CN114306439A

CN114306439A - 一种枇杷叶绒毛提取物及应用

Info

Publication number: CN114306439A
Application number: CN202210184202.0A
Authority: CN
Inventors: 王岳; 孙崇德; 韩璐阳; 曹锦萍; 李鲜
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114306439B

Abstract

本发明涉及一种枇杷叶绒毛提取物及应用，属于药物制备技术领域。本发明提供了枇杷叶绒毛在制备预防和/或治疗炎症的药物中的应用。枇杷叶绒毛提取物能够抑制LPS诱导的NO释放、抑制LPS诱导的炎症因子释放、抑制LPS诱导的炎症相关基因上调表达以及抑制LPS诱导的Jak2和Stat3的基因表达和蛋白磷酸化，实现LPS诱导的炎症的治疗。

Description

一种枇杷叶绒毛提取物及应用

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及一种枇杷叶绒毛提取物及应用。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl)是蔷薇科枇杷属植物，其果实、花、叶都可作为药物治疗疾病。枇杷原产于我国，最早有关枇杷的记载的是公元前一世纪的西汉司马相如的《上林赋》。根据《本草纲目》记载，“木高丈余，肥枝长叶，大如驴耳，背有黄毛，阴密婆娑可爱，四时不凋，盛冬开白花，至三四月成实作俅，生大如弹丸，熟时黄色如黄杏，微有毛，皮肉甚薄，核大如芋栗，黄褐色”。目前我国是世界上最主要的枇杷生产国，产地主要分布在长江以南的各省其中三大产区为福建莆田、浙江塘栖、江苏洞庭山。

枇杷叶革质，叶背面密生有灰棕色绒毛，味苦，微辛，性微寒，归肺、胃经。传统枇杷叶的应用过程中，需要将枇杷叶背面绒毛，即枇杷叶绒毛刷掉，单独以枇杷叶肉入药，而枇杷叶绒毛的功能活性尚未可知。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枇杷叶绒毛提取物及应用。本发明发现枇杷叶绒毛的抗炎活性，枇杷叶绒毛提取物能够实现炎症的改善和治疗。

本发明提供了枇杷叶绒毛在制备预防和/或治疗炎症的药物中的应用。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备预防和/或治疗炎症的药物中的应用。

优选的是，所述炎症包括LPS诱导的炎症。

优选的是，所述炎症包括肝脏的炎症。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的NO释放的药物中的应用。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的炎症因子释放的药物中的应用；所述LPS诱导的炎症因子包括IL-1β、IL-6和TNFα中的一种或两种以上。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的炎症相关基因上调表达的药物中的应用；所述LPS诱导的炎症相关基因包括iNOS、IL-6、IL-1β和TNFα中的一种或两种以上。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的Jak2和Stat3的基因表达和蛋白磷酸化的药物中的应用。

本发明还提供了一种预防和/或治疗炎症的枇杷叶绒毛提取物，所述枇杷叶绒毛提取物包括以下组分：奎宁酸、尿苷、巴豆苷、4-O-葡萄糖基-4-羟基苯甲酸、3-咖啡酰奎宁酸、对香豆酸-4-O-葡萄糖苷、原花青素B2、樱桃甙、槲皮素-3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-芸香苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-6-C-(2”-O-乙酰基)-葡萄糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、橙皮油醇、柚皮素-6-C-(2”,4”,6”-O-三乙酰)-葡萄糖苷、甜橙黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橘皮素和邻苯二甲酸酐。

本发明还提供了上述技术方案所述枇杷叶绒毛提取物的制备方法，包括以下步骤：将枇杷叶绒毛进行粉碎，得到粉碎后的枇杷叶绒毛；将粉碎后的枇杷叶绒毛和溶剂混合，提取，过滤，得到滤液；去除滤液中的溶剂，得到枇杷叶绒毛提取物。

本发明提供了枇杷叶绒毛在制备预防和/或治疗炎症的药物中的应用。本发明发现枇杷叶绒毛的抗炎活性，枇杷叶绒毛提取物能够实现炎症的改善和治疗。试验结果表明，枇杷叶绒毛提取物能够抑制LPS诱导的NO释放、抑制LPS诱导的炎症因子释放、抑制LPS诱导的炎症相关基因上调表达以及抑制LPS诱导的Jak2和Stat3的基因表达和蛋白磷酸化，实现炎症的治疗，具体实现LPS诱导的炎症的治疗。

