WO2007001080A1 - ビワ葉抽出物を含有する飲食品及び医薬品 - Google Patents

ビワ葉抽出物を含有する飲食品及び医薬品 Download PDF

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WO2007001080A1
WO2007001080A1 PCT/JP2006/313197 JP2006313197W WO2007001080A1 WO 2007001080 A1 WO2007001080 A1 WO 2007001080A1 JP 2006313197 W JP2006313197 W JP 2006313197W WO 2007001080 A1 WO2007001080 A1 WO 2007001080A1
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tea
food
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fraction
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Yusuke Sakata
Makoto Fujii
Takayuki Nakano
Norioki Ko
Fumio Hashimoto
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Kagoshima University
Totsukawanoujou Corporation
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention includes, for example, an antihyperlipidemic action, an antihypertensive action, a cancer cell proliferation inhibiting action, a cancer cell apoptosis inducing action, a reactive oxygen species producing action, a hyperglycemic lowering action and / or an antioxidative action or
  • the present invention relates to pharmaceuticals and their manufacturing methods.
  • Bean leaves are used as a favorite drink of bean tea and are not only popular as bean tea but also used as a medicine blended in traditional Chinese medicine.
  • Non-patent Document 1 cytotoxic activity of polyphenol components contained in birch leaves against human tumor cells
  • Non-Patent Documents the anti-carcinogenic promotion effect of Megastigman glycosides contained in birch leaves
  • Non-patent document 3 anti-oxidant action of birch leaves
  • Patent Document 1 filed by the present applicant discloses a method and production equipment for producing a large amount of flavored bean tea using bean leaves.
  • the present applicant uses the bean-cha tea manufacturing facility described in Patent Document 1 to produce screw mebiwa tea by roasting tourmaline stone.
  • Concerning the manufactured Nemebiwa tea consumers say that “the blood sugar level of diabetes has decreased” and “the blood pressure of hypertension has returned to normal”, but empirical evidence has been confirmed. (Non-Patent Document 5).
  • Patent Document 1 states that “The leaves of bean koji, which is a material for producing conventional koji tea, use the cultivated varieties with the aim of harvesting the fruits. In the past, there was a disadvantage that the original effect was not obtained even if it was used for medicinal purposes because the nutrients collected in the fruit and not enough nutrients were distributed to the birch leaves. Was not sufficiently effective for medicinal purposes.
  • bean has the following activities or usage methods. ing.
  • Patent Document 2 discloses that koji or an extract thereof has a matrix meta-mouth proteinase (MMP-1) inhibitory activity.
  • MMP-1 matrix meta-mouth proteinase
  • Patent Document 3 discloses that the leaves of birch trees are baked into charcoal to make a powdered food material.
  • Patent Document 4 the raw leaves of bean paste are cut, steamed with steam, squeezed while sending hot air, dried, shaped, and then dried again to increase the aroma and taste.
  • a characteristic method for producing Kampo tea is disclosed.
  • Patent Document 5 discloses a method for producing health tea, which is obtained by mixing leaf green health tea of Gramineae plant and * leaf of birch and containing more ⁇ -aminobutyric acid.
  • Patent Document 6 discloses that a koji extract excluding a fruit part has a sarcoidase inhibitory activity.
  • Patent Document 7 discloses a composition for promoting nourishing tonic health in which shakiyota and bibi leaf are mixed.
  • Patent Document 8 discloses a health tea obtained by mixing roasted yellow persimmon leaves with bean tea.
  • Patent Document 9 discloses a health tea composed of a mixture of sweet tea and bean paste.
  • Patent Document 1 Q discloses that a composition containing an organic extract of the genus Rosaceae inhibits C0X-2 activity in living organisms.
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-154108
  • Patent Document 4 JP 2004-105036 A
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-0652 7
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-163795
  • Patent Document 7 JP 2001-163792 A
  • Patent Document 8 Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-274832
  • Patent Document 9 Japanese Patent Laid-Open No. 5-056772 Patent Document 1 o Special Table 2004-529079
  • Non-Patent Document 1 Ito, H. et al., “Chem. Pharm. Bull.” 2000, pp. 48, p. 687-693
  • Non-Patent Document 2 Takashi Yoshida et al., “Bio Industry”, 2003, 20th 27, 33
  • Non-Patent Document 3 Ito, H. et al., “J. Agric. Food Chem.”, 2002, 50th, p. 2400-2403
  • Non-Patent Document 4 Jung, H. et al., “Arch. Pharm. Res. J, 1999, Vol. 22, p. 213-218
  • Non-Patent Document 5 Totsukawa Farm, Agricultural Production Corporation,“ Nemebiwa Tea Pamphlet ” , 2004 Invention Disclosure
  • birch leaves have a hypoglycemic-lowering action, an antihypertensive action, and an inhibition of cancer cell growth. It has not been known to have effects such as action, cancer cell apoptosis-inducing action, reactive oxygen species producing action, and antihyperlipidemic action. If these effects can be confirmed, biliary leaves can be used for the prevention or treatment of diseases such as diabetes, hyperlipidemia, hypertension, and cancer.
  • the present invention uses an anti-hyperlipidemic action, a hypertension-inhibiting action, a cancer cell proliferation-inhibiting action, a cancer cell apoptosis-inducing action, a reactive oxygen species producing action, a hyperglycemia using biliary leaves.
  • the object is to provide a food or drink or medicine having a lowering action and / or antioxidant action and a method for producing the same.
  • the present inventors have reduced the blood glucose level by subjecting bean tea to hot water extraction and feeding the obtained extract to model mice or rats. It was also found that the weight of serum lipids such as cholesterol and triglycerides and adipose tissue is reduced. It was also found that the crude fraction obtained from the extract of bime tea has a strong antioxidant effect.
  • the present invention includes the following.
  • (1) Contains an extract or purified product of bime leaves or bime tea as an active ingredient, and also has an antihyperlipidemic effect, an antihypertensive effect, an anticancer effect on cancer cell proliferation, an inducement effect on cancer cell apoptosis, an active oxygen species
  • a food or drink or a pharmaceutical product having one or more actions selected from the group consisting of a production action, a hypoglycemic action and an antioxidant action.
  • the purified product is one or more selected from the group consisting of chlorogenic acid, quercetin 3-sambubioside, methyl chlorogenic acid, kaempferol 3-rhamnoside, quenorece'tin 3-rhamnoside, 2oc_hydroxyursolic acid and ursolic acid
  • the food / beverage product or medicine according to (1) characterized in that it does not contain a compound of
  • the above food or drink is selected from the group consisting of antihyperlipidemic action, antihypertensive action, cancer cell proliferation inhibitory action, cancer cell apoptosis inducing action, reactive oxygen species production action, hyperglycemia lowering action and antioxidant action.
  • a method for producing a food or drink or pharmaceutical having one or more actions selected from the group consisting of cancer cell apoptosis-inducing action, reactive oxygen species producing action, hyperglycemic lowering action and antioxidant action.
  • the purified product is selected from the group consisting of chlorogenic acid, taercetin 3-sambubioside, methyl chlorogenic acid, kaempferonole 3-rhamnoside, quercetin 3-rhamnoside, 2 ⁇ -hydroxyursolic acid and ursolic acid 1 Above (6) The production method according to (6), wherein the compound is not contained.
  • the food / beverage product or pharmaceutical product according to the present invention contains an extract or purified product of bean leaf or bean tea as an active ingredient, and has an antihyperlipidemic effect, an antihypertensive effect, an anticancer effect on cancer cell growth, It has one or more actions selected from the group consisting of cancer cell apoptosis-inducing action, reactive oxygen species producing action, hyperglycemic lowering action and antioxidant action. Hyperlipidemia and hypertension can be prevented or treated by ingesting or administering the food or drink or pharmaceutical product according to the present invention to animals such as humans.
  • the growth of cancer cells is suppressed, apoptosis is induced in cancer cells, and reactive oxygen species are produced in cancer cells. It can be shown.
  • the blood glucose level can be lowered and active oxygen or the like can be removed.
  • the antihyperlipidemic effect means that the cholesterol in the blood is decreased.
  • the antihypertensive activity means to suppress the increase of the 'blood pressure ⁇
  • the cancer cell growth inhibitory action means killing cancer cells and suppressing their growth.
  • the cancer cell apoptosis-inducing action means that cancer cells are induced to induce apoptosis and kill the cancer cells.
  • the reactive oxygen species producing action means producing reactive oxygen species in cancer cells and killing the cancer cells.
  • hypoglycemic action means that the blood sugar level is lowered.
  • antioxidation means removing active oxygen in the body.
  • koji leaf or koji tea is used.
  • bibi leaves fresh leaves or dried leaves can be used as they are.
  • bean tea any bean tea can be used, but for example, Nejimebiwa tea (trade name), ⁇ Nemebiwacha is a product that is more scorched by high-temperature heating with tourmaline stone. It can be prepared by the method described in Patent Document 1 described above.
  • Nemebiwa tea Neiso-cha
  • the extract used for the food or drink or the pharmaceutical product according to the present invention can be obtained by subjecting the birch leaves or bibi tea to hot water extraction or solvent extraction.
  • bean leaves or bean tea Is subjected to extraction using hot water, and this is repeated once or several times (for example, 3 times) to obtain a bime leaf or bime tea extract.
  • bi-biba or bi-bicha extract can be obtained by subjecting bi-bipo or bi-bicha to extraction using water or an organic solvent such as lower alcohol Nyaseton.
  • bi koji leaf or koji tea extract means an extract or various solvent extracts obtained by the above extraction method, a diluted solution thereof, a concentrated solution thereof or a dried powder thereof.
  • a purified product obtained by removing impurities from the extract by subjecting the above-described bibi leaf or bime tea extract to purification means such as filtration, centrifugation, or purification treatment is used.
  • purification means include column chromatography, normal phase or reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and gel filtration, with column chromatography being particularly preferred.
