CN105524955A - 一种生物法制备可可碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物法制备可可碱的方法，所述方法是通过分子生物学手段获得C1咖啡因脱甲基化酶CDMw及其突变体CDMm，利用所述的C1咖啡因脱甲基化酶CDMw或其突变体CDMm，催化咖啡因底物的C1位脱甲基化，从而生成可可碱。本发明的催化反应体系具备成分简单，无毒性化学试剂污染，利于产物可可碱的分离和纯化等优点，提高了可可碱的转化率和收率，降低了生产成本。

Description

一种生物法制备可可碱的方法

技术领域

本发明涉及生物药物技术领域，尤其涉及一种生物法制备可可碱的方法。

背景技术

可可碱(Theobromine；3,7-Dimethylxanthine)为甲基黄嘌呤类生物碱，别名：3,7-二甲基黄嘌呤。化学名称：3,7-二氢-3,7-二甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮。存在于可可树和巧克力中。同属这一类的还有茶碱和咖啡因。白色单斜形针状结晶性粉末。微溶于水、中度溶于胺，不溶于苯、醚、四氯化碳和氯仿。溶于碱、浓酸和20％碱式磷酸钠水溶液。与咖啡因的区别在于1位是否甲基化。可可碱具有较强和持久的利尿作用,有较强的扩张冠状动脉、兴奋心肌及松弛气管平滑肌的作用,对中枢的兴奋作用较弱。对横纹肌有直接作用,具有增高肌肉的兴奋性,增强骨骼肌的机能。可可碱在国内主要作为复方制剂销售，可以制成止咳平喘类药物：复方茶碱片和肺宝三效片，其中复方茶碱片所占份额最大。

可可碱的主要功效体现在以下几个方面：1、强效的减肥原料。2、磷酸二酯酶抑制剂，弱腺苷受体拮抗剂，平滑肌松弛剂。3、利尿、心肌兴奋、血管舒张、平滑肌松弛等作用。

可可碱的生产方法主要是化学法。如下所述：1、一甲脲法生产可可碱：主要涉及到缩合、环合等多个步骤的全化学合成反应，会有甲基黄嘌呤以及丙酮等副产物产生。反应过程中废水排放量高，环保压力巨大。化学反应步骤较多，其中缩合、环合、亚化收率约为75％，还原、酰化闭环收率为75％，甲化收率75％，精制收率为85％。该方法为目前可可碱生产主流方法，成本较高。2、咖啡因法生产可可碱：以咖啡因为底物生产可可碱的方法涉及到2步化学开环反应，中间产物生成咖啡啶(油状)，会有分层现象。最终产物中有一定数量的咖啡因污染到产物可可碱中去，需要再次分离等步骤。此方法毒性大，成本高，收率为48％。

目前国内外关于生物法、酶法合成可可碱的相关报道很少。CN1088259A公开了从假单胞菌菌中分离出来的一段具有咖啡因脱甲基化酶的DNA片段。通过将该片段中编码的基因在重新转化回敲除该基因的原始假单胞菌的方法来验证其脱甲基酶活性。但是未表明此条基因在大肠杆菌表达***中表达与活性情况。CN1495261A公开了一种咖啡因生物合成体系基因组的联合利用，其要求保护一种生产7-甲基黄嘌呤、可可碱或咖啡因的方法，该方法保护一种由黄嘌呤底物基因串联合成可可碱以及咖啡因的方法。2012年RyanM.Summers等从实验室分离的P.putidaCBB5菌株中克隆到一系列的黄嘌呤代谢途径相关基因，并初步对其表达活性进行研究，随后申请专利。CN1143115A公开了一种生产3-甲基-7-烷基黄嘌呤的微生物方法，其要求保护生产由式(II)代表的3-甲基-7-烷基黄嘌呤的方法，该方法包括在含有由式(I)代表的1，3-二甲基-7-烷基黄嘌呤的营养培养基中培养用重组DNA转化的宿主的假单胞菌属转化体，以培养物中产生3-甲基-7-烷基黄嘌呤并从培养物中回收所产生的3-甲基-7-烷基黄嘌呤。