附图说明

图1为本发明提供的枇杷叶绒毛提取物的液相图谱；

图2为本发明提供的不同浓度枇杷叶绒毛提取物对L02细胞的细胞活力影响结果图；

图3为本发明提供的不同浓度枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的L02细胞NO释放能力的抑制作用结果图；

图4为本发明提供的不同浓度枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的L02细胞炎症因子释放能力的抑制作用结果图；

图5为本发明提供的不同浓度枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的相关炎症因子基因表达的抑制作用结果图；

图6为本发明提供的枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的Jak2和Stat3基因表达的抑制作用结果图；

图7为本发明提供的枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的Jak2和Stat3蛋白表达和磷酸化的抑制作用结果图；

图8为本发明提供的不同浓度枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏炎症因子释放能力的抑制作用结果图；

图9为本发明提供的枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏相关炎症因子基因表达的抑制作用结果图；

图10为本发明提供的枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏Jak2和Stat3基因表达的抑制作用结果图；

图11为本发明提供的枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏Jak2和Stat3蛋白表达和磷酸化的抑制作用结果图。

具体实施方式

本发明提供了枇杷叶绒毛在制备预防和/或治疗炎症的药物中的应用。在本发明中，所述炎症优选包括LPS诱导的炎症。在本发明中，所述炎症优选包括肝脏的炎症。经实施例验证，枇杷叶绒毛具有抗炎活性，能够实现炎症的治疗，优选能够实现LPS诱导的炎症的治疗。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备预防和/或治疗炎症的药物中的应用。在本发明中，所述炎症优选包括LPS诱导的炎症。在本发明中，所述炎症优选包括肝脏的炎症。本发明对所述枇杷叶绒毛提取物的提取方法没有特殊限定，水提或有机溶剂提取物都在本申请的保护范围内。在本发明中，所述枇杷叶绒毛提取物优选包括枇杷叶绒毛乙醇提取物。枇杷叶绒毛提取物具有抗炎活性，能够实现炎症的治疗，优选能够实现LPS诱导的炎症的治疗。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的NO释放的药物中的应用。本发明对所述枇杷叶绒毛提取物的提取方法没有特殊限定，水提或有机溶剂提取物都在本申请的保护范围内。在本发明中，所述枇杷叶绒毛提取物优选包括枇杷叶绒毛乙醇提取物。经实施例验证，枇杷叶绒毛提取物能够抑制肝细胞或肝脏中LPS诱导的NO释放。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的炎症因子释放的药物中的应用；所述LPS诱导的炎症因子包括IL-1β、IL-6和TNFα中的一种或两种以上。本发明对所述枇杷叶绒毛提取物的提取方法没有特殊限定，水提或有机溶剂提取物都在本申请的保护范围内。在本发明中，所述枇杷叶绒毛提取物优选包括枇杷叶绒毛乙醇提取物。经实施例验证，枇杷叶绒毛提取物能够抑制肝细胞或肝脏中LPS诱导的炎症因子释放。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的炎症相关基因上调表达的药物中的应用；所述LPS诱导的炎症相关基因包括iNOS、IL-6、IL-1β和TNFα中的一种或两种以上。本发明对所述枇杷叶绒毛提取物的提取方法没有特殊限定，水提或有机溶剂提取物都在本申请的保护范围内。在本发明中，所述枇杷叶绒毛提取物优选包括枇杷叶绒毛乙醇提取物。经实施例验证，枇杷叶绒毛提取物能够抑制肝细胞或肝脏中LPS诱导的炎症相关基因上调表达。

本发明还提供了枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的Jak2和Stat3的基因表达和蛋白磷酸化的药物中的应用本发明对所述枇杷叶绒毛提取物的提取方法没有特殊限定，水提或有机溶剂提取物都在本申请的保护范围内。在本发明中，所述枇杷叶绒毛提取物优选包括枇杷叶绒毛乙醇提取物。经实施例验证，枇杷叶绒毛提取物能够抑制肝细胞或肝脏中LPS诱导的Jak2和Stat3的基因表达和蛋白磷酸化，即枇杷叶绒毛提取物能够抑制肝细胞或肝脏中LPS诱导的Jak2基因的表达和Jak2蛋白的磷酸化，且能够抑制肝细胞或肝脏中LPS诱导的Stat3基因的表达和Stat3蛋白的磷酸化。