  • an aqueous solution of bime leaf or bime tea is directly subjected to open column chromatography on a gel for reverse phase (eg, MCI gel CHP-20P (Mitsubishi Chemical), etc.). Chromatography is performed by using water as the liquid A and ethanol as the liquid B in the mobile phase, changing the ratio of the liquid A and the liquid B to 100: 0, 30:70, 70:30. Finally, use acetonitrile as solution C, and perform chromatography with the ratio of solution A and solution C set to 50:50.
  • the crude fraction that elutes at a ratio of A to B of 70:30 and the crude fraction that elutes at a ratio of 50 to 50 of A and C shows a strong hypoglycemic action. . Therefore, these crude fractions can be suitably used for foods and beverages or pharmaceuticals according to the present invention as purified products of piu leaves or boiled tea.
  • the residue is converted into a gel for reverse phase (for example, MCI gel CHP-2
  • chlorogenic acid quercetin 3-sanbubio It does not contain one or more of the following compounds: sid, methylcuccinic acid, kenwei chinolose 3-rhamnoside, quercetin 3-rhamnoside, 2-hydroxyursolic acid and ursolic acid. Therefore, it is preferable that these compounds are not contained in the koji leaf or koji tea purified product used for the food or drink or the pharmaceutical product according to the present invention.
  • the food or drink or the pharmaceutical product according to the present invention can be produced.
  • the food / beverage product according to the present invention has an antihyperlipidemic action, an antihypertensive action, a cancer cell proliferation inhibitory action, a cancer cell apoptosis inducing action, a reactive oxygen species producing action, a hyperglycemic lowering action and / or an antioxidant action. It can be used as a food and drink, especially as a health supplement or food for specified health use. Preferably, it is a health supplement or special health food in the form of tablets, 'capsules, granules, drinks, PET bottles, etc.
  • Examples of food and drink include, but are not limited to, confectionery, retort food, juices, teas, and dairy products.
  • sweeteners, seasonings, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. may be added to foods and drinks as necessary, or vitamins, nutrients, immune enhancers (for example, propolis) You can add mushroom extract etc.).
  • the amount of the extract or purified product of bime leaves or bime tea to the food and drink according to the present invention is an amount within a range corresponding to 0.1 to 200 mg per kg of adult body weight to be ingested or 50 mg to 1 item. lg, but not limited to this range.
  • the pharmaceutical product according to the present invention contains an effective amount of an extract or a purified product of bime leaves or bime tea.
  • the pharmaceutical agent according to the present invention is used as an antihyperlipidemic agent, a hypertension inhibitor, a cancer cell proliferation inhibitor, a cancer cell apoptosis inducer, a reactive oxygen species producing agent, a hyperglycemic agent or an antioxidant. Can do.
  • the medicinal product according to the present invention includes, in addition to an extract or purified product of bean leaf or bean tea, a pharmaceutically acceptable carrier (excipient or diluent), a binder, a bulking agent, and a lubricant.
  • Disintegrating agents, wetting agents, emulsifying agents, buffering agents, suspending agents, preservatives, coloring agents, flavoring agents and An additive appropriately selected from sweeteners and the like can be contained.
  • Carriers and additives that are generally used for formulation can be used for the production of the pharmaceutical product according to the present invention.
  • the binder include starch, polyvinyl chloride, hydroxypropylmethylcellulose, and the like.
  • bulking agents include ratatoose and microcrystalline cellulose.
  • lubricants examples include talc, silica, and magnesium stearate.
  • disintegrants examples include starch and sodium starch glycolate.
  • wetting agents include sodium lauryl sulfate.
  • emulsifiers include cell mouth derivatives, sorbitol and the like.
  • preservatives include methyl-P-hydroxybenzoate and sorbic acid.
  • the additives that can be used in the present invention are not limited to these additive examples.
  • the pharmaceutical product according to the present invention is formulated for oral administration or parenteral administration (intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intramuscular, sublingual, intranasal, intravaginal, etc.) Can be.
  • parenteral administration intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intramuscular, sublingual, intranasal, intravaginal, etc.
  • the form of the preparation is not particularly limited, and examples thereof include solutions, tablets, powders, granules, capsules, suppositories, sprays, controlled release agents, suspensions and drinks. '
  • the dose of the extract or purified product of bean leaf or bean tea contained in the pharmaceutical product according to the present invention may vary depending on factors such as the patient's age, weight, sex, condition and severity.
  • the daily dose of the extract or purified product of bicucumber leaf or bibi tea administered to a patient is, for example, in the range of 0.1 to 200 mg, preferably 1 to 100 mg per kg of patient weight. It is not limited to. If necessary, the dose may be divided into several doses, for example, divided into 2-3 doses.
  • the pharmaceutical agent according to the present invention may have other antihyperlipidemic agents having the same or different therapeutic uses, hypertension inhibitors, cancer cell proliferation inhibitors, cancer cell apoptosis inducers, reactive oxygen species producing agents, hyperglycemic agents. And / or can be administered to a patient in combination with an antioxidant.
  • the food / beverage products or pharmaceutical products according to the present invention can be subjected to pharmacological evaluation as follows, for example.
  • Examples of the pharmacological evaluation of the antihyperlipidemic action of the food and drink or pharmaceutical product according to the present invention include, for example, ingesting the food and drink or pharmaceutical product according to the present invention in a model animal and A method for measuring tissue weight is mentioned.
  • the present invention When the amount of total cholesterol, HDL cholesterol and / or triglyceride in the blood is significantly reduced in the animals receiving the food / drinks / medicines according to the present invention compared to the animals not taking the food / drinks / medicines Therefore, it can be determined that the food or drink or pharmaceutical product according to the present invention has an antihyperlipidemic effect. Similarly, when the adipose tissue weight of the organ is significantly reduced, it can be determined that the food or drink or the pharmaceutical product according to the present invention has an antihyperlipidemic effect well.
  • examples of the pharmacological evaluation of the antihypertensive action of foods and beverages or pharmaceuticals according to the present invention include a method using males of SHR rats (natural hypertension rats).
  • the food or beverage or pharmaceutical product according to the present invention is fed to the SHR rat, and after the breeding is finished, the blood pressure of each rat is measured using an unheated cuff blood pressure meter (Muromachi Kikai Co., Ltd.).
  • the blood pressure is reduced as compared with a rat not fed with the food or drink or pharmaceutical product according to the present invention as measured by the apparatus, the food or food product or pharmaceutical product according to the present invention has a good antihypertensive product. I can judge.
  • the pharmacological evaluation of the cancer cell 'growth-inhibiting action, cancer cell apoptosis-inducing action and reactive oxygen species producing action of the food or drink or pharmaceutical product according to the present invention includes, for example, human acute
  • HL-60 cells promyelocytic leukemia disease cells
  • the food or drink or pharmaceutical product according to the present invention has a cancer cell apoptosis-inducing action. Furthermore, when HL-60 cells are cultured in the presence of a food or drink or pharmaceutical product according to the present invention, and the intracellular active oxygen is increased compared to the control group (in the absence of the food or food product or pharmaceutical product of the present invention) Therefore, it can be judged that the food or drink or the pharmaceutical product according to the present invention has a reactive oxygen species producing action on cancer cells.
  • a model animal for example, a KKAy mouse that is a type II diabetes model mouse
  • Blood glucose level during or after breeding The method to determine is mentioned.
  • the blood glucose level is significantly reduced in the animal that has taken the food or drink or medicine according to the present invention, compared to the animal that has not taken the food or drink or medicine according to the present invention, the food or drink according to the present invention Alternatively, it can be determined that the drug has good hypoglycemic action.
  • examples of the pharmacological evaluation of the antioxidant action of foods and beverages or pharmaceuticals according to the present invention include the method described in Harwat, KSM et al., Free Radical Res., 36: 177-187, 2002. . That is, DPPH (1, ldiphenyl-2-picrylhydrazyl) is added to the food / beverage product or pharmaceutical product according to the present invention, the absorbance is measured, and the concentration of TrQlox is determined from the absorbance using the Trolox absorbance standard curve. Is converted. From the converted value, the radical scavenging rate is calculated from the 'Trolox radical scavenging standard curve. When the radical scavenging rate of the food or drink according to the present invention is equal to or higher than, for example, the positive control vitamin C or E, the food or drink according to the present invention has a good antioxidant effect. It can be judged that it has.
  • Non-roasted bean leaves are anti-hyperlipidemic, antihypertensive, cancer cell growth inhibitory, cancer cell apoptosis-inducing, reactive oxygen species producing, and hypoglycemic action Or, no antioxidant action is observed.
  • an extract or purified product of bean koji leaf or koji tea an anti-lipidemia action, an antihypertensive action, a cancer cell proliferation inhibiting action, a cancer cell apoptosis inducing action, an active oxygen It is possible to produce a food or drink or a pharmaceutical product having a seed production action, a hyperglycemic action and / or an antioxidant action.
  • Fig. 1 shows rats in the control group and the bi ⁇ tea group during the breeding period in Example 1. The result of having investigated the weight transition of is shown.
  • FIG. 2 shows the results of examining the total cholesterol level in the blood of the rats of the control group and the bime tea group in Example 1.
  • FIG. 3 shows the results of examining the amount of HDL cholesterol in the blood of the rats in the control group and the bime tea group in Example 1.
  • FIG. 4 shows the results of examining the amount of triglyceride in the blood of the rats of the control group and the green tea group in Example 1.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the weights of the liver, the peripheral testicles, and the adipose tissue around the kidneys of the rats in the control group and the bicha tea group after the breeding in Example 1.
  • FIG. 6 shows the results of examining the body weight changes of the mice in the control group and the bi ⁇ tea group during the breeding period in Example 1.
  • FIG. 7 shows the results of measurement of the weight of the fat tissue around the kidney and the accessory testicles of the mice in the control group and the birch tea group after the breeding in Example 1.
  • FIG. 8 shows changes in blood glucose levels of mice in the control group and the bi ⁇ tea group during the breeding period in Example 2.
  • FIG. 9 shows the results of the glucose tolerance test of mice in the control mouth group and the bibi tea group after breeding in Example 2.