酶法合成可可碱理论可行，但由于咖啡因脱甲基化酶的特殊反应需求：其需要耦合专一配对的还原酶对其进行供氢研究并大量消耗辅酶NADH，作为单加氧酶是需要氧气参与反应。去甲基化酶与还原酶含有一个或多个Fe-S中心簇，常规分离表达困难，并且耦合辅酶循环用酶对其整个催化体系要求更高。因而无法直接应用于实际工业化生产转化研究。

生物法生产虽然对技术以及设备要求高。但由于此方法具有环保压力小、反应专一性高、产物分离纯化容易突出等优势已经成为未来可可碱研发生产的主流方向。其中筛选、构建出可以应用于工业化生产的高活性、基因工程菌株，降低生产成本更显得尤为重要。研发关键在于寻找到可以应用于工业化生产的含有高活性、高专一性C1位咖啡因脱甲基酶基因菌株，并进一步提高底物浓度获得最佳可可碱转化率与收率，提高酶活力，降低生产成本。最终实现利用基因工程大肠杆菌全细胞代谢耦合的方法制备可可碱。

发明内容

本发明提供了一种生物法制备可可碱的方法，本发明利用分子生物学手段，开发了一种利用基因工程大肠杆菌全细胞生物法催化咖啡因去甲基化生成可可碱的方法。该方法在极大程度上提高了可可碱的表达量与酶活力。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种生物法制备可可碱的方法，所述方法是在C1咖啡因脱甲基化酶CDMw或其突变体CDMm的催化作用下，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱。

本发明中，所述C1咖啡因脱甲基化酶CDMw具有如序列表的序列号1所示的核酸序列。

本发明中，所述C1咖啡因脱甲基化酶突变体序列CDMm具有如序列表的序列号2所示的氨基酸序列。

作为优选的技术方案，本发明所述的制备可可碱的方法包括：利用含有C1咖啡因脱甲基化酶CDMw或其突变体CDMm的基因工程重组菌，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱。

作为任选的技术方案，本发明所述的制备可可碱的方法包括：利用含有辅酶循环用酶和C1咖啡因脱甲基化酶CDMw和/或其突变体CDMm的基因工程重组菌，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱。

本发明中，所述基因工程重组菌中咖啡因脱甲基化酶基因来源优选但不限于假单胞菌，例如还可以是枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌等等。

优选地，所述辅酶循环用酶为葡萄糖脱氢酶，底物为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

本发明中，所述基因工程重组菌的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母、假单胞菌等，优选但不限于上述宿主细胞。由于咖啡因脱甲基化酶在不同宿主细胞中酶活力表现差异较大，因而优选酶活力最高的大肠杆菌。

本发明中，所述C1咖啡因脱甲基化酶CDMw或其突变体CDMm的表达载体包括PET-22b、pET-28a(+)、pET-29a、pwb980、pA0815或Ppic9k等等。例如可以采用包括所有含有必须表达元件(启动子、多克隆位点、终止子等)的任何载体，例如Novagen公司的原核表达pET系列的氨苄抗性载体、枯草芽孢杆菌表达载体pwb980、毕赤酵母表达载体pAO815，pPIC9k等等以及多种***质粒。

作为进一步优选的技术方案，本发明所述的制备可可碱的方法可以为：利用C1咖啡因脱甲基化酶CDMw或其突变体序列CDMm与大肠杆菌自身电子传递链耦合配合的大肠杆菌，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱。

作为任选的技术方案，本发明所述的制备可可碱的方法还可以为：利用含有辅酶循环用酶GH和C1咖啡因脱甲基化酶CDMw和/或其突变体序列CDMm多基因串联与大肠杆菌自身电子传递链耦合配合的大肠杆菌，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱。

本发明中，C1脱甲基化酶CDMw、CDMm、GH与全细胞耦合方式可以通过其他类型的基因串联方式耦合，例如可以是：不同的基因串联顺序，不同的RBS序列类型等，达到基因串联重组表达的最终目的。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明的催化反应体系具备成分较为简单，无毒性化学试剂污染，利于产物可可碱的分离和纯化等优点，提高了可可碱的转化率和收率，其中，可可碱的转化率可以达到85％，为生物法催化咖啡因生产可可碱路线奠定基础。