本发明还提供了上述技术方案所述枇杷叶绒毛提取物的制备方法，包括以下步骤：将枇杷叶绒毛进行粉碎，得到粉碎后的枇杷叶绒毛；将粉碎后的枇杷叶绒毛和溶剂混合，提取，过滤，得到滤液；去除滤液中的溶剂，得到枇杷叶绒毛提取物。本发明所述粉碎前，优选对枇杷叶提取物进行冷冻。本发明对所述粉碎的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规粉碎方法即可。在本发明中，所述溶剂优选包括乙醇。在本发明中，所述粉碎后的枇杷叶绒毛的质量和溶剂的体积比优选为1：(8～12)mg/mL，更优选为1:1mg/mL。在本发明中，所述提取的方法优选包括超声提取法。本发明所述超声提取优选使用上海科导超声波清洗器(型号SK5200G)进行。在本发明中，所述超声的工作频率优选为35kHz，功率优选为200W。在本发明中，所述超声提取的提取时间优选为55～65min，更优选为60min。本发明去除溶剂的方法优选包括旋转蒸发法，旋转蒸发的条件优选为37℃，80rpm。去除溶剂后，本发明优选利用Eppendorf concentrator plus真空离心***经35℃真空离心至干燥得到提取物的粉末。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种枇杷叶绒毛提取物及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

提取方法：

取当年生枇杷叶，洗净后于室温晾干，使用毛刷将枇杷叶背面绒毛刷下，液氮速冻后置于-80℃，使用磨样机将绒毛磨碎成粉末备用。将粉末溶于乙醇，使用上海科导超声波清洗器(型号SK5200G)进行超声辅助提取，工作频率为35kHz，功率为200W，料液比为1：10(mg：mL)，提取时间为60min。提取液过滤后，使用旋转蒸发(37℃，80rpm)去除有机相，使用真空离心***得到提取物粉末。

检测方法：

将粉末溶于色谱甲醇中进行物质检测。使用UPLC-MS/MS进行物质检测，检测方法如下：

UPLC检测条件如下：以ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)为固定相；流动相为含有1％甲酸的水(流动相A)和含有1％甲酸的乙腈(流动相B)。梯度洗脱程序为：0～20min，5～95％B；20～22min，95％B；22～23min，95～5％B；23～25min，5％B。扫描波长为254nm，流速为0.3mL/min，柱温为50℃，进样体积为2μL。

质谱条件：UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪：正负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100-1500；雾化气(GS1)：55psi；雾化气(GS2)：55psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：600℃(正)550℃(负)；离子源电压(IS)：5500V(正)-4500V(负)；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为40±20eV，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。

检测结果如图1和表1所示，图1为枇杷叶绒毛提取物的液相图谱。枇杷叶绒毛提取物成分含有：奎宁酸、尿苷、巴豆苷、4-O-葡萄糖基-4-羟基苯甲酸、3-咖啡酰奎宁酸、对香豆酸-4-O-葡萄糖苷、原花青素B2、樱桃甙、槲皮素-3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-芸香苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-6-C-(2”-O-乙酰基)-葡萄糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、橙皮油醇、柚皮素-6-C-(2”,4”,6”-O-三乙酰)-葡萄糖苷、甜橙黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橘皮素和邻苯二甲酸酐。

表1枇杷叶绒毛提取物成分解析结果

实施例2

枇杷叶绒毛提取物对人肝脏细胞L02中诱导一氧化氮(NO)释放的抑制作用

实验方法：

本实施例旨在以人肝脏细胞系L02为实验对象，评价枇杷叶绒毛提取物对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导NO释放的抑制作用。L02细胞使用RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清)置于恒温恒湿培养箱中培养(37℃，5％CO₂)。将对数生长期的细胞以5×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，培养24h后，更换新鲜培养基，将不同浓度的枇杷叶绒毛提取物(Loquat Greenleaf Hair，LGH)溶于二甲基亚砜(DMSO)后培养基，继续孵育24h，然后加入0.1μg/mL LPS，孵育12h(对照组不添加LPS)，根据NO检测试剂盒测定培养基中的NO含量。

实验结果如图2和图3所示，图2显示不同浓度枇杷叶绒毛提取物对L02细胞的细胞活力影响，图3显示不同浓度枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的L02细胞NO释放能力的抑制作用。