  • FIG. 10 shows the measurement results of blood HbAlC values in mice of the control group and the bi ⁇ tea group after the glucose tolerance test in Example 2.
  • FIG. 11 shows a thin-layer chromatograph of the dried crude fraction in Example 3.
  • FIG. 12 shows the transition of the blood glucose level of the mice in the control group and each rice bran and tea group during the breeding period in Example 3.
  • FIG. 13 shows the results of the glucose tolerance test of the mice in the control group after breeding in Example 3 and in the bi ⁇ tea group fed with fractions 3 and 4.
  • ⁇ -Fig. 14 shows the measurement results of blood HbAlC values in mice of the control group and each of the bicha tea groups after the glucose tolerance test in Example 3.
  • FIG. 15 shows a thin-layer chromatograph of the crude fraction in Example 4.
  • FIG. 16 shows the results of examining the antioxidant action of the crude fraction in Example 4.
  • Figure 17 shows the antioxidant activity of the crude fraction prepared in Example 3 in Example 5. The results of the investigation are shown.
  • FIG. 18 shows the results of examining the antioxidant action of the crude fraction further obtained from fraction 3 of Example 3 in Example 5.
  • FIG. 19 shows the results of examining the antihypertensive effect of Nemebiwa tea extract in Example 6.
  • FIG. 20 is a photograph of an agarose gel electrophoresis in Example 8, showing the results of examining the apoptosis-inducing action of the crude fraction of Example 3.
  • FIG. 21 is a photograph of an agarose gel electrophoresis in Example 8, showing the results of examining the apoptosis-inducing action of the crude fraction further obtained from fraction 3 in Example 3.
  • FIG. 22 shows the results of examining the effect of active oxygen species production on the cancer cells of the crude fraction of Example 3 in Example 9.
  • FIG. 23 shows ligation obtained by examining the effect of reactive oxygen species production on cancer cells of the crude fraction further obtained from fraction 3 of Example 3 in Example 9. Best Mode for Carrying Out the Invention ''
  • Nemebiwa tea used in the following examples is commercially available from Totsugawa Farm, Kagoshima Agricultural Production Corporation. -In addition, the results in the figure accompanying each example are shown as the average value or average soil standard deviation of each group.
  • Nejimebiwa tea 50 g sold with hot water (400 ml). This was repeated three times. The obtained hot water extract was subjected to freeze-drying (Tokyo Rikakikai Co., LTD, Freeze Dryer FR-1) to obtain a dry powder.
  • the total dry weight of Nemebiwa tea used was 346.2 g, and the total dry powder amount of the hot water extract was 57.37 g. Therefore, the dry powder content of the hot water extract relative to Nemebiwa tea was 16.57%.
  • Wistar rats Japan SLC
  • KKAy mice Claire Japan
  • the materials weighed so that the proportions shown in Table 1 below were mixed, kneaded with distilled water, and then dried in a freeze dryer. It was used as a food (a rat or a mouse fed with the food was referred to as a “control mouth group” in this example). Also, add the dry powder of the hot water extract obtained in (1 ') above to the control food so that it becomes 1%, and add this to the Nemebiwa tea group food (the rat or mouse fed with the food). In this example, it was used as “biso tea group”.
  • Rats were weighed every 3 days during the breeding period. In addition, both groups used tap water for the water supply of the rats, and the water supply was free during the breeding period.
  • each animal was anesthetized with Nembutal, blood was collected from the heart, and serum lipids were analyzed. In addition, the organs of each group of rats were excised and weighed.
  • Figure 1 shows the results of rat body weight measurement.
  • Figure 1 shows the results of examining the weight transition of rats in both groups during the breeding period.
  • the black circles are the results for the rats in the control group
  • the white circles are the results for the rats in the bi ⁇ cha group.
  • FIGS. 2 to 4 The analysis results of serum lipids after breeding are shown in Figs.
  • Figure 2 shows the results of examining the total cholesterol content in the blood (m g / dl).
  • Figure 3 shows the results of examining the amount of HDL cholesterol in the blood (rag / dl).
  • Figure 4 shows the results of examining the amount of triglyceride (mg / dl) in the blood.
  • control is the result for the rats in the control group
  • “bi ⁇ cha” is the result for the rats in the bi ⁇ tea group.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the weight of rat liver, rat testicles, and adipose tissue around the kidney after the breeding.
  • control is the result of the rats in the control group
  • b ⁇ cha is the result of the rats in the boiled tea group.
  • the weight of the rats in the bicha tea group compared with the weight of the rats in the control group. It can be seen that gag is lower. In particular, with regard to the weight of adipose tissue around the kidney, it can be seen that the weight of rats in the bi ⁇ cha group is significantly lower (* indicates P, 0.05 in Fig. 5).
  • mice were divided into a control group (10 animals) and a bime tea group (10 animals), and the control group mice were allowed to freely take control food.
  • mice in the bi ⁇ cha group were allowed to freely consume Nemebiwa tea group food. Both groups were raised for 7 weeks each.
  • mice were weighed every 3 days. 'In addition, both groups used tap water for the water supply, and the water supply was free during the breeding period.
  • each animal was anesthetized with Nembutal, and the organs of each group of mice were removed and their weights were measured.
  • FIG. Figure 6 shows the results of examining the weight transition of mice in both groups during the breeding period.
  • the black circles are the results for the control group of mice, and the white circles are the results for the Biwacha group of mice.
  • * indicates P and 0.05, and ** indicates P and 0.01. '
  • Fig. 7 shows the results of examining organ weights after breeding.
  • Fig. 7 shows the results of measuring the weight of adipose tissue around the kidney and the accessory testicle after the breeding.
  • control is the result of the mice in the control group
  • bi ⁇ cha is the result of the mice in the bi ⁇ tea group.
  • Nemebiwa tea 50 g was extracted with hot water (400 ml). This was repeated three times. The obtained hot water extract was freeze-dried (Tokyo Rikakikai Co., LTD, Freeze Dryer FR-1) to obtain a dry powder.
  • the total dry weight of Nemebiwa tea used was 30.0 g, and the total dry powder amount of the hot water extract was 51.73 g. Therefore, the dry powder content of the hot water extract relative to Nemebiwa tea was 17.24%.
  • mice KKAy mice (CLEA Japan) were used as hyperglycemic (type I type I diabetes model) mice.
  • the ingredients weighed so as to have the ratios shown in Table 1 above were mixed, kneaded with distilled water, and then dried in a freeze dryer.
  • the mice fed with the food were referred to as “control group” in this example).
  • the dry powder of hot water extract obtained in (1) above was added to the control food so that it would be 1%, and this was added to the Nemebiwa tea group (the mice fed this food were In the example, it was used as “biso tea group”.
  • mice were divided into a control group (10 animals) and a bime tea group (10 animals), and the control group mice were allowed to freely ingest control food.
  • mice in the bi ⁇ cha group were given free access to Nemebiwa tea group food. Both groups were raised for 7 weeks each.
  • Tap water was used in both groups for water supply to mice, and free water was provided during the breeding period. During the breeding period, blood glucose levels of mice were measured every other week. The enzyme electrode method was used for blood glucose level measurement.
  • Figure 8 shows the changes in blood glucose levels during the breeding period.
  • the black circles are the results for the control group mice, and the white circles are the results for the Biwacha group mice.
  • each group of mice was fasted for 14 hours, and glucose was administered thereto.
  • the dose of glucose was 4 g / 10 ml of glucose (distilled water) with a mouse body weight of xl / 200 (ml). This dose was injected directly into the stomach of each mouse with a stainless steel sonde and forcibly administered. After administration, blood glucose levels were measured over time.
  • the mouse was anesthetized with Nembutal, blood was collected from the heart, and the value of HbAlC was measured.
  • Figure 9 shows the results of the glucose tolerance test after breeding.
  • the black circles are the results for the control group of mice, and the white circles are the results for the Biwacha group of mice.
  • * indicates P is 0.05.
  • control is the result of the mice in the control group
  • bi ⁇ cha is the result of the mice in the bi ⁇ tea group.
  • the blood HbAlC value of mice in the BY tea group was significantly higher than the blood HbAlC value of mice in the control group (in Fig. 10, ** is P + 0.01). It shows that it is low. '
  • Nemebiwa tea 50 g was extracted with hot water (400 ml). This was repeated three times. The resulting hot water extract was freeze-dried (Tokyo Rikakikai Co. 'LTD, Freeze Dryer FR-1) The dried powder was obtained. The total dry weight of Nemebiwa tea used was 950.0 g.
  • the obtained hot water extract was cooled and then sequentially applied to an open column chromatogram of MCI gel CHP-20P.
  • the amount of gel is preferably about 1 kg as a dry weight.
  • the glass column used had an inner diameter of 8 cm. In this embodiment, a glass column is used, but the material of the column is not limited to glass, acrylic material, or the like.
  • the solvent is eluted with water (2L), 30% aqueous ethanol (2L), 70% aqueous ethanol (2L) and water-acetonone (1: 1 ratio) (2L) to obtain 4 fractions. It was.
  • the yield of the four dry crude fractions was 90.0 g of the dry crude fraction eluted with water (2 L) (hereinafter referred to as “Fraction 1”) and the dry crude fraction eluted with 30% aqueous ethanol (2 L). 45.3 g of the dry crude fraction (hereinafter referred to as “Fraction 2”) and 18.3 g of the dry crude fraction (hereinafter referred to as “Fraction 3”) eluted with 70% aqueous ethanol (2 L).
  • the dry crude fraction (hereinafter referred to as “Fraction 4”) eluted with water-acetone (1: 1 ratio) (2 L) was 2. lg.
  • TLC Thin Layer Chromatography
  • fractions 1 and 2 contain a chlorogenic acid-like substance in the vicinity of an Rf value of about 0.1. It can also be seen that fractions 3 and 4 do not contain much organic and chlorogenic acid-like substances.
  • mice (CLEA Japan) were used as hyperglycemic (type II diabetes model) mice.