附图说明

图1是C1咖啡因脱甲基化酶CDMw的琼脂凝胶电泳图谱；

其中，图1中M1为Trans2KMarker，从上到下大小(bp)分别为100、250、500、750、1000、2000、3000、5000、8000；图1-A中：1为CDMw基因PCR扩增条带，与预测大小一致(1056bp)；2为GH基因PCR扩增条带，与预测大小一致(786bp)。图1-B中：3为pET29a-CDMw重组质粒；4为pET29a-CDMw重组质粒酶切鉴定结果，从上到下大小(bp)分别为目的片段CDMw和酶切后载体pET29a；5为pET29a-CDMm-GH重组质粒；6为pET29a-CDMm-GH重组质粒酶切鉴定结果，从上到下大小(bp)分别为目的片段GH、CDMm以及酶切后载体pET29a；

图2是C1咖啡因脱甲基化酶CDMw重组后的SDS-PAGE电泳图谱；

其中，图2-A是CDMw基因重组表达结果，图2-B是CDMm基因表达条件优化后重组表达结果，图2-C是CDMm基因与GH基因串联重组表达结果；图2中M2为蛋白marker图，从上到下大小(kD)分别为97.2、66.4、44.3、29.0、21.0、14.3；图2-A中：1为pET29a-CDMw大肠杆菌重组菌株22度诱导后裂解上清；2为pET29a-CDMw大肠杆菌重组菌株20度诱导后裂解上清；3为对应包涵体沉淀，目的蛋白与预测大小一致(约为38.6kD)；图2-B中：4为pET29a-CDMm大肠杆菌重组菌株诱导前裂解上清；5为pET29a-CDMm大肠杆菌重组菌株诱导后裂解上清；6为对应包涵体沉淀；图2-C中：7为不含重组质粒的大肠杆菌重组菌株诱导后裂解上清；8为pET29a-CDMm-GH大肠杆菌重组菌株22度诱导后裂解上清；9为pET29a-CDMm-GH大肠杆菌重组菌株20度诱导后裂解上清，与预测大小一致(约分别为38.6、28.8kD)；

图3是本发明的生物法转化可可碱技术原理图；

其中，矩形框代表大肠杆菌菌体，底物咖啡因以及产物可可碱通过进出菌体方式实现催化转化；图中所示的CDM可以为CDMw(野生型)或CDMm(突变体)；

图4是不同工程菌株反应16h时的可可碱转化率；

图5是不同参数对咖啡因的转化率影响；

其中，正常1反应的反应体系为：反应时间2h，反应体系参见实施例2，实施例5，其余a、b、c柱形图分别显示欠缺组分；

图6是pET29a-CDMm-GH菌株摇瓶小试反应，不同时间点反应液适当稀释后HPLC图谱；

其中，图6中咖啡因的保留时间为8.48-8.5分钟，可可碱的保留时间为6.16-6.18分钟；图6-A为反应开始0.5h；图6-B为反应16h时取样；此时未见底物咖啡因已经完全转化生成可可碱；图6-A：反应起始时前端5.030分钟大峰主要成分为前期添加少量NADH；图6-B：后期16h图谱中5.437分钟峰为全细胞催化后残余蛋白成分或杂质，其大小随催化作用时间延长而增大；该物质非咖啡因代谢来源。前期实验中，对照不含底物空菌中也存在此峰(未显示)；

图7是pET29a-CDMm-GH菌株发酵罐发酵，不同时间点底物产物变化图谱。

具体实施方式

以下将结合附图，通过具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明利用基因工程技术，将全基因合成的C1咖啡因脱甲基化酶基因CDMw通过基因重组技术克隆到表达载体并将相应的表达质粒转化到相应的宿主菌如大肠杆菌BL21(DE3)，对表达蛋白的重组细胞进行蛋白电泳以及活性测定。进一步通过易错PCR筛选形式获得高活性、高表达量CDMm序列，通过单一或者与辅酶循环用酶GH基因串联表达方式耦合大肠杆菌自身电子传递蛋白构建基因工程重组菌株。结果显示，本发明的重组基因工程大肠杆菌可催化底物咖啡因专一性反应生成可可碱，具有较高的转化率。