如图2所示，在实验浓度范围内(枇杷绒毛提取物12.5～200μg/mL)，枇杷叶绒毛提取物(LGH)对L02细胞没有细胞毒性作用，细胞活性均在90％以上。而LPS和LGH共同处理时，200μg/mL枇杷绒毛提取物对细胞具有显著增殖抑制效果，因此，在后续试验中，选择100μg/mL及以下浓度进行。如图3所示，LGH单独处理时，对细胞NO的释放没有显著作用，而LPS可以显著诱导NO的释放(6.05μg/mL)，表现出炎症诱导效果，当细胞进行了LGH预处理后，培养基中的NO显著降低，尤其是100μg/mL预处理，培养基中NO浓度降低至1.51μg/mL，相较单独LPS诱导的NO浓度下降75％。以上结果说明，枇杷叶绒毛提取物具有显著抑制LPS诱导的NO释放的能力。

实施例3

枇杷叶绒毛提取物对人肝脏细胞L02中LPS诱导炎症因子释放的抑制作用

实验方法：

本实施例旨在以人肝脏细胞系L02为实验对象，评价枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的炎症因子释放的抑制作用。细胞培养和处理方法见实施例1，以Elisa法检测细胞炎症因子白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)，检测方法为商用试剂盒(Abcam公司)。

实验结果如图4所示，图4显示不同浓度枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的L02细胞炎症因子释放能力的抑制作用；其中，control：对照组；LPS：脂多糖干预组；25、50、100分别是三个浓度枇杷叶绒毛提取物处理组(均是在LPS干预下的)。

如图4所示，LPS显著诱导了细胞炎症因子的释放，对于IL-1β、IL-6和TNFα，LPS处理较对照组分别促进上调了11.53倍、6.89倍和5.23倍，达928.80pg/mL、967.32pg/mL和409.28pg/mL。而在实验浓度范围内(25～100μg/mL)，枇杷叶绒毛提取物(LGH)显著抑制了LPS对细胞炎症因子的释放作用，且呈现梯度剂量效应。尤其是100μg/mL的LGH预处理，将细胞炎症因子控制在了423.52pg/mL(IL-1β)、249.89pg/mL(IL-6)、113.77pg/mL(TNFα)。以上结果说明，枇杷叶绒毛提取物具有显著抑制LPS诱导的细胞炎症因子释放的能力。

实施例4

枇杷叶绒毛提取物具有在L02细胞中抑制LPS诱导的炎症相关基因上调表达的作用

本实施例旨在以人肝脏细胞系L02为实验对象，评价枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的炎症相关基因上调的抑制作用。将L02细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度镀在6孔板上。使用Trizol试剂提取总RNA，使用Invitrogen试剂盒进行逆转录，然后在实时PCR***中遵循标准定量PCR程序进行实验，Q-PCR总体系为50μL配置如下：10μL SYBR Green1染料、正向引物1μL、反向引物1μL，dNTP 1μL，Taq聚合酶2μL，待测样品cDNA 5μL，ddH₂O 30μL。轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。反应程序为93℃，2min预变性；93℃1min，55℃1min，72℃1min40个循环；72℃，7min延伸。qRT-PCR引物如下：

β-actin：

5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′(正向引物，SEQ ID NO.1)

5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGATG-3′(反向引物，SEQ ID NO.2)；

iNOS:

5′-CAGGACCACACCCCCTAGGA-3′(正向引物，SEQ ID NO.3)

5′-AGCCACATACCGAGCCATGC-3′(反向引物，SEQ ID NO.4)；

IL-1β：

5′-GTGTCCTGCGTGTTGAAAGAT-3′(正向引物，SEQ ID NO.5)

5′-GAGTTGGGCATTGGTGTAGAC-3′(反向引物，SEQ ID NO.6)；

IL-6：

5′-ACCCCTGACCCAACCACAAAT-3′(正向引物，SEQ ID NO.7)

5′-AGCTGCGCAGAATGAGATGAGTT-3′(反向引物，SEQ ID NO.8)；

TNFα：

5′-CACAGTGAAGTGCTGGCAAC-3′(正向引物，SEQ ID NO.9)

5′-GGCGATTACAGACACAACTCC-3′(反向引物，SEQ ID NO.10)

以β-actin对照。采用比较(2^-ΔΔCT)法计算基因表达的相对水平。

实验结果如图5所示，图5显示不同浓度枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的相关炎症因子基因表达的抑制作用。

