl line)的重要中间产物。

可按常规方法从可可豆中提取得到3，7-二甲基黄嘌呤，或者也可从3-甲脲合成得到。

通常是按JP-BP-52-33120(术语“JP-B”在这里是指“已审查的日本专利公开”)中所述，将5-氧代己基基团引入3-甲基-7-丙基黄嘌呤中来合成可用作治疗脑血管病之药物的Propentophylline。可通过各种化学方法合成起始材料3-甲基-7-丙基黄嘌呤。这种方法的一个典型例子是包括用碱处理1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤，以得到4-甲基氨基-5-甲基氨甲酰-1-丙基咪唑，后者与脲反应得到N-甲基-N-(5-甲基氨基酰-1-丙基咪唑-4-基)脲，然后按JP-A-1-1 80883(术语“JP-A”在这里是指“未审查的已公开日本专利申请”)所术方法使之环化。但这些已知的化学合成方法在其工业生产应用中有许多问题，包括需要使用非常复杂的步骤。因此，期望开发更为简单的合成3-甲基-7-丙基黄嘌呤的方法。

另外，已研究了合成3，7-二甲基黄嘌呤的微生物技术。例如，Hoope-Seyler′s Z.Physiolo.Chem.，Vol.358，P.807(1977)，JP-B-4-12117和EP-A-0509834中提出使用能同化咖啡碱的微生物或其突变菌株，将1，3，7-三甲基黄嘌呤(咖啡碱)转化成3，7-二甲基黄嘌呤。

然而，除3，7-二甲基黄嘌呤外，微生物合成3-甲基-7-烷基黄嘌呤的方法是未知的。另外，从转化效率等角度看，合成3，7-二甲基黄嘌呤的已知微生物方法仍不能令人满意地进行工业规模生产。

鉴于上述情况，本发明广泛地研究了能够使1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤位点特异性地脱甲基的微生物，并出乎预料地发现以前由本发明人从自然界分离的一个假单胞菌属的菌株当培养在含1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的培养基中时，能同化咖啡碱而在培养基中产生相应的3-甲基-7-烷基黄嘌呤。

本发明人原先通过将从土壤中分离的同化咖啡碱的微生物突变而得到组成型的代谢咖啡碱的突变菌株，又进一步突变该微生物使之缺失令可可碱脱甲基而成为7-甲基黄嘌呤的能力，从而得到其双突变的菌株(见EP-A-0509834)。

本发明人已发现，上述双突变菌株比从自然界分离的亲代菌株有更强的将相应1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤转化成3-甲基-7-烷基黄嘌呤的能力。

如果在由上述微生物完成的咖啡碱代谢途径的第一个步骤能更有效地进行，使从相应1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤转化成3-甲基-7-烷基黄嘌呤的能力得到进一步地提高。为此，本发明人进行了深入的研究，以期提高已知可催化该反应的咖啡碱脱甲基酶的活性。结果，他们成功地克隆了此前尚不明了其蛋白质知识的咖啡碱脱甲基酶的基因。已基于这些发现完成了本发明。

本发明提供了：(1)一种分离并纯化的DNA片段，其含有衍生子假单胞菌属之细

菌的咖啡碱脱甲基酶基因；(2)根据上述(1)的DNA片段，它是由图1中所示的限制性核

酸内切酶裂解图谱限定的：(3)根据上述(2)的DNA片段，其中由SEQ ID NO：1表示位

于AccI位点和NdeI位点间的碱基序列，其含有咖啡碱脱甲

基酶基因；(4)一种分离并纯化的DNA片段，其含有编码SEQ ID NO：2的

氨基酸序列的碱基序列；(5)将上述(1)或(4)的DNA片段整合到其载体中所得到的重组DNA；(6)包括用上述(5)的重组DNA转化的宿主的假单胞菌菌属的新的细菌菌株；(7)上述(6)的假单胞菌菌属的新的细菌菌株，其中宿主是臭味

假单胞杆菌(Pseudomonas putida)以及：(8)上述(7)的假单胞菌菌属的新的细菌菌株，其中宿主是臭味

假单胞菌IF-3-9C-21。

本发明还提供了生产3-甲基-7-烷基黄嘌呤的方法，该方法包括在含有1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的营养培养基中培养用含有咖啡碱脱甲基酶基因的重组DNA转化的微生物，以在培养物中产生相应的3-甲基-7-烷基黄嘌呤并从培养物中回收所产生的3-甲基-7-烷基黄嘌呤。

本发明进一步提供了生产3-甲基-7-丙基黄嘌呤的方法，该方法包括在含有1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的营养培养基中培养能够将1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤转化成3-甲基-7-丙基黄嘌呤的假单胞菌属的微生物或由之衍生的突变体，以在培养物中产生3-甲基-7-丙基黄嘌呤并从培养物中回收所产生的3-甲基-7-丙基黄嘌呤。

图1是含有咖啡碱脱甲基酶基因的DNA片段的限制性核酸内切酶裂解图谱。

图2是图解显示在小罐中的培养进程。图中，分别以白圈代表臭味假单胞杆菌IF-3-9C-21/pCA32A生产可可碱的情况；白三角代表臭味假单胞杆菌IF-3-9C-21产生可可碱的情况；黑圈代表臭味假单胞菌IF-3-9C-21/pCA32A产生3-甲基-7-丙基黄嘌呤的情况，黑三角代表臭味假单胞菌IF-3-9C-21产生3-甲基-7-丙基黄嘌呤的情况。

可用于本发明的微生物包括能将通式(I)代表1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤(——其中R代表直链或支链的烷基基团——)转化成式(II)代表的3-甲基-7-烷基黄嘌呤(——其中R的定义同上——)的微生物。

本发明中，上述通式(I)和(II)的R优选是C₁-C₄烷基基团。

上述微生物包括属于假单胞菌属的细菌和由之衍生的突变体。特定例子是从土壤中分离并在EP-A-0509834中描述的臭味假单胞菌IF-3(已按布达佩斯条约以FERM BP-3824为登记号保藏)；以及在JP-B-4-12117中描述的假单胞菌菌种188-1(已按布达佩斯条约以FERM P-7073，FERM BP-4282为登记号保藏)。

根据本发明人的研究，假单胞菌188-1(已按布达佩斯条约规定，以保藏登记号FERM P-7073，FERM BP-4282保藏)被鉴定为如下文描述的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)。下文中将假单胞菌188-1(已按布达佩斯条约规定，以FERM P-7073，FERM BP-4282为保藏登记号保藏)称为洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)FERMBP-4282。

可按已知方法对上述菌株进行突变处理以得到突变菌株，如用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(下文简称为NTG)作为诱变剂进行化学处理。另外，也可用2-氨基嘌呤，5-溴尿嘧啶，甲磺酸乙酯，硫酸二甲酯，丫啶黄，丫啶桔黄(Acridine Orange)，肼，4-硝基喹啉-N-氧化物、氯化锰等作诱变剂。可使用紫外光照射或X射线、γ射线等放射活性照射等物理方法诱导突变(参见TheMolecular Basis of Mutation，John W.Drake(1970)，Holden-Day.Inc.and General Genetics(第2版)，W.H.FREEMAN ANDCOMPANY)。

可用已知方法分离突变菌株，如包括首先培养已经受突变处理的微生物，然后检查各菌落发生突变情况的直接方法；按上述方法进行改进的复制方法；使用青霉素等抗生素的凝聚方法；以及适当联合使用上述方法。