  • the ingredients weighed so as to have the ratios shown in Table 1 above were mixed, kneaded with distilled water, and then dried in a freeze dryer. Mice fed with the food were used as “control group” in this example.
  • Fraction 1, Fraction 2 or Fraction 3 and 4 obtained in (1) above. was added to the control bait to 1% each, and used as Nemebiwa tea group bait (the mice fed with the bait respectively were collectively referred to as the “boiled tea group” in this example). .
  • mice were used in 32 experiments. Give mice a control group (8 animals), feed for Nemebiwa tea group containing fraction 1 Bean tea group (eight animals), bean meal give food for Nemebiwa tea group containing fraction 2 Divided into 4 groups: 8 tea groups, Biso tea group (8 animals) fed with Nemebiwa tea group containing a mixture of fractions 3 and 4, and 1 day for mice in the control group At one time, they were fed 1,5g of control food, and the shortage was fed with mouse sales. In addition, mice in each bi ⁇ cha group were fed once a day with 1.5g of control food and 15mg of each fraction of Nemebiwa tea group feed. Was given a state of satiation. Each group was raised for 7 weeks. For each group, tap water was used for water supply and free water was used during the breeding period.
  • mice blood glucose levels of mice were measured every other week.
  • the enzyme electrode method was used for blood glucose level measurement.
  • Figure 12 shows the changes in blood glucose levels during the breeding period.
  • the black circles are the results for the mice in the control mouth group
  • the white squares are the mice from the Biwacha group that have been fed the Nemebiwa tea group food containing fraction 1.
  • Is the result of The white triangles are the results for the bime tea group mice fed with the food for screw mebiwa tea group containing fraction 2
  • the white circles are the screws containing fractions 3 and 4. This is the result of the mouse of the bime tea group fed with food for mebiwa tea group.
  • each of the 4 groups of mice was fasted for 14 hours and glucose was administered thereto.
  • the dose of buducose is 4g / 10ml of buducose (steamed) with mouse body weight X 1/200 (ml). Retained water). This dose was injected directly into the stomach of each mouse with a stainless steel sonde and forcibly administered. After administration, blood glucose levels were measured over time.
  • the mouse was anesthetized with Nembutal, blood was collected from the heart, and the value of HbAlC was measured.
  • Fig. 13 shows the results of the glucose tolerance test conducted on the Biwacha group fed with fractions 3 and 4 after the rearing.
  • the black circle is the result of the control group of mice
  • the white circle is the mouse of the Biwacha group fed with the Nemebiwa tea group containing fractions 3 and 4. Is the result of
  • the blood glucose level of the bi ⁇ cha group fed with fractions 3 and 4 was increased rapidly immediately after administration by glucose administration, and about 500 mg after 15 minutes. It rose to / dl. It can be seen that after 30 minutes, the control group continues to rise and then declines. On the other hand, it can be seen that in the green tea group fed with minutes 3 and 4, the blood glucose level began to decrease after 30 minutes and then decreased rapidly. In particular, after 30 and 60 minutes, it can be seen that the value is significantly lower (in Fig. 13, '* indicates P is 0.05).
  • FIG. 14 the measurement results of blood HbAlC levels after the glucose tolerance test are shown in FIG. In Fig. 14, “Control” is the result of the control group of mice, and “Biwacha 1” is the result of the Biwacha group fed with the Nemebiwa tea group containing fraction 1. Mouse results. In addition, it is the result of the mice of the Biwacha group that was fed with the feed for Nemebiwa tea group containing Fraction 2, and the Bibicha (3 + 4) force fraction 3 4 is a result of mice of the bi ⁇ cha group fed with Nemebiwa tea group food containing 4 and 4.
  • Nemebiwa tea (1247 g) was extracted with 80% aqueous acetone (5000 ml). This was repeated three times. From the obtained 80% aqueous acetone extract, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a syrupy extract (448.2 g). Part of the resulting extract (278g) was collected And subjected to column chromatography of MCI gel CHP-20P. The amount of gel is preferably about 1 kg as dry weight.
  • the glass column used had an inner diameter of 8 cm. In this embodiment, a glass column is used, but the material of the column is not limited to glass or acrylic material. Chromatography was performed by using a linear gradient from solution A to solution B using water as the solution A and methanol as the solution B as the mobile phase.
  • crude fraction 1 was obtained by combining fraction solutions eluted from liquid A and liquid B at a ratio of 1: 0 (300 ml) and 95: 5 (300 ml).
  • the crude fraction 2 was obtained by combining the fraction solutions eluting A liquid and B liquid at 9: 1 ratio (300 ml), 8: 2 ratio (300 ml) and 7: 3 ratio (300 ml). did.
  • the fraction solution obtained by eluting the A solution and the B solution at a ratio of 6: 4 (300 ml) was designated as crude fraction 3.
  • the fraction solution obtained by eluting the A solution and the B solution at a ratio of 5: 5 (300 ml) was designated as crude fraction 4.
  • the fraction solution obtained by eluting the A solution and B solution at a ratio of 4: 6 (300 ml) was designated as crude fraction 5.
  • the fraction solution obtained by eluting the A solution and the B solution at a ratio of 3: 7 (300 ml) was designated as crude fraction 6.
  • the fraction solution in which A solution and B solution were eluted at a ratio of 2: 8 (300 ml) was designated as crude fraction 7.
  • the fraction solution in which A liquid and B liquid were eluted at a ratio of 1: 9 (300 m 1) was designated as crude fraction 8.
  • the fraction solution obtained by eluting the A solution and the B solution at a ratio of 0: 1 (300 ml) was designated as crude fraction 9.
  • crude fractions 1 to 9 were obtained.
  • the yield of the nine crude fractions is 12.3 g for crude fraction 1, 12.8 g for crude fraction 2, 0.4 g for crude fraction 3, 2.9 g for crude fraction 4, and crude fraction 5 was 8.3 g, crude fraction 6 was 6.7 g, crude fraction 7 was 19.9 g, crude fraction 8 was 5.0 g, and crude fraction 9 was 4.9 g.
  • the TLCs of crude fractions 2-8 are shown: Shown in 5.
  • numbers 2 to 8 indicate the results of crude fractions 2 to 8, respectively.
  • the developing solvent used for TLC was three types of solvents: benzene-ethyl formate-formic acid, and the ratio was mixed at a solution volume of 3: 6: 1.
  • the coloring reagent used was a solution in which about 5% of ferric chloride (FeCl 3 ) was dissolved in methanol, and the compound was detected by color spraying directly onto TLC. As shown in Fig. 15, it can be seen that the substance that develops color from green to blue is a phenolic substance.
  • the antioxidant activity experiment was performed using the method described in the following literature (Harwat, K. S. M. et al., Free Radical Res., 36: 177-187, 2002).
  • the sample was prepared by adjusting each of the nine crude fractions obtained in (1) above to a concentration of 10 g / ml.
  • dry powder of hot water extract of Biso tea was used at a concentration of 10 g / ml.
  • a prepared product a standard product prepared by adjusting vitamin C (ascorbic acid) at a concentration of 5 g / m 1 and vitamin E adjusted at a concentration of S / zg / ml was used. Place these samples in a flat-bottom plate (96-well), add DPPH (1, 1-dipheny l-2-picrylhydrazyl, adjusted to the concentration of micromolar) 190 ⁇ and mix for 10 seconds. , Protected from light and left for 30 minutes.
  • FIG. 16 shows the experimental results of the antioxidant activity.
  • the sample numbers 1-9 correspond to the crude fractions 1-9, respectively.
  • Sample No. 10 is a dry powder of hot water extract of bean tea.
  • VC is vitamin C
  • VE is vitamin E.
  • crude fractions 6, 8 and 9 have a strong antioxidant effect. The degree is about the same as or higher than vitamin E, and about half that of vitamin C.
  • the antioxidant effect of crude fractions 6, 8 and 9 is about 3 times stronger than the dry powder of hot water extract of bi ⁇ cha.
  • Samples were the four crude fractions obtained in Example 3; fractions 1 to 4 were each adjusted to a concentration of 10 ⁇ g / ml, and Nejimebiwa tea obtained in Example 1 as a control.
  • the dry powder of hot water extract used was adjusted at a concentration of 10 / g / m l.
  • These samples were applied to a flat-bottomed plate (96wel l) [1 and DPPH (1, l_diphenyl-2-picrylhydrazyl, adjusted at the concentration of the mouth mouth mora) to 190 ⁇ 1. In addition, after mixing for 10 seconds, it was left for 30 minutes in the dark.
  • the reaction solution of each well was measured with a microplate reader using the absorbance at a wavelength of 490 nm, and the Trolox concentration was converted from the absorbance value using the Trolox absorbance standard curve. From the converted values, the radical scavenging rate was calculated from the Trolox radical scavenging standard curve.
  • Figure 17 shows the experimental results of the antioxidant activity.
  • the vertical axis represents DPPH radical scavenging rate as%
  • the horizontal axis fraction 1 to fraction 4 samples are the fractions 1 to 4 prepared in Example 3, respectively.
  • Bi ⁇ cha is a dried powder of Nemebiwacha hot water extract obtained in Example 1.
  • Fraction 2 Fraction 3 and Fraction 4 have a strong antioxidant effect. It can be seen that the degree is greater than the effect of Nemebiwa tea hot water extract obtained in Example 1. In addition, it can be seen that the antioxidant effect of Fraction 3 is about 1.6 times stronger than the dry powder of Nemebiwa Chatoyu extract obtained in Example 1.
  • a dry powder of fraction 3 obtained in Example 3 (5.0 g) was weighed, dissolved in an appropriate amount of water, and subjected to open column chromatography.
  • a solution mobile phase (H 2 0) Methanol (MeOH) was used as the B liquid, and various chromatographies were performed by increasing the content of the B liquid from the A liquid.
  • the solvent is 80%
  • Samples were obtained in Example 3 as a control and the 9 crude fractions obtained in (2) above: fractions 3-1 to 3-9 adjusted to a concentration of 10 ⁇ g / ml, respectively.
  • a dry powder prepared from fraction 3 at a concentration of 10 ⁇ g / ml was used.