其中，C1咖啡因脱甲基化酶CDMw的核酸序列(序列1)如下所示：

ATGGAACAGACCATCAACAATAACGACCGCGAATACCTGCGTCACTTCTGGCACCCGGTTTGCACCGTCACGGAACTGGAAAAAGCACATCCGAGCAGCCTGGGCCCGATTGGTGTGAAACTGCTGAACGAACAGCTGGTTGTGGCAAAACTGAGCGGCCAATATGTTGCTATGCATGATCGTTGCGCACACCGCTCAGCTAAACTGTCGCTGGGTACCATTGCGAATGATCGTCTGCAGTGTCCGTATCATGGCTGGCAATACGACACGGAGGGTGCGTGCAAACTGGTGCCGGCATGTCCGAACAGCCCGATCCCGAATCGTGCGAAAGTTCAGCGCTTTGATTGCGAAGAACGTTATGGCCTGATTTGGGTCCGCCTGGACAGTTCCTATGCCTGTACCGAAATCCCGTACTTCAGTGCGGCCTCCGATCCGAAACTGCGCGTCGTGATCCAGGAACCGTACTGGTGGAACGCAACCGCTGAACGTCGCTGGGAAAACTTCACGGATTTCAGTCATTTCGCATTCATTCACCCGGGCACCCTGTTTGATCCGAACAATGCGGAACCGCCAATCGTGCCGATGGACCGTTTCAACGGCCAGTTTCGCTTCGTTTATGATACCCCGGAAGACATGGCAGTCCCGGATCAAGCTCCGATTGGTAGCTTTTCTTATACGTGCTCAATGCCGTTCGCAATCAATCTGGAAGTTGCTAAATACTCATCGAACTCGCTGCATGTGCTGTTTAATGTTAGCTGTCCGGTCGATGACTCTACCACGAAAAACTTTCTGCTGTTCGCGCGTGAACAGGCCGATGACAGCGATTATCTGCACATTGCGTTTAATGATCTGGTGTTCGCCGAAGACAAACCGGTTATCGAATCTCAATGGCCGAAAGATGCGCCGGCCGACGAAGTCAGTGTTGTCGCCGATAAAGTGTCCATTCAGTACCGTAAATGGCTGCGCGAACTGAAAGAAGCACACCAAGACGGCGCTCAGGCATTTCGCTCCGCACTGCTGGACTCCGTTATTGAATCAGACCGCTCCTACACGTAA

C1咖啡因脱甲基化酶突变体CDMm的氨基酸序列(序列2)如下所示：

MEQTINNNDREYLRHFWHPVCTATELEKAHPSSLGPIGVKLLNEQLVVAKLSGQYVAMHDRCAHRSAKLSLGTIANDRLQCPYHGWQYDTEGACKLVPACPNSPIPNRAKVQRFDCEERYGLIWVRLDSSYACTEIPYFSAASDPKLRVVIQEPYWWNATAERRWENFTDFSHFAFIHPGTLFDPNYAEPPIVPMDRFNGQFRFVYDTPEDMAVPDQAPIGSFSYTCSMPFAINLEVAKYSSNSLHVLFNVSCPVDDSTTKNFLLFAREQADDSDYLHIAFNDLVFAEDKPVIESQWPKDAPADEVSVVADKVSIQYRKWLRELKEAHQDGAQAFRSALLDSVIESDRSYT

实施例1

C1咖啡因脱甲基化酶野生型(CDMw)编码基因的构建、表达研究

一、引物设计

根据C1咖啡因脱甲基化酶全基因序列(优化后，见序列1)，以及大肠杆菌的表达载体pET-29a特点分别设计了初始构建引物：

引物F：5’-CGCCATATGGAACAGACCATCAACAATAACG-3’(带下划线的碱基为NdeI识别位点)；

引物R：5’-CGCGGATCCTTACGTGTAGGAGCGGTCTGATTC-3’(带下划线的碱基为BamHI识别位点)；

二、CDMw的构建、表达与菌体收集

分别以F/R为引物，质粒PUC57-CDMw(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)为模板，扩增CDMw基因，其中PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、dNTP溶液均由TaKaRa公司购得。