本发明中，采用下述实验程序选择出能将1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤转化成3-甲基-7-烷基黄嘌呤的菌株。从土壤中分离大约100个有咖啡碱抗性并能够在含有1.0％Bacto-胨，0.5％Bacto-酵母浸膏，0.5％氯化钠和2.0％咖啡碱的琼脂培养基上生长的菌株，分别接种于含有0.3％咖啡碱，0.3％硫酸铵，0.5％二代磷酸钾，0.1％氯化钠和0.2％硫酸镁的琼脂培养基(pH＝7.0)上并于30℃下培养3天，然后选择生长良好的菌株。

臭味假单胞菌IF-3和洋葱假单胞菌FERMBP-4282的菌学性质如下所述。按照Society of Hygienic Technology，Japan出版的Manual of the Identification of Medical Bacteria(MIMB)，Identificaton of Microorganisms和Academic Society PressCenter，Japan出版的Classification and Identification ofMicroorganisms.Vol.II所述方法检验这些细菌菌学性质。

臭味假单胞菌IF-3a.形态学特征：

1)革兰氏染色：阴性

2)细胞的形状和大小：杆状，约0.8×2-3tm

3)运动性：阳性

4)鞭毛：＞1

5)孢子形成：阴性b.生理学性质：

1)0-F试验(Hugh-Leifson方法)：需氧产酸

2)溶血：阳性

3)对氧的反应：需氧

4)由糖产酸：

D-葡萄糖 +

D-木糖 +

甘露糖醇 -

乳糖 -

蔗糖 -

D-麦芽糖 -

D-果糖 -

L-***糖 +

棉子糖 -

菊粉 -

水杨苷 -

琼脂糖 -

D-山梨糖醇 -

D-半乳糖 +

甘油 -

5)过氧化氢酶试验：阳性

6)氧化酶试验：阳性

7)在Mac Conkey氏培养基上生长：阳性

8)在SS琼脂培养基上生长：阳性

9)DBH水解：阴性

10)PHB积聚：阴性

11)柠檬酸利用：阳性

12)脲分解：阴性

13)硝酸盐还原：阳性

14)脱氮反应：阴性

15)热抗性(60℃×30分钟)：无抗性

16)生长温度：

5℃生长

25℃生长

37℃生长

42℃不生长

17)明胶水解：阴性

18)石蕊汁反应：阳性

19)淀粉水解：阴性

20)酪蛋白水解：阴性

21)聚集素酶反应：阴性

22)赖氨酸脱羧：阴性

23)精氨酸二氢化酶：阳性

24)鸟氨酸脱羧：阴性

25)七叶苷水解：阴性

26)NaCl抗性：

对0％NaCl有抗性

对4％NaCl有抗性

对6％NaCl无抗性

对7％NaCl无抗性

27)酰胺酶：阴性

28)葡糖酸氧化：阴性

29)DNA酶存在：阴性

30)色素产生：

在King A培养基中：阴性

在King B培养基中：阳性

31)TW-80水解：阴性

32)在NAC培养基中生长：阳性

33)琼脂水解：阴性

34)从蔗糖产生果聚糖：阴性

35)苯丙氨酸脱氨基：阴性

36)在甲烯兰乳中生长：

甲烯兰减少：阳性

甲烯兰凝结：阴性

胨化：阴性

37)来自TSI的酸：阴性/阴性

38)在TSI培养基中产生硫化氢：阴性

39)马尿酸钠水解：阳性

40)MR试验：阴性

41)VP试验：阴性

基于上述菌学性质，按照Presumptive Identification和Berger′s Manual of Systematic Bacteriology指导手册来鉴别该菌株。鉴于鞭毛数目、于42℃下生长、水解明胶和TW-80、由海藻糖和甘露糖醇产酸等检验结果，将该菌株鉴定为臭味假单胞菌并命名为臭味假单胞菌IF-3。已按布达佩斯条约规定，将该菌株保藏在National Institute of Bioscience and Humantechnology，Agencyof Industrial Science & Technology，MITI，1-3，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken 305，Japan，其保藏登记号为FERM BP-3824。

洋葱假单胞菌BP-4282a.形态学特征：

1)革兰氏染色：阴性

2)细胞的形状和大小：短杆状，约0.7-0.8×1.0-1.3μm

3)运动性：阳性

4)鞭毛：＞1

5)孢子形成：阴性b.生理学性质：

1)O-F试验(Hugh-Leifson法)：需氧产酸

2)对氧的反应：严格好氧

3)由糖产酸：

L-***糖 +

D-木糖 +

D-葡萄糖 +

D-甘露糖 +

D-果糖 +

D-半乳糖 +

麦芽糖 +

蔗糖 +

乳糖 -

海藻糖 -

D-山梨糖醇 +

D-甘露糖醇 +

甘油 +

肌醇 -

4)过氧化氢酶试验：弱阳性

5)氧化酶试验：阳性

6)柠檬酸利用(在Koser′s培养基和Chri stensen′s培养基

中)：阳性

7)硝酸盐还原：阳性

8)热抗性(60℃×30分钟)：无抗性

9)生长温度：于9-41℃生长

10)明胶水解：阴性

11)石蕊汁反应：阴性

12)淀粉水解：阴性

13)赖氨酸脱羧：阳性

14)精氨酸二水解酶：阴性

15)鸟氨酸脱羧：阴性

16)酰胺酶：阳性

17)葡糖酸氧化：阳性

18)色素产生：

在King A培养基中：阴性

在King B培养基中：阴性

19)MR试验：阴性

20)VP试验：阴性

基于上述菌学性质，按照Bergey′s Manual of SystematicBacteriology的描述鉴别该菌株。鉴于其为革兰氏阴性菌，杆状，靠极性鞭毛有运动性、需氧性质、氧化酶阳性及可由葡萄糖产酸等检验结果，而将该菌株分类为假单胞菌属的细菌。该菌株最初定名为假单胞菌SP.188-1，并已按布达佩斯条约规定保藏在NationalInstitute of Bioscience and Human-technology，Agency ofIndustrial Sciency & Technology，MITI，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan，保藏登记号为FERMP-7073(FERM BP-4282)。

基于上述研究结果，又因其呈现阴性乌氨酸脱羧酶活性，阳性赖氨酸脱羧酶活性，阳性葡糖酸氧化酶活性，阳性酰胺酶活性，阴性精氨酸二水解酶活性及于41℃下生长等生理学性质，故将其鉴定为洋葱假单胞菌种。

另外，本发明人已从臭味假单胞菌IF-3亲代菌株得到了突变体臭味假单胞菌IF-3-9C-21。菌株IF-3-9C-21能够组成型地将咖啡碱转化成可可碱，但不能将可可碱转化成7-甲基黄嘌呤。该菌株已按布达佩斯条约规定保藏在National Institute of Bioscienceand Human-technology，Agence of Industrial Science &Technology，MITI，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan，保藏登记号为FERM BP-3825。

据认为，由假单胞菌属细菌完成的咖啡碱代谢是按下述步骤进行的(见Hoope-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，Vol.358，PP.807-817(1987))：

咖啡碱(1，3，7-三甲基黄嘌呤)

↓ 步骤1

可可碱(3，7-二甲基黄嘌呤)

↓ 步骤2

7-甲基黄嘌呤

↓ 步骤3

黄嘌呤

步骤1，2和3中，据认为酶可分别特异地释放1，3或7位上的甲基基团。但在尚不了解这些酶的分子量、等电点、氨基酸序列、氨基酸组成等蛋白质学性质的情况下，尚不能从蛋白质学上证实其存在。