  • fractions 3-1, 3-2 and 3-4 have a strong antioxidant effect. It can be seen that the degree is larger than the effect of fraction 3 prepared in Example 3. In particular, it can be seen that the antioxidant effect of fraction 3-1 is about 1.37 times stronger than the dry powder of fraction 3.
  • SHR rats rats with spontaneous hypertension males (5 weeks old) (manufactured by SLC, Japan) were used to measure blood pressure using two I. These rats were divided into a control group (6 animals) and a bi ⁇ cha group (6 animals), and the control group rats were allowed to freely ingest control food. Rats in the bi ⁇ cha group were given free access to Nemebiwa tea group food. Both groups were reared for 50 days each.
  • the breeding room was 23 ° C and .12 hours lighting (7: 00-19: 00) '.
  • an unheated force-type blood pressure measuring device (Muromachi Kikai Co., Ltd.) was used as a blood pressure measuring device.
  • Figure 19 shows the changes in blood pressure in rats in both groups during the breeding period.
  • the open circle is the label for the control group.
  • the black circles are the results for the rats of the bi ⁇ cha group.
  • the blood pressure (maximum blood pressure) was measured from a certain time (around 10:00 in the morning). The measurement was repeated 10 times on average for each individual and expressed as the average value. Vertical bars indicate standard error.
  • blood pressure values fluctuate very easily, and can fluctuate very easily depending on the mental state and environmental conditions of the rat. Went under.
  • the average value of the maximum blood pressure in the control group and the bi-tea group was about 134 mmHg at the start.
  • the blood pressure in the control group increased over 10 days with the passage of the breeding period, and remained fairly high after 20 days.
  • the Biwacha group did not increase until 21 days, and was significantly different from the control group on the 21st (P ⁇ 0. 05).
  • the force S increased with the progress of the experiment days, and the blood pressure was lower by 10 mmHg or less than that of the control group, and the effect of Nejimewa tea extract on the suppression of hypertension was recognized.
  • Nemebiwa tea extract suppresses an increase in blood pressure.
  • HL-60 cells human acute promyelocytic leukemia disease cells
  • HL-60 cells were cultured using RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum. Concentrate 0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, ug / ml of dry powder of Nemebiwacha hot water extract obtained in Example 1 and fractions 1-4 prepared in Example 3
  • HL-60 cells were treated with 0.1% DMS0 (dimethyl sulfoxide) solution and treated for 6 hours.
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • the extract in Table 3 is the result of dry powder of Nemebiwa tea hot water extract obtained in Example 1.
  • fractions 2-4 had a relatively strong HL-60 cell growth inhibitory effect on the dried powder of Nemebiwa-cha hot water extract. Among them, it can be seen that Fraction 4 has the strongest HL-60 cell growth inhibitory effect.
  • HL-60 cells The 50% viability of HL-60 cells was measured by the method described in the following literature (Mo-smann, T., J. Immunol. Methods, 65: 55-63, 1983).
  • HL-60 cells were cultured using RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum. Dry powder of Nemebiwa tea hot water extract obtained in Example 1 and fractions 3-1 to 3-9 prepared in Example 5 were added at 0, 25, 50, 75, 100, 125, 150 ⁇ g.
  • HL-60 cells were treated for 6 hours in 0.1% DMS0 (dimethyl sulfoxide) solution to contain at a concentration of / ml.
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • fractions 3-1, 3-2 and 3-4 had a relatively strong HL-60 cell growth inhibitory effect. Among them, it can be seen that Fraction 3-4 has the strongest HL-60 cell growth inhibitory effect.
  • Example 8 Effect of the crude fraction of Nemebiwa tea on apoptosis induction of cancer cells
  • DNA fragmentation of human acute promyelocytic leukemia disease cells was measured by the method described in the following literature (Hou, DX et al., Int. J. Oncol., 23: 705-712). , 2003).
  • Fraction 2, fraction 3 and fraction 4 prepared in Example 3 were adjusted to three concentrations of 250, 500 and 750 g / ml, and HL-60 cells were treated for 6 hours to extract DNA from the cell nucleus. did.
  • the obtained DNA was subjected to agarose gel electrophoresis, and the results are shown in FIG. 'In Fig. 20, M is a DNA marker, and C is a control at a concentration of O / ig / ml.
  • M is a DNA marker
  • C is a control at a concentration of O / ig / ml.
  • DNA ladders were observed at concentrations of 500 ig / ml and 75'C ig / inl in fraction 3, indicating that apoptos
  • ⁇ is a DNA marker and C is a control at a concentration of 0 / g / ml.
  • DNA ladders were observed in fractions 3-1, 3-2, 3-4, and 3-6, indicating that apoptosis was induced.
  • strong DNA ladders are observed in fractions 3-2 and 3-4, indicating that apoptosis is strongly induced.
  • HL-60 cells Human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-60 cells) were passaged at 2.0 x 10 6 cel ls I ml. This was diluted 4-fold with 'RPMI1640 medium to give 2.0 ⁇ 10 5 cells / 400 1. The required amount is 400 ⁇ cell fluid per well, so 20 ml of cell fluid was prepared per plate. This was cultured for 24 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 stream while gently shaking the plate to prevent cell bias. -
  • control represents a control.
  • the extract is Nemebiwa tea hot water extract prepared in Example 1.
  • Fraction 3 is HL-60 thin It can be seen that it has a strong ability to produce active oxygen in the vesicle.
  • HL-60 cells were passaged at 2.0 ⁇ 10 6 cel ls / ml. This was diluted 4-fold with RPMI1640 medium to 2.0 ⁇ 10 5 cells / 400 ⁇ 1. The required amount was 400 1 cell solution per wel l, so 20 ml cell solution was prepared per plate. This was cultured for 24 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 stream while gently shaking the plate to prevent cell bias.
  • fractions 3-1 to 3_9 prepared in Example 5 were added to the culture solution so as to have a concentration of 500 ⁇ g / ml. This was incubated for 15 minutes at 37 ° C, of 5% C0 2 incubator. After culture, MTT solution (5 mM DCFH-DA: 1 mg of DCFH-DA dissolved in 413 ⁇ 1 of ethanol; DCFA-DA, dichlorofluorescin 2 acetic acid) 1.6 / 1 each dispensed, subsequently, it was incubated 30 min further at 37 ° C, 5% C0 2 Inkyubeta one under a stream of air.
  • MTT solution 5 mM DCFH-DA: 1 mg of DCFH-DA dissolved in 413 ⁇ 1 of ethanol; DCFA-DA, dichlorofluorescin 2 acetic acid
  • chondrol indicates a control.
  • fractions 3-3-2, 3-3 and 3-5 have a stronger ability to produce active oxygen than the control.
  • Fraction 3-1 has about 2.6 times stronger active and reproductive oxygen producing capacity than HL-60 cells compared to the control.
  • Industrial Applicability-According to the present invention antihyperlipidemic action, antihypertensive action, cancer cell proliferation inhibitory action, cancer cell apoptosis inducing action, reactive oxygen species producing action, hyperglycemia lowering action and / or anti A food / beverage product or a pharmaceutical product having an oxidizing action and containing an extract or purified product of bime leaf or bime tea is provided.
  • the food / beverage products (especially health supplements or foods for specified health use) or pharmaceutical products according to the present invention have an antihyperlipidemic action, an antihypertensive action, a cancer cell proliferation inhibiting action, Anti-hyperlipidemic agent, antihypertensive agent, cancer cell proliferation inhibitor, cancer cell apoptosis inducer, because it has a cell apoptosis inducing action, reactive oxygen species producing action, hyperglycemic lowering action and / or antioxidant action It can be used as a reactive oxygen species generator, a hyperglycemic agent, and an antioxidant.