如图5所示，相较于对照组，LPS诱导显著诱导了炎症因子相关基因iNOS、IL-1β、IL-6、TNFα的表达，表明LPS通过上调炎症因子基因的表达诱导了炎症因子的表达。而枇杷叶绒毛提取物可以抑制LPS对炎症因子相关基因的表达，且呈剂量效应。对于iNOS、IL-1β、IL-6、TNFα等基因的表达，100μg/mL枇杷叶绒毛提取物处理的抑制率达97.91％、97.23％、97.42％和83.42％。以上结果说明，枇杷叶绒毛具有显著抑制LPS诱导的炎症因子基因表达的作用。

实施例5

枇杷叶绒毛提取物具有在L02细胞中抑制LPS诱导的Jak2、Stat3基因表达和蛋白磷酸化的作用

实验方法：

本实施例旨在以人肝脏细胞系L02为实验对象，评价枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的Jak2、Stat3基因表达和蛋白磷酸化的抑制作用。将L02细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度镀在6孔板上。使用Trizol试剂提取总RNA，使用Invitrogen试剂盒进行逆转录，然后在实时PCR***中遵循标准定量PCR程序进行实验，qRT-PCR引物如下：

β-actin：

5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′(正向引物，SEQ ID NO.1)

5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGATG-3′(反向引物，SEQ ID NO.2)；

Jak2:

5'-AGCCTATCGGCATGGAATATCT-3'(正向引物，SEQ ID NO.11)

5'-TAACACTGCCATCCCAAGACA-3'(反向引物，SEQ ID NO.12)；

Stat3:

5'-ACCAGCAGTATAGCCGCTTC-3'(正向引物，SEQ ID NO.13)

5'-GCCACAATCCGGGCAATCT-3'(反向引物，SEQ ID NO.14)；

以β-actin对照。采用比较(2^-ΔΔCT)法计算基因表达的相对水平。蛋白表达和磷酸化水平使用Abcam公司的Elisa试剂盒进行测定，按照说明书标准流程进行。

实验结果如图6和图7所示，图6显示枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的Jak2和Stat3基因表达的抑制作用，图7显示枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的Jak2和Stat3蛋白表达和磷酸化的抑制作用(图中的“p-”代表“phosphorylated”，即磷酸化的)。

如图6所示，相较于对照组，LPS诱导显著诱导了炎症调节通路Jak2和Stat3基因的表达，而枇杷叶绒毛提取物可以显著抑制LPS对Jak2和Stat3基因的诱导作用，且呈现剂量效应，其中，100μg/mL枇杷叶绒毛提取物处理的抑制率达94.61％(Jak2)和67.70％(Stat3)。如图7所示，与对照组相比，LPS显著诱导了Jak2蛋白表达至17.03倍，而LGH处理对LPS干预下的Jak2蛋白表达没有显著调节作用，但是LGH处理显著抑制了LPS对Jak2蛋白的磷酸化作用，且呈剂量效应，这表明LGH通过降低Jak2蛋白的磷酸化抑制了LPS对Jak2蛋白的功能诱导。对于Stat3蛋白，LPS显著诱导了其表达和磷酸化水平，而LGH处理可以显著抑制LPS的诱导作用，且均呈现剂量效应。即LGH对Jak2和Stat3的蛋白磷酸化均有显著作用。磷酸化是蛋白启动表达的特征性指标。LGH对Jak2和Stat3的作用机理有差异，但是均可以抑制LPS诱导的蛋白作用活化。以上结果说明，枇杷叶绒毛具有显著抑制LPS诱导的炎症相关通路Jak2、Stat3基因表达和蛋白磷酸化的作用。