为了提高上述微生物中咖啡碱脱甲基酶的活性，本发明人成功地进行了克隆咖啡碱脱甲基酶基因的尝试。

可基本上通过下述步骤得到本发明的DNA片段、重组DNA及转化的微生物。(1)制备用于咖啡碱脱甲基酶基因克隆的宿主。对能够代谢咖啡碱的臭味假单胞菌IF-3-9C进行突变处理，并分离到能同化可可碱但不能同化咖啡碱的菌株(臭味假单胞菌IF-3-19)。(2)从臭味假单胞菌IF-3(已按布达佩斯条约以保藏登记号FERMBP-3824保藏)中提取总DNA，并用适当的限制性酶(如HindIII)进行部份裂解。(3)在HindIII识别位点处将(2)中得到的DNA片段***并连接到pNI20C中，以提供重组DNA。(4)用(3)中得到的重组DNA转化(1)中得到的臭味假单胞菌IF-3-19，以提供恢复了咖啡碱同化能力的重组体菌株。(5)再克隆重组DNA，并测定此DNA片段的碱基序列，以鉴定咖啡碱脱甲基酶的编码区。(6)将含有咖啡碱脱甲基酶之整个编码区的适当大小的DNA片段(假定含有基因之启动子、终止子等的片段)整合到载体(pNI107：一种已知具有转化假单胞菌属细菌之能力的载体)中，以得到重组DNA。(7)使用(6)中得到的重组DNA转化臭味假单胞菌IF-3-9C-21(已按布达佩斯条约作为FERM BP-3825保藏)。(8)进一步证实(7)中得到的转化体转化1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤成为3-甲基-7-烷基黄嘌呤的能力。

可按照基因工程领域中使用的已知的常规方法，如Maniatis等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，cold SpringHarbor Laboratory(1989))所述的方法，很容易地完成上述重组DNA实验。可从商业途径得到用于该实验的所有的酶和试剂。除特别指出者外，只要使用为制备特定产品所规定的条件即可完全实现预期的实验目的。

例如，用于上述(2)中的DNA来源包括臭味假单胞菌IF-3(已按布达佩斯条约规定，作为FERM BP-3824保藏)和亮黄假单胞菌(Pseudomonas flavida IF-4)(已按布达佩斯条约规定作为FERMP-10865，FERM BP-4281保藏)。

亮黄假单胞菌的菌学性质如下所述。这些菌学性质是按照Society of Hygienic Technology，Japan出版的Manual of theIdentification of Medical Bacteria(MIMB)，Ideantificationof Microorganisms，和Academic Society Press Center，Japan出版的Classification and Identification of Microorganisms，Vol.II检验的。

亮黄假单胞菌IF-4a.形态学特征：

1)革兰氏染色：阴性

2)细胞的形状和大小：短杆状，约0.7-1.1×1.1-2.5μm

3)运动性：阳性

4)鞭毛：＞1

5)孢子形成：阴性b.生理学性质：

1)O-F试验(Hugh-Leifson法)：需氧产酸

2)对氧的反应：好氧

3)由糖产酸：

D-葡萄糖 +

D-木糖 +

甘露糖醇 -

乳糖 -

蔗糖 -

麦芽糖 -

海藻糖 -

D-果糖 +

4)过氧化氢酶试验：阳性

5)细胞色素氧化酶试验：阴性

6)在Mac Conkeys培养基上生长：阳性

7)在SS琼脂培养基上生长：阳性

8)柠檬酸利用：阳性

9)脲分解：阴性

10)硝酸盐还原：阴性

11)脱氮反应：阴性

12)长生温度：

5℃生长

41℃不生长

13)明胶水解：阳性

14)石蕊汁反应：碱性

15)淀粉水解：阴性

16)酪蛋白水解：阴性

17)凝集素酶反应：阴性

18)赖氨酸脱羧：阴性

19)精氨酸二水解酶：阳性

20)鸟氨酸脱羧：阴性

21)七叶苷水解：阴性

22)NaCl抗性：

对6％NaCl有抗性

23)酰胺酶：阴性

24)葡糖酸氧化：阳性

25)DNA酶：阴性

26)色素产生：

在Trypto Soy-琼脂培养基中：阳性

在King B培养基中：阳性

27)TW-80水解：阴性

28)在NAC培养基中生长：阳性

29)琼脂水解：阴性

30)从蔗糖产生果聚糖：阴性

31)苯丙氨酸脱氨基：阴性

32)来自TSI的酸：阴性/阴性

33)MP试验：阴性

34)VP试验：阴性

按照Presumptive Identification和Bergey′s Manual ofSystematic Bacterioloy中提供的分类原则，基于上述菌学性质确定菌株的类型。根据这一分析，该菌株显然属于假单胞菌属。但根据菌种鉴定情况，判定该菌株并不属于任何已知的菌种，因为在所有常规鉴定手册中部没有涉及这一菌株的性质，而且它还具有新的质粒pNI10和pNI20。基于其表面光泽而且呈黄颜色而将该菌株定名为亮黄假单胞菌(Pseudomonas flavida)IF-4。该菌株已保藏在National Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Science & Technology，MITI，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305，Japan，保藏登记号为FERM P-10865(已按布达佩斯条约规定，所给保藏号为FERMBP-4281)。

可按Saito氏方法(参见Biochem.Biophys.Acta.，Vol.72，PP.619-629(1963))从细菌中提取总DNA。

可按常规双脱氧方法(参见Proc.Nati.Acad.Sci.，USA，Vol.73，PP.5463(1977)测定(5)中所得DNA的序列。

可用来转化(3)和(6)中所得臭味假单胞菌的载体包括质粒pNI107和pNI20C参见JP-A-3-67590，JP-A-3-67591，以及Journal of Biochemistry，Vol.110 pp.614-621(1991)。

可按照Bagdasari an等人(参见Gene，Vol.16，pp.237(1981))所述方法转化臭味假单胞菌(步骤(7))。

可使用适当载体，以臭味假单胞菌以外的其他微生物作为宿主。例如，可使用J.Biochem.Vol110，PP.614-621(1991)中所述的假单胞菌属的其他种微生物。

在根据本发明生产3-甲基-7-烷基黄嘌呤的过程中，最好使用上述微生物及其转化体。具体地说，最好使用臭味假单胞菌IF-3的突变体，特别是臭味假单胞菌IF-3-9C-21及其转化体。

只要微生物能在其中生长，可用任何一种营养培养基来培养该菌株。培养基可以是含有常规成份，如除1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤以外的各种碳源、氮源、无机盐以及必要时还含有其他营养素和辅助成分(如pH调节剂、乳化剂、消泡剂等)的天然或合成培养基。除1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤以外的适当碳源包括糖如葡萄糖、木糖及阿糖：糖醇如甘油和山梨糖醇；以及有机酸如柠檬酸和延胡索酸。适当的氮源包括无机氮源如铵盐和硝酸盐，以及有机氮源如肉羹、酵母浸膏、胰蛋白胨和caltivator。适当的无机盐包括磷酸钾，氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠及硫酸亚铁。

对培养基中1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的浓度没有特殊限制，并可根据预期之3-甲基-7-烷基黄嘌呤产率和培养条件及经济效益来确定。浓度范围一般为0.1-10％，且较好是0.5-5.0％。培养可在10至40℃且pH约4.5至9.0，较好在20至30℃且pH约6.5至7.5条件下进行约5至72小时。连续提供含例如葡萄糖和木糖的碳源，以及如肉羹、醇母浸膏和谷氨酸钠的氮源的培养基，同时控制培养基中1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的浓度，以连续发生1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤向相应3-甲基-7-烷基黄嘌呤的转化(分批进料培养)。其中1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤可作为固体物或水溶液加入。