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Abstract

　本発明は、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を有効成分として含有し、且つ抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び抗酸化作用から成る群から選択される1以上の作用を有する飲食品又は医薬品に関する。

Description

ビヮ葉抽出物を含有する飲食品及び医薬品 技術分野
本発明は、 例えば抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌 細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び/又は抗酸 化作用を有する飲食品又は医薬品及明びその製造方法に関する。 背景技術 書
ビヮ葉は、 ビヮ茶の嗜好飲料に利用され、 ビヮ茶として親しまれているのみな らず、 古くから漢方に配合される薬として用いられている。
近年、 ビヮ葉の有する機能性が明らかにされつつある。 例えば、 ビヮ葉に含ま れているポリフエノール成分のヒ トロ腔癌細胞に対する細胞傷害活性 （非特許文 献 1 )、 ビヮ葉に含まれるメガスチグマン配糖体の抗発癌プロモーション作用 （非 特許文献 2 )、 ビヮ葉の抗腫瘍活性作用 （非特許文献 3 ) 及び抗酸化作用'（非特許 文献 4 ) などが報告されている。
本出願人が出願した特許文献 1には、 ビヮ葉を利用して風味のあるビヮ茶を多 量に製造する方法及び製造設備が開示されている。 本出願人は特許文献 1に記載 のビヮ茶の製造設備を用いて、 トルマリン石焙煎によりねじめびわ茶を製造して いる。製造したねじめびわ茶については、 「糖尿の血糖値が下がった」、 「高血圧の 血圧が正常になった」 などの声が消費者より寄せられているが、 その実証的な証 拠は確認されていなかった （非特許文献 5 )。
一方、 特許文献 1の段落番号 「0 0 0 4」 に 「従来のビヮ茶製造の材料となる ビヮの葉は、 果実の収穫を目 とした果実栽培種が利用されているため、 栄養分 は果実に集まり、 ビヮの葉に栄養分が十分に行き渡らないため、 薬用として利用 しても本来の効果は得られないという欠点がある」 という記載があるように、 従 来では、 ビヮ葉は薬用として十分に効果を発揮していなかった。
従来において、 ビヮには以下のような活性又は利用方法があることが開示され ている。
特許文献 2には、 ビヮ又はその抽出物がマトリ ックスメタ口プロティナーゼ (MMP-1)阻害活性を有することが開示されている。
特許文献 3には、 ビヮの木の葉を焼いて炭にして粉末状食品素材とすることが 開示されている。
特許文献 4には、 ビヮの生葉を切断し、 蒸気で蒸し、 熱風を送りつつ揉み、 乾 燥させ、 整形した後、 再度乾燥させることにより香気と旨味とを増すように仕上 げることを特徴とした漢方茶の製造方法が開示されている。
特許文献 5には、 イネ科植物の葉緑健康茶とビヮの *葉を混合し、 より多くの γ -ァミノ酪酸を含有する健康茶の製造方法が開示されている。
特許文献 6には、果実部を除く ビヮの抽出物がひ -ダルコシダーゼ阻害活性を有 することが開示されている。
特許文献 7には、 シャキヨタとビヮ葉を混合した滋養強壮健康増進用組成物が 開示されている。
特許文献 8には、 黄杞の葉を焙煎処理したものをビヮ茶と混合してなる健康茶 が開示されている。
特許文献 9には、 甘茶とビヮの混合物で構成する健康茶が開示されている。 特許文献 1 Qには、 バラ科ビヮ属の有機抽出物を含む組成物が生物における C0X-2活性を阻害することが開示されている。 特許文献 1 特許第 3452351号公報
特許文献 2 特開 2005-008539号公報
特許文献 3 特開 2004-154108号公報
特許文献 4 特開 2004-105036号公報
特許文献 5 特開 2002-0652 7号公報
特許文献 6 特開 2001-163795号公報
特許文献 7 特開 2001-163792号公報
特許文献 8 特開平 7- 274832号公報
特許文献 9 特開平 5-056772号公報 特許文献 1 o 特表 2004-529079号公報
非特許文献 1 Ito, H.ら， 「Chem. Pharm. Bul l .」， 2000年， 第 48卷， p. 687-693 非特許文献 2 吉田隆志ら， 「Bio Industry] , 2003年， 第 20卷， p. 27 - 33 非特許文献 3 Ito, H.ら， 「J. Agric. Food Chem.」 ， 2002 年， 第 50 卷， p. 2400-2403
非特許文献 4 Jung, H.ら， 「Arch. Pharm. Res. J， 1999年， 第 22卷， p. 213-218 非特許文献 5 農業生産法人有限会社十津川農場， 「ねじめびわ茶パンフレツト」， 2004年 発明の開示
上述したように、 従来ではビヮ葉に含まれる種々の生物学的活性や活性化合物 の存在が明らかにされたものの、ビヮ葉が高血糖値の降下作用、高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘導作用、 活性酸素種産生作用、 抗高 脂血症作用等の効果を有することは知られていなかった。 これらの効果が確認で きれば、 ビヮ葉を糖尿病、 高脂血症、 高血圧症、 癌等の疾患の予防又は治療に使 用できるものと考えられる。
そこで、 本発明は、 上述した実情に鑑み、 ビヮ葉を用いた、 抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘導作用、 活性酸素 種産生作用、高血糖降下作用及び/又は抗酸化作用を有する飲食品又は医薬品及び その製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 ビヮ茶を熱水 抽出に供し、 得られた抽出物をモデルマウス又はラットに給餌することで、 血糖 値を低下させ、 またコレステロール及びトリグリセリ ド等の血清脂質並びに脂肪 組織の重量を低下させることを見出した。 また、 ビヮ茶の抽出物から得られた粗 製分画物は強い抗酸化作用を有することを見出した。
更に、 ビヮ茶を熱水抽出に供し、 得られた抽出物をモデルマウス又はラットに 給餌することで、 血圧の上昇を抑制し、 また、 癌細胞に直接作用させることによ つてその増殖を抑制し、 更にまた、 癌細胞に対してアポトーシス誘導すること及 び. Z又は活性酸素種を産生させることを見出し、 本発明を完成するに至った。 本発明は以下を包含する。
(1 ) ビヮ葉又はビヮ茶の抽出物又は精製物を有効成分として含有し、 且つ抗 高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘導 作用、 活性酸素種産生作用、 高血糖降下作用及び抗酸化作用から成る群から選択 される 1以上の作用を有する飲食品又は医薬品。
(2) 上記ビヮ茶がねじめびわ茶であることを特徴とする、 （1 ) 記載の飲食品 又は医薬品。
(3) 上記精製物がクロロゲン酸、 クェルセチン 3-サンブビオシド、 メチルク ロロゲン酸、 ケンフエロール 3-ラムノシド、 クェノレセ'チン 3-ラムノシド、 2oc_ ヒ ドロキシゥルソール酸及びウルソール酸から成る群から選択される 1以上の化 合物を含まないことを特徴とする、 （1 ) 記載の飲食品又は医薬品。
(4) 上記飲食品が抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘導作用、 活性酸素種産生作用、 高血糖降下作用及ぴ抗酸化 作用から成る群から選択される 1以上の作用を有する旨の表示を有するものであ ることを特徴とする、 （1 ) 記載の飲食品又は医薬品。
(5) ビヮ葉又はビヮ茶を熱水抽出又は溶媒抽出に供し、 抽出物を得る工程を 含むことを特徴とする、抗髙脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘導作用、 活性酸素種産生作用、 高血糖降下作用及び抗酸化 作用から成る群から選択される 1以上の作用を有する飲食品又は医薬品の製造方 法。
(6) 上記抽出物を精製手段に供し、 精製物を得る工程をさらに含むことを特 徴とする、 （5) 記載の製造方法。
' (7)上記精製手段がカラムクロマトグラフィーであることを特徴とする、 （6) 記載の製造方法。 . ·
(8) 上記ビヮ茶がねじめびわ茶であることを特徴とする （5) 記載の製造方 法。 '
(9) 上記精製物がクロロゲン酸、 タエルセチン 3-サンブビオシド、 メチルク ロロゲン酸、 ケンフェローノレ 3-ラムノシド、 クェルセチン 3-ラムノシド、 2α- ヒ ドロキシゥルソール酸及びウルソール酸から成る群から選択される 1以上の化 合物を含まないことを特徴とする、 （6 ) 記載の製造方法。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明に係る飲食品又は医薬品は、 ビヮ葉又はビヮ茶の抽出物又は精製物を有 効成分として含有し、 且つ抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作 用、 癌細胞アポトーシス誘導作用、 活性酸素種産生作用、 高血糖降下作用及び抗 酸化作用から成る群から選択される 1以上の作用を有するものである。 本発明に 係る飲食品又は医薬品をヒ ト等の動物に摂取又は投与することにより、 高脂血症 や高血圧症を予防又は治療することができる。 また、 本発明に係る飲食品又は医. 薬品をヒ ト等の動物に摂取又は投与することにより、 癌細胞の増殖を抑制し、 癌 細胞にアポトーシスを誘導せしめ、 癌細胞に活性酸素種を産生せしめることがで きる。 さらに、 本発明に係る飲食品又は医薬品をヒ ト等の動物に摂取又は投与す ることにより、 血糖値を低下させ、 また活性酸素等を取り除くことができる。 ここで、 抗高脂血症作用とは、 血中のコレステロールゃトリグリセリ ドを低下 させることを意味する。 また、 高血圧抑制作用とは、' 血圧の上昇を抑えることを 意味する ς
癌細胞増殖抑制作用とは、 癌細胞を死滅させ、 その増殖を抑えることを意味す る。 また、 癌細胞アポトーシス誘導作用とは、 癌細胞にアポトーシスを誘導せし め、 癌細胞を死滅させることを意味する。 さらに、 活性酸素種産生作用とは、 癌 細胞中に活性酸素種を産生し、 癌細胞を死滅させることを意味する。
また、 高血糖降下作用とは、 血糖値を低下させることを意味する。 さらに、 抗 酸化作用とは、 体内の活性酸素を取り除くことを意味する。
本発明においては、 ビヮ葉又はビヮ茶を用いる。 ビヮ葉としては、 新鮮葉又は 乾燥葉をそのまま使用することができる。 ビヮ茶としては、 いずれのビヮ茶であ つてもよいが、 例えばねじめびわ茶（商品名）が挙げられる σ ねじめびわ茶は、 ト ルマリン石による高温加熱に'より焦がしたもので、 上述した特許文献 1に記載の 方法によって調製することができる。 なお、 ねじめびわ茶（根占枇杷茶）は、 鹿児 島県農業生産法人有限会社十津川農場から Ηΐ販されている。