PCR反应体系为：10×Buffer(Mg²⁺)5μL，dNTP(2.5mMeach)4μL，引物F(10μM)2μL，引物R(10μM)2μL，模板2μL，ddH₂O34.5μL，PyrobestDNApolymerase0.5μL总体积50μL；PCR反应条件为：1、95℃5min；2、95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；3、72℃5min。

结果如图1所示，经电泳扩增到一条目的大小为1000bp左右的条带，CDMw基因全长(1056bp)，PCR扩增专一性良好(如图1-A所示)，利用琼脂糖切胶回收试剂盒回收该PCR产物片段后，采用限制性内切酶NdeI和BamHI将PCR扩增产物定向连接入大肠杆菌表达载体pET-29a(购自Novagen公司)中相应的位点，连接产物转化到感受态E.coliTop10(购自全式金公司)中，然后在含卡那霉素抗性(50μg/mL)LB平板(胰化蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L；琼脂粉15g/L)培养基上筛选阳性克隆，采用引物F/R(10μM)，菌落PCR以及酶切鉴定的方法验证筛选的阳性克隆(转化子)(如图1-B所示)，获得重组表达质粒命名为pET29a-CDMw，将测序正确的阳性转化子转入E.coliBL21(DE3)(购自全式金公司)中。将E.coliBL21(DE3)pET29a-CDMw置于LB液体培养基(胰化蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L)中37℃、200rpm震荡培养，至菌密度OD600为0.6-0.8左右时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，10uMFeCl₃于不同温度诱导18小时，表达C1咖啡因脱甲基化酶CDMw(如图2-A所示)分装0.3g/管，参见实施例2用于活性测定。

实施例2

HPLC对咖啡因与可可碱定量分析方法的建立以及小试活性检测体系建立

一、液相检测条件

实验仪器：Agilent1200型HPLC，紫外检测器。色谱柱：大连依利特HypersilODS24.6*250mm*5um，柱温：28℃；检测波长：274nm；流速：0.5ml/min；进样量：10ul；流动相A：0.1％的三乙胺用H₃PO₄调pH＝2.5；流动相B：乙腈；等度洗脱：A:B＝80:20；洗脱时间：10min；咖啡因的保留时间为8.48-8.5分钟，可可碱的保留时间为6.16-6.18分钟。

二、小试反应体系

将诱导表达得到pET29a-CDMwBL21(DE3)宿主菌株离心4000rpm，10min离心收集菌体，弃上清，加入磷酸钾缓冲液中(50mMpH7.5)重悬洗涤后，再次离心(4000rpm10min)，弃上清，称量菌体，取0.3g湿菌体，重悬于磷酸钾缓冲液中，按表1加入反应组分，反应体系2mL。30℃反应，200rpm。

在反应不同时间取样，20％乙腈稀释10倍，HPLC检测。如图3所示，生物法转化可可碱技术原理为在反应体系中添加以咖啡因为唯一底物的碳源供给基因工程重组菌消耗，其通过穿膜等作用进入工程菌内部，通过重组酶系催化转化，生成底物可可碱，而后释放出工程菌体内部。

表1

	母液浓度	加量	终浓度
				咖啡因	10g/L	400uL	2g/L
硫酸亚铁铵	10mM(3.92mg/mL)	200uL	1mM
				NADH	50mM(35.5mg/mL)	200uL	5mM
磷酸钾缓冲液	1M	200uL	100mM
				过氧化氢酶	2000U/mL	100uL	100U/mL
水			补齐至2mL

实施例3

C1咖啡因脱甲基化酶突变体(CDMm)获得以及与GH基因串联基因簇的构建、表达活性研究

一、突变体CDMw的构建、表达与菌体收集

利用构建成功的pET29a-CDMw作为模板，仍采用引物F/R进行易错PCR筛选突变体。易错PCR体系：10×Buffer(不含Mg²⁺)5μL，dGTP(10mM)1μL，dATP(10mM)1μL，dCTP(10mM)5μL，dTTP(10mM)5μL，Mg²⁺(25mM)10μL，引物F(10μM)2μL，引物R(10μM)2μL，模板0.5μL，ddH₂O18μL，Takarartaq0.5μL，总体积50μL。PCR反应条件为：1、95℃5min；2、95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；3、72℃5min。