必要时可加入用于加速培养物中3-甲基-7-烷基黄嘌呤积聚的反应加速剂。这类反应加速剂的适当例子包括单甲基黄嘌呤，金属离子(如镍离子或锌离子)，咖啡碱及可可碱，但可根据培养物中所用菌株的不同而选用不同类型的加速剂。

在实施本发明中，产物可以得自如上述培养所得到的培养物本身及培养物产物，如微生物细胞、培养物滤液、破碎的细胞、冻干的细胞、用乙醇、甲苯或乙酸乙酯等溶剂提取的细胞提取物，以及固定化细胞。

当1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤与培养物或含水介质中的培养物产物接触时即可转化为相应的3-甲基-7-烷基黄嘌呤。在反应***中，即在浓度超过其溶解度时，1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤可以悬浮状态存在。可在分批进料***或在使用柱子的连续进料***中使1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤与培养物或培养物产物接触。

在上述条件下用通气方法搅拌培养物或培养物产物与1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的混合物5至80小时，以在通气条件下连续发生转化反应。可以常规方法从反应混合物中回收如此产生的3-甲基-7-烷基黄嘌呤。即必要时于离心分离后，用碱处理反应混合物，用有机溶剂除去杂质，然后调pH以得到3-甲基-7-烷基黄嘌呤沉淀物。

现借助参考实施例和实施例更详细地阐述本发明，但应明确的是这些实施例并不构成对本发明的限制。

参考实施例1

1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的合成

将600g茶碱(1，3-二甲基黄嘌呤)( Katayama KagakuKogyo K.K.的产品)溶解在1800ml含有263.4g氢氧化钾的水溶液中，并于减压条件下将溶液蒸发至干以制得茶碱的钾盐。将所得盐悬浮于3600ml二甲基甲酰胺中，向其中加入436.5ml丙基溴，然后于搅拌同时90℃加热8小时。减压下蒸馏除去二甲基甲酰胺，并向残留物中加入1800ml二氯甲烷。用300ml部分的1N氢氧化钾水溶液将混合物洗三次，再用300ml水洗一次并在54g无水硫酸镁上干燥之。过滤除去干燥剂，于减压下然后于真空下干燥母液(85℃，5小时)，得到657g(产率：88.8％)1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤。

参考实施例2

臭味假单胞菌IF-3-9C-21的制备

将臭味假单胞菌IF-3(FERM BP-3824)培养在TY培养基(Difco Co.产品；含有1.0％Bacto-胰化胨和0.5％Bacto-酵母浸膏)中达到对数生长期，离心收集微生物细胞，洗涤后悬浮于5ml50mM Tris-马来酸盐缓冲液(pH＝6.0)中。

向细胞悬浮液内加入NTG至浓度为100μg/ml，并将悬浮液于30℃下放置30分钟。经NTG处理后，用0.9％氯化钠水溶液将细胞洗两次，悬将于TY培养基中，然后于30℃振荡培养过夜。离心收集细胞，用0.9％氯化钠水溶液洗两次，并于30℃下在5ml咖啡碱基本培养基(0.3％硫酸铵，0.5％二代磷酸钾，0.1％氯化钠，0.2％七水合硫酸镁和0.1％咖啡碱；pH＝7.0)中继续培养6小时。稀释所得培养物并平铺于咖啡碱基本琼脂培养基(0.3％硫酸铵，0.5％二代磷酸钾，0.1％氯化钠，0.2％七水合硫酸镁，0.1％咖啡碱和1.5 ％琼脂；pH＝7.0)。于30℃培养2天后，筛选呈现极好生长状态之菌株的菌落。

将如此得到的各突变菌株按种于LKC培养基(1.0％Bacto-胰化胨，0.5％Bacto-酵母浸膏，0.5％氯化钠，0.5％二代磷酸钾和0.1％咖啡碱；pH＝7.0)中。30℃培养8小时后测定培养基中的咖啡碱浓度。分离与亲代菌株相比显示出使咖啡碱有较大程度减少的菌株，即为咖啡碱代谢中的组成型突变菌株，将其称为菌株9C。

以上述同样方法用NTG处理菌株9C。在含有0.3％可可碱、如上述咖啡碱基本培养基中相同之无机盐及300μg/ml羧苄青霉素的可可碱基本培养基中将收集并洗过的微生物细胞于30℃振荡培养过夜。用0.9％氯化钠水溶液将细胞洗两次，稀释并平铺于LT-琼脂培养基(1.0％ Bacto-胰化胨，0.5％Bacto-酵母浸膏，0.3％可可碱和1.5％琼脂；pH＝6.8)中，然后于30℃下培养2天以形成菌落。得到25个并不分解菌落周围之可可碱的菌落。

检验已分离之菌株同化咖啡碱、可可碱和7-甲基黄嘌呤的性质，分离只同化7-甲基黄嘌呤的菌株并定名为臭味假单胞菌IF-3-9C-21(已按布达佩斯条约规定以FERM BP-3825保藏登记号保藏)。臭味假单胞菌IF-3-9C-21菌株是组成性地同化咖啡碱但不能将可可碱转化成7-甲基黄嘌令的双突变菌株。

实施例1

将臭味假单胞菌IF-3-9C-21(已按布达佩斯条约规定以FERMBP-3825保藏登记号保藏)接种到75ml含如参考实施例1中制备的1.0％1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤、1.0％Bacto-胰化胨、0.5％Bacto-酵母浸膏和1.0％二代磷酸钾(pH＝6.7)的培养基(在500ml Sakaguchi培养瓶中)内。 0℃预培养过夜后，将1％等份的培养液分别接种到加在Sakaguchi培养瓶内的75ml上述的同样培养基中。在120rpm搅拌下于30℃培养18小时。

将检测的1700ml合并的培养物以10,000rpm离心15分钟。用盐酸将上清液调到pH6.0，于减压下浓缩，并于5℃下放置过夜。将沉淀的结晶体悬浮在450ml纯化水中，向其中加入25.2g氢氧化钾，再加入约600ml二氯甲烷，并分离出约400ml含水层。向含水层中加入盐酸以沉淀出结晶物，然后离心(12,000rpm×15分钟)回收固体物。将固体物悬浮在约100ml水中并再次离心。将回收的固体物与大约80ml乙醇混合，然后于50℃减压干燥，以得到重1.18g的制剂。

按下述方法分析一等份制剂以确定结构。(a)制剂的乙基化：

将0.2g等份的制剂溶解在1.7ml 1N氢氧化钾水溶液中，然后于减压下蒸发至干。将残留物悬浮在1.5ml二甲基甲酰胺中，并边搅拌边向其中加入0.22ml乙基溴。于90℃将混合物加热5小时，同时进行搅拌。

减压下蒸馏除去二甲基甲酰胺。将残留物溶解在30ml二氯甲烷中，用每份20ml 1N氢氧化钾水溶液洗两次并用20ml水洗一次，通过无水硫酸镁干燥，再于减压下干燥以除去二氯甲烷，最后在真空中干燥得到0.2g(产率88.1％)乙基化的制剂。(b)1-乙基-3，7-二甲基黄嘌呤的制备：

将0.9克可可碱(Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.的产品)溶解于7.5ml 1N氢氧化钾水溶液中，然后于减压下干燥。将残留物悬浮在6ml二甲基甲酰胺中，并边搅拌边向其中加入0.6ml乙基溴，然后在搅拌的同时于90℃加热8小时。