实施例6

枇杷叶绒毛提取物具有在小鼠肝脏中抑制LPS诱导的L02细胞中抑制LPS诱导炎症因子积累的抑制作用

实验方法：

本实施例旨在以C57BL/6J小鼠为对象，评价枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏炎症因子释放的抑制作用。雄性6周龄C57BL/6J小鼠饲养于SPF环境中，自由获取饲料和饮用水，饲养温度为22±2℃，光暗周期分别12h。将小鼠分为5组，分别为对照组(饲喂水，腹腔注射生理盐水)，模型组(饲喂水，腹腔注射LPS，剂量为0.25mg/kg，持续7d)，LGH低剂量组(灌胃25mg/kg LGH持续21d后，保持灌胃同时腹腔注射0.25mg/kg LPS，继续持续7d)，LGH中剂量组(灌胃50mg/kg LGH持续21d后，保持灌胃同时腹腔注射0.25mg/kg LPS，继续持续7d)，LGH高剂量组(灌胃100mg/kg LGH持续21d后，保持灌胃同时腹腔注射0.25mg/kg LPS，继续持续7d)，每组10只。实验自灌胃开始共计28d，麻醉后颈椎脱臼处死小鼠，收集其肝脏，液氮速冻，于磨样器中磨碎后备用。炎症因子IL-1β、IL-6、TNFα采用Abcam公司Elisa试剂盒进行检测。

实验结果如图8所示，图8显示不同浓度枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏炎症因子释放能力的抑制作用。

如图8所示，腹腔注射LPS显著诱导了小鼠肝脏炎症因子的积累，对于三种炎症因子IL-1β、IL-6和TNFα，LPS处理较对照组分别促进上调了8.68倍、6.54倍和7.59倍，达1637.00pg/mL、1590.93pg/mL和1423.01pg/mL。而在实验浓度范围内(25～100mg/kg bwd)，枇杷叶绒毛提取物(LGH)显著抑制了小鼠肝脏中LPS诱导的细胞炎症因子积累。以上结果说明，枇杷叶绒毛提取物具有显著抑制LPS诱导的小鼠肝脏炎症因子积累的能力。

实施例7

枇杷叶绒毛提取物具有在小鼠肝脏中抑制LPS诱导的炎症相关基因上调表达的作用

实验方法：

本实施例旨在以C57BL/6J小鼠为对象，评价枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏炎症相关基因上调表达的抑制作用。小鼠饲养和处理方法与实施例6相同。使用Trizol试剂提取肝脏总RNA，使用Invitrogen试剂盒进行逆转录，然后在实时PCR***中遵循标准定量PCR程序进行实验。

qRT-PCR引物如下：

β-actin：

5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′(正向引物，SEQ ID NO.15)

5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′(反向引物，SEQ ID NO.16)；

iNOS:

5′-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3′(正向引物，SEQ ID NO.17)

5′-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3′(反向引物，SEQ ID NO.18)；

IL-1β：

5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′(正向引物，SEQ ID NO.19)

5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′(反向引物，SEQ ID NO.20)；

IL-6：

5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′(正向引物，SEQ ID NO.21)

5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′(反向引物，SEQ ID NO.22)；

TNFα：

5′-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3′(正向引物，SEQ ID NO.23)

5′-GCTACGACGTGGGCTACAG-3′(反向引物，SEQ ID NO.24)

实验结果如图9所示，图9显示枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏相关炎症因子基因表达的抑制作用。

如图9所示，相较于对照组，腹腔注射LPS诱导显著诱导了炎症因子相关基因iNOS、IL-1β、IL-6、TNFα的表达，表明LPS通过上调炎症因子基因的表达诱导了炎症因子的表达。而枇杷叶绒毛提取物可以抑制LPS对炎症因子相关基因的表达，且呈剂量效应。对于iNOS、IL-1β、IL-6、TNFα等基因的表达，100mg/kg枇杷叶绒毛提取物处理的抑制率达98.20％、93.99％、98.89％和92.48％。以上结果说明，枇杷叶绒毛具有显著抑制LPS诱导的炎症因子基因表达的作用。

实施例8

枇杷叶绒毛提取物具有在小鼠肝脏中抑制LPS诱导的Jak2、Stat3基因表达和蛋白磷酸化的作用

实验方法：

本实施例旨在以C57BL/6J小鼠为对象，评价枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的Jak2、Stat3基因表达和蛋白磷酸化的抑制作用。小鼠饲养和处理方法与实施例6相同。使用Trizol试剂提取肝脏总RNA，使用Invitrogen试剂盒进行逆转录，然后在实时PCR***中遵循标准定量PCR程序进行实验。qRT-PCR引物如下：蛋白表达和磷酸化水平使用Abcam公司的Elisa试剂盒进行测定，按照说明书标准流程进行。

β-actin：

5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′(正向引物，SEQ ID NO.15)

5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′(反向引物，SEQ ID NO.16)；

Jak2:

5'-TTGTGGTATTACGCCTGTGTATC-3'(正向引物，SEQ ID NO.25)