PCR产物加入经过与原始CDMw片段相同的构建方式最终转化入BL21(DE3)菌株中。通过挑取不同单克隆诱导表达的方式确定正向突变菌株，参见实施例2进行突变后菌体摇瓶小试活性研究，将酶活提升的菌株送测序确定突变位点。最终筛选确定活性提升的突变点位置为V23A，N187Y双突变体，具体序列参见序列2。该突变菌株命名为pET29-CDMw。将测序正确的阳性转化子转入E.coliBL21(DE3)(购自全式金公司)中。测序成功后重组载体命名为pET29-CDMw-GH。将E.coliBL21(DE3)pET29a-CDM-GH置于LB液体培养基(胰化蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L)中37℃、200rpm震荡培养，至菌密度OD600为0.6-0.8左右时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，10uMFeCl₃于16-20℃诱导18小时，表达C1咖啡因脱甲基化酶CDMw(图2-B)分装0.3g/管，参见实施例2用于活性测定。

二、突变体CDMw与GH基因串联表达载体的构建、表达与菌体收集

根据葡萄糖脱氢酶(GH)全基因序列，以及大肠杆菌的表达载体pET29a-CDMw特点分别设计了构建引物：

引物F1：5’-CCGGAATTCAAGGAGAATGTATCCGGATTTAAAAGG-3’(带下划线的碱基为EcoRI识别位点，斜体字母为人工添加RBS结合位点)

引物R1：5’-CCGGAATTCTTAACCGCGGCCTGCCTGGAATG-3’(带下划线的碱基为EcoRI识别位点)

分别以F1/R1为引物，质粒PUC57-GH(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)为模板，扩增GH基因(方法体系参见实施例1)，结果如图1-A所示，扩增到一条目的大小为800bp左右的条带GH基因全长(786bp)，PCR扩增专一性良好，扩增后的基因经过琼脂糖切胶回收后Ecor1单酶切，连接入已经构建好的pET29-CDMw载体中，通过菌落PCR的方法鉴定***方向，重组载体三酶切的鉴定图谱如图1-B所示。将测序正确的阳性转化子转入E.coliBL21(DE3)(购自全式金公司)中。测序成功后重组载体命名为pET29-CDMw-GH。将E.coliBL21(DE3)pET29a-CDM-GH置于LB液体培养基(胰化蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L)中37℃、200rpm震荡培养，至菌密度OD600为0.6-0.8左右时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，10uMFeCl₃不同温度诱导18h，表达C1咖啡因脱甲基化酶CDM与葡萄糖脱氢酶GH(图2-C)分装0.3g/管，参见实施例2用于活性测定。

实施例4

C1咖啡因脱甲基化酶突变体(CDMm)枯草芽孢以及毕赤酵母表达菌株构建、表达活性研究

一、CDMm枯草芽孢表达菌株构建与菌体收集

根据CDMm基因序列，以及pWB980(分泌型)枯草芽孢杆菌的多克隆位点设计了克隆引物：

F2：CGCGGATCCCATGGAACAGACCATCAACAATAACG(带下划线的碱基为BamHI识别位点)；

R2：ACGCGTCGACTTACGTGTAGGAGCGGTCTGATTC(带下划线的碱基为SalI识别位点)。

基因扩增以及PCR过程参见实施例1。利用琼脂糖切胶回收试剂盒回收该PCR产物片段后，采用限制性内切酶BamHI和SalI将PCR扩增产物定向连接入枯草芽孢杆菌表达质粒中中相应的位点，连接产物通过电转化的方法转化到枯草芽孢杆菌WB600中，然后在含卡那抗性(50μg/mL)LB平板培养基上筛选阳性克隆。枯草芽孢杆菌菌落PCR的方法验证筛选的阳性克隆(转化子)，而后提取质粒进行酶切鉴定,获得重组表达质粒命名为pWB980-CDMm。将该枯草芽孢杆菌表达置于LB液体培养基中30℃、200rpm震荡培养，18h后收集菌体，分装0.3g/管，参见实施例2用于活性测定。