减压下蒸馏除去二甲基甲酰胺，将残留物溶解在50ml二氯甲烷中，用1N氢氧化钾水溶液洗两次(每次30ml)，再用水(30ml)洗一次，在无水硫酸镁上干燥，再于减压下干燥以除去二氯甲烷，最后真空干燥得到0.86克(产率：83％)的1-乙基-3，7-二甲基黄嘌呤。

将(a)中制得的乙基化制剂(下文中用(4)代表)的N-取代基的¹³C-NMR图谱与咖啡碱(1，3，7-三甲基黄嘌呤(下文中用(1)代表)，以及(b)中制得的1-乙基-3 ， 7-二甲基黄嘌呤(下文中用(2)代表)和参考实施例1中制得的1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤(下文中用(3)代表)的相应图谱相比较。即比较(1)、(2)和(3)之N-甲基基团的¹³C＝NMR图谱后，确定1-、3-和7-位上之N-甲基基团(下文中分别称为N₁-甲基、N₃-甲基和N₇-甲基)的化学转变(ppm)如下所示：

N₁-甲基：27.72ppm

N₃-甲基：29.37-29.54ppm

N₇-甲基：33.35-33.40ppm

然后，将(3)之N₁-甲基和N₃-甲基的化学转变(分别为27.72ppm和29.48 ppm)与(4)之N-甲基基团的化学转变(29.43ppm)相比较，证明该制剂的化合物是通过微生物转化释放N₁-甲基基团后由(3)衍生的化合物，即3-甲基-7-烷基黄嘌呤。如上确定的化学转变的结果示于下表1中。

表1

1，3，7-三 1-乙基-3，7- 1，3-二甲基-7 乙基化测定甲基黄嘌呤二甲基黄嘌呤丙基黄嘌呤的制剂CH₃CH₂CH₂(N₇) 10.62 10.62CH₃CH₂(N₁) 13.16 13.06CH₃CH₂CH₂(N₇) 23.97 23.97CH₃(N₁) 27.72 27.72CH₃(N₃) 29.54 29.37 29.48 29.43CH₃(N₇) 33.40 33.35CH₃CH₂(N₁) 36.1 9 36.30CH₃CH₂CH₂(N₇) 48.57 48.57在下述条件下进行¹³C-NMR图谱检测：样品溶液：将70mg(1)或100mg(2)、(3)或(4)加在0.5ml

CDCl₃中仪器：Japan Electron Optics Lab.Co.，Ltd.制造的JNM-

FX60Q型核磁共振仪标准：CDCl₃的化学转变，77.1ppm

实施例2

将洋葱假单胞菌FERM BP-4282接种到与实施例1中所用的有相同成分并且还含有0.01％7-甲基黄嘌呤或0.1％可可碱的培养基中。30℃预保温过夜后，将1％等份的培养液分别接种到加在Sakaguchi培养瓶内的75ml相同培养基中。于30℃用120rpm搅拌培养18小时。

使用Toso Co.，Ltd.制造的层析仪以高效液相层析法(HPLC)分析结合的培养物。结果，进一步证明同样滞留时间的峰即为用实施例1中得到的3-甲基-7-丙基黄嘌呤(制剂)所观察到的峰，此表明培养物中有3-甲基-7-丙基黄嘌呤积聚。在下述条件下进行HPLC：

柱：ODS-80TM(Toso Co.，Ltd.制造)

流动相：含有17％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液

流速：1ml/分钟

实施例3

按实施例2所述的同样方法，将溴味假单胞菌IF-3(已按布达佩斯条约规定以登记号FERM BP-3824保藏)于30℃预培养过夜，并将1％等份的培养液分别接种到75ml同样培养基(加在Sakaguchi培养瓶内)中。于30℃培养18小时，同时以120rpm搅拌。

在实施例2的同样条件下对合并的培养物进行HPLC分析的结果，进一步证实3-甲基-7-丙基黄嘌呤的生成。

实施例4

以实施例1所述的同样方法培养臭味假单胞菌IF-3-9C-21(已按布达佩斯条约规定以登记号FERM BP-3825保藏)，但不同的是培养基成分中去掉了1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤。将所得培养液与1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤混合，并在实施例2所述的同样条件下用HPLC法分析混合物。结果进一步证实了3-甲基-7-丙基黄嘌呤的产生。

实施例5分离来源于咖啡碱代谢菌的咖啡碱脱甲基酶基因(1)咖啡碱脱甲基酶缺陷突变体的制备

在TY培养基(1.0％Bacto-胰化胨和0.5％Bacto-酵母浸膏)中培养具有组成性地同化咖啡碱能力并得自亲代菌株IF-3(已按布达佩斯条约规定作为FERM BP-3824号菌株保藏)的臭味假单胞菌突变菌抹IF-3-9C，使之生长到对期生长期。离心收集微生物细胞，洗涤，并悬浮在5ml 50mM Tris-马来酸盐缓冲液(pH-6.0)中。

向细胞悬将液中加入NTG至终浓度为100μg/ml，并将悬浮液在30℃放置30分钟。经NTG处理后，用0.9％氯化钠水溶液洗细胞两次.然后在已加入了终浓度为500μg/ml的羧苄青霉素的咖啡碱基本培养基(0.3％咖啡碱，0.3％硫酸铵，0.5％二代磷酸钾，0.1％氯化钠和0.2％七水合硫酸镁；pH＝7.0)中30℃振荡培养过夜。用0.9％氯化钠水溶液将收集的细胞洗两次。

将洗过的细胞悬浮在1ml 0.9％氯化钠水溶液中，适当稀释并平铺在LT-琼脂培养基(1％Bacto-胰化胨和0.5％Bacto-酵母浸膏)上。在LT-琼脂培养基30℃培养1天后，将菌落影印在咖啡碱基本培养基上。30℃培养2天后，检查在咖啡碱基本培养基上生长状态不好之菌株同化咖啡碱、可可碱及7-甲基黄嘌呤的能力，并得到可同化可可碱和7-甲基黄嘌呤但不同化咖啡碱的突变菌株IF-3-19。

臭味假单胞菌IF-3-19是不能将咖啡碱转化成可可碱的突变菌株，即咖啡碱脱甲基酶缺陷型突变株。(2)克隆咖啡碱脱甲基酶基因：

按Saito和Miura所述方法(参见Biochem.Biophys.Acta，Vol.72，PP.619-629(1963))制备臭味假单胞菌IF-3(已按布达佩斯条约规定作为FERM BP-3824号菌株保藏)或亮黄假单胞菌IF-4(已按布达佩斯条约规定作为FERM P-10865，FERM BP-4281号菌株保藏)的总DNA。用Hind III切割所得总DNA得到DNA片段(约1μg)。使用T4 DNA连接酶将已切割的片段连接到已用HindIII消化并已去磷酸化的克隆载体pNI20C(约2μg)上。

用所得重组质粒DNA转化咖啡碱脱甲基酶缺陷型臭味假单胞菌IF-3-19，并将其涂布于含有25μg/ml卡那霉素的咖啡碱基本琼脂培养基上。

30℃培养2天后，得到4个含有源于具味假单胞菌IF-3之基因的转化体菌株和3个含有源于亮黄假单胞菌IF-4之基因的转化体菌株。

从各转化体菌株制备质粒并用HindIII消化。经琼脂糖冻凝胶电泳进一步证实酶裂解图形。表明所有这些菌株都共同具有如图1中所示的用HindIII切割的来自2.4kb和4.3kb DNA片段的DNA片段。