5'-ATGCCTGGTTGACTCGTCTAT-3'(反向引物，SEQ ID NO.26)；

Stat3:

5'-CAATACCATTGACCTGCCGAT-3'(正向引物，SEQ ID NO.27)

5'-GAGCGACTCAAACTGCCCT-3'(反向引物，SEQ ID NO.28)；

实验结果如图10和图11所示，图10显示枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏Jak2和Stat3基因表达的抑制作用，图11显示枇杷叶绒毛提取物对LPS诱导的小鼠肝脏Jak2和Stat3蛋白表达和磷酸化的抑制作用。

如图10所示，相较于对照组，腹腔注射LPS诱导显著诱导了炎症调节通路Jak2和Stat3基因的表达，一定浓度的枇杷叶绒毛提取物可以显著抑制LPS对Jak2和Stat3基因的诱导作用，其中，100mg/kg枇杷叶绒毛提取物处理的抑制率达95.32％(Jak2)和66.29％(Stat3)。如图11所示，与对照组相比，LPS显著诱导了Jak2和Stat3的蛋白表达量和磷酸化水平，这表明在LPS可以通过这两种途径诱导小鼠肝脏的炎症发生，而口服LGH可以显著降低Jak2和Stat3的蛋白表达量和磷酸化水平。以上结果说明，枇杷叶绒毛具有显著抑制LPS诱导的炎症相关通路Jak2、Stat3基因表达和蛋白磷酸化的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种枇杷叶绒毛提取物及应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtggccgagg actttgattg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtggggtgg cttttaggat g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggaccaca ccccctagga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agccacatac cgagccatgc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgtcctgcg tgttgaaaga t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagttgggca ttggtgtaga c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acccctgacc caaccacaaa t 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agctgcgcag aatgagatga gtt 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacagtgaag tgctggcaac 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcgattaca gacacaactc c 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcctatcgg catggaatat ct 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taacactgcc atcccaagac a 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accagcagta tagccgcttc 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gccacaatcc gggcaatct 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggctgtattc ccctccatcg 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccagttggta acaatgccat gt 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gttctcagcc caacaataca aga 23

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtggacgggt cgatgtcac 19

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcaactgttc ctgaactcaa ct 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atcttttggg gtccgtcaac t 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tagtccttcc taccccaatt tcc 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttggtcctta gccactcctt c 21

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccctcacact cagatcatct tct 23

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gctacgacgt gggctacag 19

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttgtggtatt acgcctgtgt atc 23

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atgcctggtt gactcgtcta t 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caataccatt gacctgccga t 21

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gagcgactca aactgccct 19

Claims

1.枇杷叶绒毛在制备预防和/或治疗炎症的药物中的应用。

2.枇杷叶绒毛提取物在制备预防和/或治疗炎症的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述炎症包括LPS诱导的炎症。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述炎症包括肝脏的炎症。

5.枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的NO释放的药物中的应用。

6.枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的炎症因子释放的药物中的应用；所述LPS诱导的炎症因子包括IL-1β、IL-6和TNFα中的一种或两种以上。

7.枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的炎症相关基因上调表达的药物中的应用；所述LPS诱导的炎症相关基因包括iNOS、IL-6、IL-1β和TNFα中的一种或两种以上。

8.枇杷叶绒毛提取物在制备抑制LPS诱导的Jak2和Stat3的基因表达和蛋白磷酸化的药物中的应用。

9.一种预防和/或治疗炎症的枇杷叶绒毛提取物，所述枇杷叶绒毛提取物包括以下组分：奎宁酸、尿苷、巴豆苷、4-O-葡萄糖基-4-羟基苯甲酸、3-咖啡酰奎宁酸、对香豆酸-4-O-葡萄糖苷、原花青素B2、樱桃甙、槲皮素-3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-芸香苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-6-C-(2”-O-乙酰基)-葡萄糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、橙皮油醇、柚皮素-6-C-(2”,4”,6”-O-三乙酰)-葡萄糖苷、甜橙黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、橘皮素和邻苯二甲酸酐。

10.权利要求9所述枇杷叶绒毛提取物的制备方法，包括以下步骤：将枇杷叶绒毛进行粉碎，得到粉碎后的枇杷叶绒毛；将粉碎后的枇杷叶绒毛和溶剂混合，提取，过滤，得到滤液；去除滤液中的溶剂，得到枇杷叶绒毛提取物。