二、CDMm毕赤酵母菌株构建与菌体收集

根据CDMm基因序列，以及毕赤酵母载体的多克隆位点设计连接胞内表达载体引物：

F3：CCGGAATTCATGGAACAGACCATCAACAATAACG(带下划线的碱基为EcoRI识别位点)；

R3：CCGGAATTCTTACGTGTAGGAGCGGTCTGATTC(带下划线的碱基为EcoRI识别位点)。

基因扩增以及PCR过程参见实施例1。将回收的PCR产物与表达质粒pAO815分别用限制性内切酶EcoRⅠ单酶切，用T4连接酶将表达载体与酶切产物连接，转化到感受态大肠杆菌Top10中，然后在含氨苄抗性(50μg/mL)LB平板培养基上筛选阳性克隆，利用5’AOX前引物与ADI3R后引物通过菌落pcr方式鉴定连接方向，通过酶切重组质粒再次验证，测序验证，得到重组表达载体pAO815-CDMm。将E.coliTOP10(pAO815-CDMm)置于LB液体培养基中37℃、200转震荡培养过夜，中提重组质粒。利用SalI线性化重组质粒。将线性化的重组质粒转化感受态酵母细胞。酵母PichiaGS115感受态细胞的制备：将PichiaGS115单菌落挑入YPD培养基中活化，活化的PichiaGS115按0.5-1％的接种量接入50mlYPD培养基中培养至对数期，离心获得的菌体用15ml无菌水洗2次，再用15ml无菌1M山梨醇洗2次，加入1ml1M山梨醇重悬菌体获得PichiaGS115感受态细胞，分装90μL每只于-80冰箱冻存，可保持活性2周。感受态细胞中冰浴5min，2000V，电击转化(击穿时间保持在5ms为宜)，立即加入1mL山梨醇重选，吸取一定体积涂MD平板，30℃倒置培养，待培养至长出菌落后，将单菌落挑入无菌水中加入适量Lyticase(sigma)后37℃温育1-2h消化细胞壁，取部分消化产物为模板，片段引物作为鉴定引物，进行PCR，检测阳性克隆。分别各挑选4株阳性重组菌挑入2ml的YPD液体培养基活化1-2天后，以1％的接种量转接入500ml的BMGY(pH6.0)液体培养基中，200rpm培养，28℃过夜培养，每隔24h补加1％甲醇，诱导72h后，收集菌液，用于酶活测定，其中pAO815-ADI转化菌株为收集酵母细胞，分装0.3g/管，参见实施例2用于活性测定。

实施例5

不同基因工程菌株转化率活性测定以及考察影响咖啡因转化的关键参数

一、不同基因工程菌株转化率活性测定

参见实施例2配制小试活性检测反应液，并将咖啡因终浓度控制在1g/L，分别测定收集的不同菌体反应16h的转化率。结果见表2，以及图4。

表2

菌株类型	16h转化率
		pET29a	0.0005
pET29a-CDMw	0.162
		pET29a-CDMm	0.7237
pET29a-CDMm-GH	1
		PWB980-CDMm	0.116
PAO815-CDMm	0.09

从表2和图4都可以看出，经过重新构建的pET29a-CDMm-GH菌株在转化率上明显高于出发菌株pET29a-CDMw，pET29a-CDMm-GH菌株活性表现最强，其催化16h即可将1g/L的咖啡因完全转化为可可碱；经过突变后的基因构建入枯草芽孢或者酵母菌株后活性较低，说明此两种体系不适合用于转化研究。因而后期扩大研究时选用pET29a-CDMm-GH重组菌株，其HPLC转化图如图6所示，随着反应的进行咖啡因逐步减小直至完全转化生成可可碱。