(3)再克隆咖啡碱脱甲基酶基因并确定其位置：

将(2)中制得的质粒之一定名为pTF1。用不同的限制性酶切割pTF1并进行琼脂糖凝胶电泳分析，以制得包括图1所示的被***的6.7Kb DNA片段的限制性核酸内切酶酶切图。为了确定存在于该片段中的咖啡碱脱甲基酶编码区，然后将用限制性酶消化的各不同的DNA片段***并连接到pNI107中以制备重组DNA，并用该重组DNA转化臭味假单胞菌IF-3-19。结果得到用AccI和NdeI切下的并使IF-3-19恢复了咖啡碱同化性质的约1.7Kb DNA片段。将携带该DNA片段的质粒称为pCA32A。(4)进一步证实存在于pCA32A中的咖啡碱脱甲基酶基因：

为了证实上述直到(3)的步骤中制得的***到pCA32A中的DNA片段编码咖啡碱脱氢酶这一事实，将pCA32A引入没有同化咖啡碱之性质的臭味假单胞菌ATCC8209中，并检验所得重组体是否能将咖啡碱转化成可可碱。具体方法如下所述。

将上述(3)中制得的pCA32A引入没有咖啡碱同化作用即没有能力同化咖啡碱、可可碱和7-甲基黄嘌呤中任何一种物质的臭味假单胞菌ATCC8209中，得到转化体8209/pCA32A。

将所得各转化体菌株分别接种到5ml TYKG培养基(1.5％Bacto-胰化胨、0.75％Bacto-酵母浸膏、0.5％二代磷酸钾、0.2％葡萄糖和25μg/ml卡那霉素；pH＝6.7)中并于30℃振荡培养8小时。取0.5ml等分的培养液接种于分别加在10个500ml Sakaguchi培养瓶内的50ml TYKG培养基中，然后于30℃振荡培养16小时。

合并所得培养物(500ml)并以7,000rpm离心10分钟。用20mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)洗涤如此收集的微生物细胞，并悬浮于30ml同样缓冲液中。

向细胞悬浮液(0.5ml)内加入105μl100mM咖啡碱水溶液，210μl50mM NADH水溶液、50μl0.8M磷酸钠缓冲液和1135ml水，并使此***于25℃反应16小时。将475μl等份的反应混合物加至25μl50％三氯乙酸水溶液中以终止反应。离心该混合物，于下述条件下经HPLC测定上清液中的咖啡碱和可可碱含量，以估计咖啡碱脱甲基酶活性。所得结果示于表2中。

柱：ODS-80TM，TOSO Co.，Ltd.制造

流动相：含17％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液

流速：1ml/分钟

检测：272nm

表2

反应时间

0小时 17小时转化体菌株咖啡碱可可碱咖啡碱可可碱

(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)臭味假单胞菌 0.94 0 0.94 0ATCC 8209/pNI107臭味假单胞菌 0.938 0 0.763 0.160ATCC8209/pCA32A

如表2中所示，已被质粒载体pNI107转化的菌株不产生可可碱，而带有pCA32A的ATCC8209的转化体则可转化18.6％的咖啡碱底物以产生0.16克/升可可碱。这些结果证明被***的pCA32A的DNA片段含有咖啡碱脱甲基酶基因。(5)测定咖啡碱脱甲基酶基因的序列：

按照Sanger方法测定已***至pCA32A中之约1.7Kb的AccI-NdeI DNA片段的碱基序列。更具体地说，用Klenow片段将已用AccI和NdeI切割DNA片段的末端修成平端并在SmaI只别位点处***pUC118中，以得到***方向上有所不同的质粒118A和118B。

借助Takara Shuzo Co.，Ltd.生产的缺失药盒从所得质粒中逐步缺失被***的DNA，以制备不同质粒。借助Applied BiosystemsCo.生产的序列药盒，使用各缺失质粒作模板合成互补DNA。用DNA序列仪读出碱基序列。结果发现，在上述DNA片段中只有一个开放阅读框架。

在SEQ ID NO：1中，显示了包含有咖啡碱脱甲基酶基因之DNA的AccI和NdeI间的DNA碱基序列(1686bp)。在碱基各三联子下方还示出了推测的咖啡碱脱甲基酶的氨基酸序列。

实施例6用pCA32A转化体从1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤生产3-甲基-7-烷基黄嘌呤

用pCA32A转化臭味假单胞菌I F-3-9C-21(已按布达佩斯条约作为FERM BP-3825号样品保藏)，以得到臭味假单胞菌IF-3-9C-21/pCA32A。

将臭味假单胞菌IF-3-9C-21/pCA32A接种到75ml含0.5％肉浸膏(由Kyokuto Seiyaku Kogyo Co.，Ltd.生产)，0.3％MeastPIG(由Asahi Breweries，Ltd.生产)和0.3％二代磷酸钾的培养基中(在500ml Sakaguchi培养瓶内)，并于20℃下预培养16小时。在5升小罐内放入2升上述培养基，并向其中加入0.5％1，3-二甲基-7-乙基黄嘌呤，1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤或1，2-二甲基-7-丁基黄嘌呤。将1％预培养液接种到已制备的培养基中并培养24-48小时，其中前7小时温度控制在30℃，然后于25℃下以1V.V.m通气量继续培养，此期间借助带有6个叶片的扁平型叶轮搅拌器以600rpm进行搅拌。从培养开始4小时后，将培养物的pH控制在6.6和6.8之间并开始供应有下列组成的培养基。

待进料的培养基组成

葡萄糖 17％

谷氨酸钠 2％

肉浸膏 4％

Meast PIG 4％

如下列表3所示，在各培养物中测得有相应1-脱甲基化合物的产生。

表3底物底物浓度培养时间产物产物浓度

(mg/ml) (小时) (mg/ml)1，3-二甲基-7- 5.20 24 3-二甲基-7- 4.85乙基黄嘌呤乙基黄嘌呤1，3-二甲基-7- 5.26 24 3-甲基-7- 4.98丙基黄嘌呤丙基黄嘌呤1，3-二甲基-7- 4.20 48 3-甲基-7- 1.80丁基黄嘌呤丁基黄嘌呤

实施例7用臭味假单胞菌IF-3-9C-21/pCA32A将咖啡碱转化成可可碱并将1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤转化成3-甲基-7-丙基黄嘌呤

将臭味假单胞菌IF-3-9C-21和臭味假单胞菌IF-3-9C-21/pCA32A分别在75ml含有0.5％肉浸膏、0.3％Meast PIG和0.3％二代磷酸钾的培养基(pH6.7)(在500ml Sakaguchi培养瓶)中30℃振荡培养过夜。其中用于转化体菌株的培养基还另外含有25μg/ml卡那霉素。

将1％所得预培养物接种到3升含0.5％肉浸膏、0.1％葡萄糖和0.3％Meast PIG并且另外还含有0.5％咖啡碱或1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤的培养基中，并在控制的温度下培养50小时，前7小时温度控制在30℃，然后于25℃及1V.V.m通气条件下培养，同时借助带有6个叶片的扁平型叶轮搅拌器以600rpm搅拌之。从培养开始4小时后将培养物的pH控制在6.6和6.8之前，并从同一时间点以12ml/小时的速率开始供入含有25％葡萄糖、6％肉浸膏、6％Meast P1G、3％谷氨酸钠和1.0％咖啡碱或1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤的培养基。

定时测定培养物中咖啡碱或1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤的浓度，并适当加入这些底物以便将各自的浓度控制在0.5和2.5mg/ml之间。