本発明に係る飲食品又は医薬品に使用する抽出物は、 ビヮ葉又はビヮ茶を熱水 抽出又は溶媒抽出に供することで得ることができる。 例えば、 ビヮ葉又はビヮ茶 を、 熱湯を用いた抽出に供し、 これを 1回又は数回（例えば 3回）繰り返すことで ビヮ葉又はビヮ茶抽出物を得ることができる。 あるいは、 例えば、 ビヮ葉又はビ ヮ茶を水、 低級アルコールゃァセトンなどの有機溶媒を用いた抽出に供すること で、 ビヮ葉又はビヮ茶抽出物を得ることができる。 なお、 本発明においては、 ビ ヮ葉又はビヮ茶抽出物とは、 上記抽出方法で得られた抽出液もしくは各種溶媒抽 出液、 その希釈液、 その濃縮液又はその乾燥粉末を意味する。
また、 本発明においては、 上述したビヮ葉又はビヮ茶抽出物を濾過、 遠心分離 又は精製処理等の精製手段に供することで、 当該抽出物から夾雑物を除去した精 製物を用いることができる。 精製手段としては、 例えば、 カラムクロマトグラフ ィー、 順相又は逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー及ぴゲ ル濾過が挙げられるが、 カラムクロマトグラフィ一が特に好ましい。
例えば、 ビヮ葉又はビヮ茶の水抽出溶液を直接、 逆相用のゲル（例えば、 MCI g el CHP-20P (三菱化学） など）のオープンカラムクロマトグラフィーに付す。 移動 相に A液として水、 B液としてエタノールを用い、 A液と B液との比率を 100 : 0、 30： 70、 70： 30と変えて、 クロマトグラフィーを行う。 最後に C液としてァセト ンを用い、 A液と C液との比率を 50： 50にしてクロマトグラフィーを行う。 A液 と B液との比率が 70： 30で溶出する粗製分画物並びに A液と C液との比率が 50： 50で溶出する粗製分画物には、 強い高血糖降下作用が見られる。 従って、 これら 粗製分画物は、 ピウ葉又はビヮ茶の精製物として好適に本発明に係る飲食品又は 医薬品に使用することができる。
あるいは、 80%永性ァセトンで抽出したビヮ葉又はビヮ茶の抽出溶液を減圧ェ バポレータにて溶媒を留去した後、 残差を逆相用のゲル（例えば、 MCI gel CHP-2
OP (三菱化学）など）のオープンカラムクロマトグラフィ一に付す。移動相に A液と して水、 B液としてメタノールを用い、 A液から B液へのリ.二ァーグラジェントに よってクロマトグラフィーを行う。 最後に C液としてァセトンを用い、 A液と C 液との比率を 50 : 50にしてクロマトグラフィーを行う。 この方法で溶出する粗製 分画物には、 強い抗酸化作用が見られる。 従って、 この粗製分画物は、 ビヮ葉又 はビヮ茶の精製物として好適に本発明に係る飲食品又は医薬品に使用することが できる。 なお、 この粗製分画物には、 クロロゲン酸、 クェルセチン 3 -サンブビォ シド、 メチルク口口ゲン酸、 ケンフエ口一ノレ 3-ラムノシド、 クェルセチン 3-ラム ノシド、 2ひ -ヒ ドロキシゥルソール酸及びゥルソール酸のうち 1以上の化合物が 含まれない。 従って、 本発明に係る飲食品又は医薬品に使用するビヮ葉又はビヮ 茶精製物には、 これら化合物が含まれないことが好ましい。
以上のように説明したビヮ葉又はビヮ茶抽出物又は精製物を有効成分として用 いることで、 本発明に係る飲食品又は医薬品を製造することができる。
本発明の抽出物又は精製物の有効量を、 錠剤、 カプセル、 顆粒、 ドリンク、 ぺ ットボトルなどの任意の形態に添加又は封入する力 \ あるいは任意の食品に添加 することで、 本発明に係る飲食品を得ることができる。 本発明に係る飲食品は、 抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘 導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び/又は抗酸化作用を有する飲食 品、 特に、 健康補助食品又は特定保健用食品として使用することができる。 好ま しくは、 錠剤、'カプセル、 顆粒、 ドリンク、 ペットボトルなどの形態の健康補助 食品又は特定保健用食品とするのがよい。
飲食品には、 例えば、 菓子類、 レトルト食品、 ジュース類、 お茶類、 乳製品な どが含まれるが、 これらに限定されない。 また、 飲食品には、 必要に応じて甘味 剤、 調味料、 乳化剤、 懸濁化剤、 防腐剤などを添加してもよいし、 あるいはビタ ミン類、 栄養剤、 免疫増強剤 （例えば、 プロポリスやきのこ抽出物など） などを 添加してもよレ、。
本発明に係る飲食品に対するビヮ葉又はビヮ茶の抽出物又は精製物の添加量は、 摂取する成人体重 lkgあたり 0. l〜200mgに相当する範囲内の量又は 1 品あたり 例えば 50mg〜lgであるが、 この範囲に限定されない。
一方、 本発明に係る医薬品は、 ビヮ葉又はビヮ茶の抽出物又は精製物の有効量 を含む。 本発明に係る医薬品は、 抗高脂血症用剤、 高血圧抑制剤、 癌細胞増殖抑 制剤、 癌細胞アポトーシス誘導剤、 活性酸素種産生剤、 高血糖降下剤又は抗酸化 剤として使用することができる。
本発明に係る医薬品には、 ビヮ葉又はビヮ茶の抽出物又は精製物以外に、 さら に製薬上許容可能な担体 （賦形剤もしくは希釈剤） 並びに結合剤、 増量剤、 滑沢 剤、 崩壊剤、 湿潤剤、 乳化剤、 緩衝剤、 懸濁化剤、 保存剤、 着色剤、 風味剤及び 甘味剤などから適宜選択される添加剤を含有させることができる。 担体及び添加 剤は、 製剤化のために一般的に使用されるものを、 本発明に係る医薬品の製造に 使用することができる。 例えば、 結合剤の例としては、 デンプン、 ポリ ビニルビ 口リ ドン、 ヒ ドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。 増量剤の例 としては、 ラタ トース、 微結晶セルロースなどが挙げられる。 滑沢剤の例として は、 タルク、 シリカ、 ステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。 崩壊剤の例 としては、 デンプン、 デンプングリコール酸ナトリゥムなどが挙げられる。 湿潤 剤の例としては、 ラウリル硫酸ナトリ ウムなどが挙げられる。 乳化剤の例として. は、.セル口一ス誘導体、 ソルビトールなどが挙げられも。 また、 保存剤の例とし ては、メチル -P-ヒ ドロキシベンゾエート、ソルビン酸などが挙げられる。ただし、 本発明に使用できる添加剤は、 これら添加剤の例に限定されなレ、。
本発明に係る医薬品は、 例えば経口投与又は非経口投与 （静脈内、 動脈内、 腹 腔内、 経直腸内、 皮下、 筋肉内、 舌下、 経鼻腔内、 経膣内など） 用に製剤化され 得る。 製剤の形態としては、 特に限定されないが、 例えば溶液剤、 錠剤、 粉末剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 座剤、 噴霧剤、 制御放出剤、 懸濁剤及びドリ ンク剤などが 挙げられる。 '
本発明に係る医薬品に含まれるビヮ葉又はビヮ茶の抽出物又は精製物の用量は、 患者の年齢、 体重、 性別、 状態、 重篤度などの要因によって変化しうる。 患者に 投与されるビヮ葉又はビヮ茶の抽出物又は精製物の 1 日用量は、 例えば患者の体 重 lkgあたり 0. l〜200mg、 好ましくは l〜100mgの範囲であるが、 この範囲に限 定されない。 必要に応じて、 用量を数回、例えば 2〜3回に分けて分割投与しても よい。 また、 本発明に係る医薬品は治療用途の同じ又は異なる他の抗高脂血症用 剤、 高血圧抑制剤、 癌細胞増殖抑制剤、 癌細胞アポトーシス誘導剤、 活性酸素種 産生剤、高血糖降下剤及び/又は抗酸化剤と併用して患者に投与することもできる。 本発明に係る飲食品又は医薬品は、 例えば、 以下のように薬理評価を行うこと ができる。
本発明に係る飲食品又は医薬品の抗高脂血症作用の薬理評価としては、 例えば モデル動物に本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取させ、 飼育中又は飼育後に、 血清脂質分析又は臓器の脂肪組織重量測定を行う方法が挙げられる。 本発明に係 る飲食品又は医薬品を摂取していない動物と比較して、 本発明に係る飲食品又は 医薬品を摂取した動物において、 血中の総コレステロール、 HDL コレステロール 及び/又はトリグリセリ ド量が有意に低下した場合には、本発明に係る飲食品又は 医薬品が良好に抗高脂血症作用を有すると判断することができる。 また同様に、 臓器の脂肪組織重量が有意に低下した場合には、 本発明に係る飲食品又は医薬品 が良好に抗高脂血症作用を有すると判断することができる。
また、 本発明に係る飲食品又は医薬品の高血圧抑制作用の薬理評価としては、 例えば、 SHR ラット（高血圧自然発症ラッ ト）の雄を用いる方法が挙げられる。 す なわち、本発明に係る飲食品又は医薬品を当該 SHRラットに給餌し、飼育終了後、 各ラットの血圧を、 無加温型カフ式血圧測定器 （室町機械 （株）） などの血圧測定 装置で測定し、 本発明に係る飲食品又は医薬品を給餌していないラットと比較し て、 血圧が下がった場合には、 本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に高血圧抑 制作用を有すると判断できる。
さらに、 本発明に係る飲食品又は医薬品の癌細胞'増殖抑制作用、 癌細胞アポト 一シス誘導作用及び活性酸素種産生作用の薬理評価としては、 例えば、 ヒ ト急性
'前骨髄性白血病疾患細胞（HL- 60 細胞）を用いる方法が挙げられる。 すなわち、 本 発明に係る飲食品又は医薬品存在下で HL- 60細胞を培養し、対照群（本発明に係る 飲食品又は医薬品不在下）と比較して、その増殖が抑制された場合には、本発明に 係る飲食品又は医薬品が良好に癌細胞増殖抑制作用を有すると判断できる。また、 本発明に係る飲食品又は医薬品存在下で HL- 60細胞を培養し、対照群（本発明に係 る飲食品又は医薬品不在下）と比較して、その 50%生存率が抑制された場合には、 本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に癌細胞アポトーシス誘導作用を有すると 判断できる。 さらに、 本発明に係る飲食品又は医薬品存在下で HL-60細胞を培養 し、 対照群（本発明に係る飲食品又は医薬品不在下）と比較して、 細胞内の活性酸 素が上昇した場合には、 本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に癌細胞に対する 活性酸素種産生作用を有すると判断できる。