二、考察影响咖啡因转化的关键参数考察

将筛选出的pET29a-CDMm-GH重组菌株，分别经过去掉反应液中相应组分的方式考察影响咖啡因转化的关键参数，具体数值如图5所示。由图5可见，对咖啡因转化率影响较高的两个因素为辅酶NADH的投入量以及硫酸亚铁铵的加入量，可见酶活性、辅酶循环以及电子传递对于此催化反应显得尤为重要。但是由于辅酶NADH价格较为昂贵，并在后续试验中发现串联基因GH后，可以在反应体系中不投入NADH其可可碱转化仍能保持较高速度，因此后续放大研究均未添加NADH，并且验证活菌催化体系中二价铁离子的重要性，需要在转化时额外添加，并且可以不添加过氧化氢酶。

实施例6

Pet29-CDMm-GH基因工程大肠表达菌株的发酵放大实验及催化活性研究

挑脱pET29a-CDMm-GH重组菌株单菌落至含LB培养基的试管，37℃200rpm摇床震荡，过夜培养后，接种至500mL摇瓶(含150mL的LB培养基)，37℃200rpm摇床震荡，培养4h后，OD约1.2，火焰接种进罐。发酵罐总体积为5L，装液量为3L。发酵培养基为M9培养基(Na₂HPO₄6g/L；KH₂PO₄3g/L；(NH4)₂SO₄2.24g/L；NaCl0.5g/L；MgSO₄.7H₂O0.246g/L；葡萄糖2g/L)，补料为60％葡萄糖(w/v)，用氨水调节pH。发酵培养时控温37℃，pH6.5；培养约8h溶氧突变，开始补料葡萄糖。OD30时加入FeSO₄溶液(10mM)3mL，终浓度10uM，温度调整至20℃，pH调至7.0。OD40时诱导，加入IPTG溶液(0.5M)6mL，终浓度1mM，pH调至7.5。诱导6h后停止培养，OD80，菌液体积3.5L。

发酵罐中取出1.5L菌液后，剩余2L，菌浓约100g/L，加入咖啡因10g(终浓度5g/L)、硫酸亚铁铵3.95g(终浓度5mM)，流加补料为60％葡萄糖，温度调至28℃，控pH7.5。此时取样为反应零点，样品加入20％乙腈稀释10倍，离心后取上清HPLC检测。不同时间点取样，HPLC动态检测反应进程，见图7。

从图7可以看出，随着反应的进行初始咖啡因量逐渐较少，25h时咖啡因几乎全部被转化为可可碱，再投入10g咖啡因继续反应，可可碱浓度继续增加，45h时达到最高浓度6.5g/L，由于持续补料导致体积增加，造成底物产物浓度变化。若考虑体积变化，实际转化率可以达到85％以上。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种生物法制备可可碱的方法，其特征在于，所述方法是在C1咖啡因脱甲基化酶CDMw或其突变体CDMm的催化作用下，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C1咖啡因脱甲基化酶CDMw具有如序列表的序列号1所示的核酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述C1咖啡因脱甲基化酶突变体CDMm具有如序列表的序列号2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：利用含有C1咖啡因脱甲基化酶CDMw或其突变体CDMm的基因工程重组菌，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱；

任选地，所述方法包括：利用含有辅酶循环用酶与C1咖啡因脱甲基化酶CDMw和/或其突变体CDMm多基因串联的基因工程重组菌，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因工程重组菌中咖啡因脱甲基化酶基因来源优选为假单胞菌；优选地，所述辅酶循环用酶为葡萄糖脱氢酶，底物为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述基因工程重组菌的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母或假单胞菌，优选为大肠杆菌。

7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述C1咖啡因脱甲基化酶CDMw或其突变体CDMm的表达载体为大肠杆菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体或酵母表达载体，优选为pET-22b、pET-28a、pET29a、pwb980、pA0815或Ppic9k。

8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：利用C1咖啡因脱甲基化酶CDMw或其突变体CDMm与大肠杆菌或与其对应宿主菌自身电子传递链耦合配合的基因工程重组菌株，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱。

9.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：利用含有辅酶循环用酶GH和C1咖啡因脱甲基化酶CDMw和/或其突变体CDMm多基因串联与大肠杆菌或与其对应宿主菌自身电子传递链耦合配合的基因工程重组菌株，进行咖啡因专一的C1位脱甲基化，从而得到可可碱。