如此使1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤转化成相应的3-甲基-7-烷基黄嘌呤。转化反应的结果示于图2中。可以看出，在使用名底物(咖啡碱或1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤)的反应中，带有pCA32A的转化体菌株即臭味假单胞菌IF-3-9C-21/pCA32A能够以2至4倍于臭味假单胞菌IF-3-9C-21的产生量产生相应的转化产物(分别为可可碱或3-甲基-7-丙基黄嘌呤)。

测定培养结束时底物和产物的量。结果可见，在使用臭味假单胞菌IF-3-9C-21/pCA32A并以咖啡碱作底物的***中，在长达50小时时间所加咖啡碱的积聚量为535克，而随着产生414克可可碱所余咖啡碱的残留量为90克，表明咖啡碱转化为可可碱的转化率为98.9％。而在使用同样菌株并以1，2-二甲基-7-丙基黄嘌呤作为底物的***中，在长达50小时时间里所加底物的积聚量为390克，而随着产生262克3-甲基-7-丙基黄嘌呤，所余残留底物的量为63克，此表明1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤转化为3-甲基-7-丙基黄嘌呤的转化率为97％。

根据本发明，可在含有1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的营养培养基中培养能产生3-甲基-7-烷基黄嘌呤的微生物或其突变体，以在培养物中产生并积聚3-甲基-7-烷基黄嘌呤，并从培养物中回收该产物，从而有效地并以低成本制得作为成药之重要中间产物的3-甲基-7-烷基黄嘌呤。

本发明提供了含有咖啡碱脱甲基酶基因的DNA片段，基于该DNA片段有可能提供具有增加了在1位上催化咖啡碱脱甲基之咖啡碱脱甲基酶活性的新的臭味假单胞菌菌株。使用该新的臭味假单胞菌菌株即有可能以进-步提高的效率从相应的1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤产生3-甲基-7-烷基黄嘌呤。

虽然本文已对本发明作了详细描述并给出了特定实施例，但显然本领域技术人员可在不背离本发明糖神和范围的前提下对本发明作出各种改变和改动。

序列-览表(1)一般资料：

(i)申请人：Yoshinao，Koide

Seiji，Nakane

Yutaka，Imai

(ii)发明名称：含有咖啡碱脱甲基酶基因的DNA片段和生产

3-甲基-7-烷基黄嘌呤的微生物方法

(iii)序列数：2

(iv)通信地址：

(A)地址：SUGHRUE，MION，ZTNN，MACPEAK & SEAS

(B)街道：2100 Pennsylvania Avenue

(C)城市：N.W.

(D)州：Washington，D.C.

(E)国家：U.S.A.

(F)邮编：20037-3202

(v)计算机可读形式：

(A)基质类型：Floppy盘

(B)计算机：IBM PC相容性

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release#1.O，Version#1.25

(vi)目前申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类号：

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：JP4-154380

(B)申请日：20，5，1992

(viii)在先申请资料：

(A)申请号：JP 4-312954

(B)申请日：27，10，1992

(ix)电信资料：

(A)电话：202-293-7060

(B)传真：202-293-7860

(C)电传：6491103(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1686碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双股

(D)结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)定位：476..1528

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GTAGACTGTC TTTACGCCCC GCACATTCTC TATCGTAAAA ATTTCCACGC TGAGCCCACG 60CTAATTTAAT CAAGTCTCAT TCAACTGAGC CGCACAGCCG CGTGTCATTG AGTGATCACC 120GGCAGTAACA TTTTACGGCT GAGCGGCTTG CAGCAATGTT TCTTTTATGC ACCAAACTCG 180CCCACCTAAT GCACTAAATC GAACCATTAA AAACTTAGCT AATACTCTAA AATCTATTGG 240ATTTGACCAC TTACATTTTT AACCGTCCAG AGCCTATCCG AAGTTGACAC GCGGGTCAGA 300AATGGCCTAT TTTTTCTTTG TGTACCAGAT GATAAATCTG ATGTACCAGC CGTATGATTG 360GCGTAAATAC ACCATTACCA AGTGTTTACC CTTTCTATGA GTAGATGTAG GAGACAGGGC 420ACTCAGCTGA GTTGAGTGTT CATACATAAC AACGTCATCC ACAAAGGCTA CATACATG 478

Met

1GAA CAG ACA ATC AAT AAC AAC GAT CGC GAG TAC CTT CGG CAC TTT TGG 526Glu Gln Thr Ile Asn Asn Asn Asp Arg Glu Tyr Leu Arg His Phe Trp

5 10 15CAT CCC GTC TGT ACA GTG ACA GAA CTG GAA AAG GCC CAC CCC TCC AGC 574His Pro Val Cys Thr Val Thr Glu Leu Glu Lys Ala His Pro Ser Ser

20 25 30

CTA GGC CCA ATA GGG GTG AAG CTT CTA AAT GAG CAA TTG GTT GTT GCT 622Leu Gly Pro Ile Gly Val Lys Leu Leu Asn Glu Gln Leu Val Val Ala

35 40 45AAA CTT AGT GGC CAA TAC GTC GCA ATG CAT GAT CGC TGC GCA CAT CGG 670Lys Leu Ser Gly Gln Tyr Val Ala Met Mis Asp Arg Cys Ala His Arg50 55 60 65TCG GCA AAG CTC TCC CTG GGC ACC ATC GCT AAT GAT CGA CTG CAA TGC 718Ser Ala Lys Leu Ser Leu Gly Thr Ile Ala Asn Asp Arg Leu Gln Cys

70 75 80CCT TAT CAT GGG TGG CAG TAC GAC ACG GAA GGT GCA TGT AAA CTA GTG 766Pro Tyr His Gly Trp Gln Tyr Asp Thr Glu Gly Ala Cys Lys Leu Val

85 90 95CCG GCG TGC CCC AAC AGC CCC ATT CCT AAT CGA GCT AAA GTT CAG CGA 814Pro Ala Cys Pro Asn Ser Pro Ile Pro Asn Arg Ala Lys Val Gln Arg

100 105 110TTC GAT TGT GAA GAG CGG TAC GGT CTG ATT TGG GTA AGG CTG GAC TCA 862Phe Asp Cys Glu Glu Arg Tyr Gly Leu Ile Trp Val Arg Leu Asp Ser

115 120 125AGT TAT GCT TGC ACT GAG ATC CCA TAC TTC AGT GCA GCA AGC GAT CCG 910Ser Tyr Ala Cys Thr Glu Ile Pro Tyr Phe Ser Ala Ala Ser Asp Pro130 135 140 145AAA CTT CGA GTC GTG ATC CAA GAA CCC TAT TGG TGG AAC GCA ACA GCA 958Lys Leu Arg Val Val Ile Gln Glu Pro Tyr Trp Trp Asn Ala Thr Ala

150 155 160GAG CGA CGT TGG GAA AAC TTT ACA GAC TTT TCC CAT TTT GCG TTT ATC 1006Glu Arg Arg Trp Glu Asn Phe Thr Asp Phe Ser His Phe Ala Phe Ile

165 170 175CAC CCT GGC ACG CTG TTT GAT CCT AAC AAC GCG GAA CCG CCG ATC GTA 1054His Pro Gly Thr Leu Phe Asp Pro Asn Asn Ala Glu Pro Pro Ile Val

180 185 190

A~ 1CCG ATG GAT CGT TTT AAT GGC CAA TTC CGT TTC GTT TAC GAT ACC CCG 1102Pro Met Asp Arg Phe Asn Gly Gln Phe Arg Phe Val Tyr Asp Thr Pro

195 200 205GAA GAT ATG GCC GTT CCA GAT CAA GCC CCA ATT GGG TCG TTC TCT TAT 1150Glu Asp Met Ala Val Pro Asp Gln Ala Pro Ile Gly Ser Phe Ser Tyr210 215 220 225ACC TGC AGC ATG CCC TTC GCT ATC AAT CTG GAA GTC GCT AAG TAC TCA 1198Thr Cys Ser Met Pro Phe Ala Ile Asn Leu Glu Val Ala Lys Tyr Ser

230 235 240AGC AAT TCA TTG CAT GTG CTT TTC AAC GTG TCA TGC CCA GTT GAC GAT 1246Ser Asn Ser Leu His Val Leu Phe Asn Val Sar Cys Pro Val Asp Asp

245 250 255AGC ACT ACC AAG AAC TTC TTG CTG TTC GCA AGG GAG CAG GCT GAC GAT 1294Ser Thr Thr Lys Asn Phe Leu Leu Phe Ala Arg Glu Gln Ala Asp Asp

260 265 270TCA GAT TAT CTT CAC ATT GCA TTT AAT GAT TTA GTC TTT GCT GAA GAT 1342Ser Asp Tyr Leu His Ile Ala Phe Asn Asp Leu Val Phe Ala Glu Asp

275 280 285

AAG CCT GTG ATC GAG TCT CAA TGG CCG AAG GAT GCT CCG GCT GAT GAA 1390Lys Pro Val Ile Glu Ser Gln Trp Pro Lys Asp Ala Pro Ala Asp Glu290 295 300 305GTT TCG GTT GTC GCG GAT AAA GTC TCG ATC CAG TAT AGA AAA TGG CTG 1438Val Ser Val Val Ala Asp Lys Val Ser Ile Gln Tyr Arg Lys Trp Leu

310 315 320

CGG GAA CTG AAA GAG GCC CAT CAA GAC GGT GCT CAG GCT TTC CGT AGT 1486Arg Glu Leu Lys Glu Ala His Gln Asp Gly Ala Gln Ala Phe Arg Ser

325 330 335GCG TTG CTG GAC TCC GTG ATC GAG AGC GAT CGA AGC TAC ACC 1528Ala Leu Leu Asp Ser Val Ile Glu Ser Asp Arg Ser Tyr Thr

340 345 350TAACATTTGC GTATGAGGGT GGCGCACTGC GCCTTTTTTT TTAGGGTCAA AAAAAGACGG 1588CCTCCTAGGA GGCCGTAAAC TCGCTACGTC CAACTCGTAT TAGGGCTTCT TGAATGAATA 1648GACAGCCAAT TTGTTCCCGT CGAGATCGCG CACATATG 1686(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i) 序列特征：

(A)长度：351个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Glu Gln Thr Ile Asn Asn Asn Asp Arg Glu Tyr Leu Arg His Phe1 5 10 15Trp His Pro Val Cys Thr Val Thr Glu Leu Glu Lys Ala His Pro Ser

20 25 30Ser Leu Gly Pro Ile Gly Val Lys Leu Leu Asn Glu Gln Leu Val Val

35 40 45Ala Lys Leu Ser Gly Gln Tyr Val Ala Met His Asp Arg Cys Ala His

50 55 60Arg Ser Ala Lys Leu Ser Leu Gly Thr Ile Ala Asn Asp Arg Leu Gln65 70 75 80Cys Pro Tyr His Gly Trp Gln Tyr Asp Thr Glu Gly Ala Cys Lys Leu

85 90 95Val Pro Ala Cys Pro Asn Ser Pro Ile Pro Asn Arg Ala Lys Val Gln

100 105 110Arg Phe Asp Cys Glu Glu Arg Tyr Gly Leu Ile Trp Val Arg Leu Asp

115 120 125Ser Ser Tyr Ala Cys Thr Glu Ile Pro Tyr Phe Ser Ala Ala Ser Asp

130 135 140Pro Lys Leu Arg Val Val Ile Gln Glu Pro Tyr Trp Trp Asn Ala Thr145 150 155 160Ala Glu Arg Arg Trp Glu Asn Phe Thr Asp Phe Ser His Phe Ala Phe

165 170 175Ile His Pro Gly Thr Leu Phe Asp Pro Asn Asn Ala Glu Pro Pro Ile

180 l85 190Val Pro Met Asp Arg Phe Asn Gly Gln Phe Arg Phe Val Tyr Asp Thr

195 200 205Pro Glu Asp Met Ala Val Pro Asp Gln Ala Pro Ile Gly Ser Phe Ser

210 215 220Tyr Thr Cys Ser Met Pro Phe Ala Ile Asn Leu Glu Val Ala Lys Tyr225 230 235 240Ser Ser Asn Ser Leu His Val Leu Phe Asn Val Ser Cys Pro Val Asp

245 250 255Asp Ser Thr Thr Lys Asn Phe Leu Leu Phe Ala Arg Glu Gln Ala Asp

260 265 270Asp Ser Asp Tyr Leu His Ile Ala Phe Asn Asp Leu Val Phe Ala Glu

275 280 285Asp Lys Pro Val Ile Glu Ser Gln Trp Pro Lys Asp Ala Pro Ala Asp

290 295 300Glu Val Ser Val Val Ala Asp Lys Val Ser Ile Gln Tyr Arg Lys Trp305 310 315 320Leu Arg Glu Leu Lys Glu Ala His Gln Asp Gly Ala Gln Ala Phe Arg

325 330 335Ser Ala Leu Leu Asp Ser Val Ile Glu Ser Asp Arg Ser Tyr Thr

340 345 350

Claims

1.生产由式(II)代表的3-甲基-7-烷基黄嘌呤的方法，——其中R代表直链或分支链烷基基团——

该方法包括在含有由式(I)代表的1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤

——其中R定义同上——的营养培养基中培养用重组DNA转化的宿主的假单胞菌属转化体，以培养物中产生3-甲基-7-烷基黄嘌呤并从培养物中回收所产生的3-甲基-7-烷基黄嘌呤。

2.生产由式(II)代表的3-甲基-7-烷基黄嘌呤的方法

——其中R代表直链或分支链烷基基团——，该方法包括使由式(I)代表的1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤

——其中R的定义同上——与用重组DNA转化的宿主的假单胞菌属的转化体的培养物、微生物细胞或其经处理的产物接触，以产生3-甲基-7-烷基黄嘌呤，并从反应混合物中回收所产生的3-甲基-7-烷基黄嘌呤。

3.根据权利要求1或2的方法，其中R是C₁-C₄烷基基团。

4.生产由式(II)代表的3-甲基-7-丙基黄嘌呤的方法，该方法包括在含有由式(I)代表的1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤

的营养培养基中培养能够将1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤转化成3-甲基-7-丙基黄嘌呤的假单胞菌属的微生物或其突变体，以在培养物中产生式(II)的3-甲基-7-丙基黄嘌呤并从培养物中回收所产生的式(II)的3-甲基-7-丙基黄嘌呤。

5.生产由式(II)代表的3-甲基-7-丙基黄嘌呤的方法，该方法包括在含有由式(I)代表的1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤

与能够将1，3-二甲基-7-丙基黄嘌呤转化成3-甲基-7-丙基黄嘌呤的假单胞菌属微生物的培养物、微生物细胞或其经处理的产物接触，以产生式(II)的3-甲基-7-丙基黄嘌呤，并从反应混合物中回收所产生的式(II)的3-甲基-7-丙基黄嘌呤。

6.根据权利要求4或5的方法，其中所说的微生物是臭味假单胞菌。

7.根据权利要求6的方法，其中所说的微生物是臭味假单胞菌IF-3-9C-21(FERMBP-3825)。