また、 本発明に係る飲食品又は医薬品の高血糖降下作用の薬理評価としては、 例えば、 モデル動物（例えば、 II型糖尿病モデルマウスである KKAyマウスなど） に本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取させ、 飼育中又は飼育後に、 血糖値を測 定する方法が挙げられる。 本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取していない動物 と比較して、 本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取した動物において、 血糖値が 有意に低下した場合には、 本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に高血糖降下作 用を有すると判断することができる。 同様に、 モデル動物を用いたブドウ糖負荷 試験において、 本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取した動物において、 血糖値 又は HbAlC値が有意に低下した場合には、 本発明に係る飲食品又は医薬品が良好 に高血糖降下作用を有すると判断することができる。
さらに、 本発明に係る飲食品又は医薬品の抗酸化作用の薬理評価としては、 例 えば、 Harwat, K. S. M. et al . , Free Radi cal Res.， 36 ： 177-187, 2002に記載の 方法が挙げられる。 すなわち、 本発明に係る飲食品又は医薬品に DPPH (1 , l-d iphenyl-2-pi crylhydrazyl ) を加えて反応させ、 吸光度を測定し、 そ の吸光度の値から Troloxの吸光度標準曲線を用いて TrQlox濃度を換算する。 そ の換算値より、'Troloxのラジカル消去能標準曲線からラジカル消去率を算出する。 本発明に係る飲食品又は医薬品のラジカル消去率が、 例えば陽性対照であるビタ ミン C又は Eと同程度かそれ以上である場合に、 本発明に係る飲食品又は医薬品 が良好に抗酸化作用を有すると判断することができる。
焙煎ビヮ葉ゃ非焙煎ビヮ葉には、 抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増 殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘導作用、 活性酸素種産生作用、 高血糖降下作 用又は抗酸化作用は全く認められない。 一方、 本発明においては、 ビヮ葉又はビ ヮ茶の抽出物又は精製物を用いることで、 抗髙脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌 細胞増殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘導作用、 活性酸素種産生作用、 高血糖 降下作用及び/又は抗酸化作用を有する飲食品又は医薬品を製造できる。これ ¾飲 食品又は医薬品は糖尿病、 高脂血症、 高血圧症、 癌等の疾患の予防又は治療に有 用である。 . - 本明細書は本願の優先権め基礎である日本国特許出願 2005- 187133号の明細書 及び/又は図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1において飼育期間中のコントロール群及びビヮ茶群のラット の体重推移を調べた結果を示す。
図 2は、 実施例 1においてコントロール群及びビヮ茶群のラットの血中の総コ レステロール量を調べた結果を示す。
図 3は、 実施例 1においてコントロール群及びビヮ茶群のラットの血中の HDL コレステロール量を調べた結果を示す。
図 4は、 実施例 1においてコントロール群及びビヮ茶群のラットの血中のトリ グリセリ ド量を調べた結果を示す。
図 5は、 実施例 1において飼育終了後、 コントロール群及びビヮ茶群のラット の肝臓、 副睾丸周辺及び腎臓周辺の脂肪組織の重量を測定した結果を示す。
図 6は、 実施例 1において飼育期間中のコントロール群及びビヮ茶群のマウス の体重推移を調べた結果を示す。 ·
図 7は、 実施例 1において飼育終了後、 コントロール群及びビヮ茶群のマウス の腎臓周辺及び副睾丸周辺の脂肪組織の重量を測定した結果を示す。
図 8は、 実施例 2において飼育期間中のコントロール群及びビヮ茶群のマウス の血糖値の推移を示す。
図 9は、 実施例 2における飼育後のコント口ール群及ぴビヮ茶群のマウスの耐 糖能試験の結果を示す。
図 1 0は、 実施例 2における耐糖能試験後のコントロール群及びビヮ茶群のマ ウスの血中 HbAlC値の測定結果を示す。
図 1 1は、 実施例 3における乾燥粗製分画物の薄層クロマトグラフを示す。 図 1 2は、 実施例 3における飼育期間中のコントロール群及び各ビヮ.茶群のマ ウスの血糖値の推移を示す。 . ， 図 1 3は、 実施例 3において飼育後のコントロール群及び分画 3と 4を給餌し たビヮ茶群のマウスの耐糖能試験の結果を示す。 · - 図 1 4は、 実施例 3において耐糖能試験後のコントロール群及ぴ各ビヮ茶群の マウスの血中 HbAlC値の測定結果を示す。
図 1 5は、 実施例 4における粗製分画物の薄層クロマトグラフを示す。
図 1 6は、 実施例 4において粗製分画物の抗酸化作用を調べた結果を示す。 図 1 7は、 実施例 5において、 実施例 3で調製した粗製分画物の抗酸化作用を 調べた結果を示す。
図 1 8は、 実施例 5において、 実施例 3の分画 3から更に得られた粗製分画物 の抗酸化作用を調べた結果を示す。
図 1 9は、 実施例 6においてねじめびわ茶抽出物の高血圧抑制作用を調べた結 果を示す。
図 2 0は、 実施例 8におけるァガロースゲル電気泳動写真であり、 実施例 3の 粗製分画物のアポトーシス誘導の作用を調べた結果を示す。
図 2 1は、 実施例 8におけるァガロースゲル電気泳動写真であり、 実施例 3の. 分画 3から更に得られた粗製分画物のアポトーシス誘導の作用を調べた結果を示 す。
図 2 2は、 実施例 9において、 実施例 3の粗製分画物の癌細胞に対する活性酸 素種産生の作用を調べた結果を示す。
図 2 3は、 実施例 9において、 実施例 3の分画 3から更に得られた粗製分画物 の癌細胞に対する活性酸素種産生の作用を調べた結桌を示す。 発明を実施するための最良の形態 '
〔実施例〕
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明の技術的範囲はこれ らの実施例に限定されないものとする。
なお、 下記の実施例における抗酸化作用の実験は、 以下の文献に記載の方法を 用いて行った （Harwat, K. S. M. et al . , Free Radical Res. , 36 : 177—187， 200 2)。 .
また、 下記の実施例で使用するねじめびわ茶は、 鹿児島県農業生産法人有限会 社十津川農場から市販されているものである。 . - さらに、 各実施例に伴う図中の結果は、 各群の平均値又は平均値土標準偏差で 示す。
〔実施例 1〕 ねじめびわ茶抽出物のダイエット効果
(1) ねじめびわ茶の抽出物の調製
r— 販のねじめびわ茶（50g)を熱湯（400ml)で抽出した。 これを 3回繰り返した。 得られた熱湯抽出液を凍結乾燥（Tokyo Rikakikai Co. , LTD, Freeze Dryer FR - 1)に供し、 乾燥粉末を得た。
用いたねじめびわ茶の総乾燥重量は 346. 2gであり、熱湯抽出液の総乾燥粉末量 は 57. 37gであつた。従って、ねじめびわ茶に対する熱湯抽出液の乾燥粉末含量は、 16. 57%であった。
(2) 動物の準備
Wistar系ラッ ト （日本 SLC社製） 及び KKAyマウス （日本クレア社製） を用い た。 飼養試験には、 下記の表 1に示す割合となるように各材料を計量したものを 混合し、 これを蒸留水にて混練した後、 凍結乾燥機にて乾燥させたものをコント 口一ル用餌 （当該餌を給餌したラット又はマウスを本実施例では 「コント口ール 群」 という） として用いた。また、上記（1')で得られた熱湯抽出液の乾燥粉末を 1% となるようにコントロール用餌に加え、 これをねじめびわ茶群用餌 （当該餌を給 餌したラット又はマウスを本実施例では 「ビヮ茶群」 とレヽう） として用いた。 表 1
Figure imgf000014_0001
(3) ラットの血清脂質の分析及び臓器重量の測定
Wistar系ラッ ト （日本 SLC社製） を 12匹用いて実験した ントロール群（6匹）とビヮ茶群（6匹）とに分け、コントロール群のラットにはコン トロール用餌を自由摂取させた。 また、 ビヮ茶群のラットにはねじめびわ茶群用 餌を自由摂取させた。 双方の群を、 それぞれ 1ヶ月間飼育した。
飼育期間中、 3 日おきにラットの体重測定を行った。 また、 ラットの給水には 両群とも水道水を用い、 飼育期間中は自由給水とした。
飼育終了後、 各動物をネンブタールで麻酔し、 心臓より採血を行い血清脂質の 分析を行った。 また、 各群のラットの臓器を摘出し、 その重量を測定した。
ラットの体重測定の結果を図 1に示す。 図 1は、 飼育期間中の両群のラットの. 体重推移を調べた結果である。 図 1中、 黒塗りの丸がコントロール群のラットの 結果であり、 白抜きの丸がビヮ茶群のラットの結果である。
図 1に示すように、 飼育期間中、 両群のラットの体重は増加したが、 3 週目よ り両群間で徐々に体重差が現れ、 ビヮ茶群のラットの体重はコントロール群のラ ットの体重に比べて、 その増加が抑制されることが分かる。
飼育終了後の血清脂質の分析結果を図 2〜図 4に示す。 図 2は、 血中の総コレ ステロール量（mg/dl)を調べた結果である。図 3は、血中の HDLコレステロール量 • (rag/dl)を調べた結果である。 また、 図 4は、 血中のトリグセリ ド量（mg/dl)を調 ベた結果である。 なお、 図 2〜4において、 「コントロール」 はコントロール群の ラットの結果であり、 「ビヮ茶」 はビヮ茶群のラットの結果である。
図 2及び 3に示すように、 総コレステロールと HDLコレステロールの値は、 コ ントロール群のラットと比較してビヮ茶群のラッ トはやや低い値になることが分 かる。 トリグリセリ ドについて、 図 4に示すように、 コントロール群のラットに 比べ、 ビヮ茶群のラットは低い水準（図 4中、 *は Pく 0. 01であることを示す）で推 移することが分かる。 ' さらに飼育後の臓器重量を調べた結果を図 5に示す。 図 5は、 飼育終了後、 ラ ットの肝臓、 副睾丸周辺及び腎臓周辺の脂肪組織の重量を測定した結果である。 図 5において、 「コントロール」 はコントロール群のラットの結果であり、 「ビヮ 茶」 はビヮ茶群のラットの結果である。
図 5に示すように、 肝臓、 副睾丸周辺および腎臓周辺の脂肪組織の重量を比較 した結果、 コントロール群のラットの重量に比べ、 ビヮ茶群のラットの重量のほ うがより低くなることが分かる。 特に、 腎臓周辺の脂肪組織の重量については、 ビヮ茶群のラットの重量は有意に低い （図 5中、 *は P、0. 05であることを示す） ことが分かる。
(4) マウスの体重及び臓器重量の測定：
KKAyマウス （日本クレア社製） を 20匹用いて実験した。 これらマウスをコン トロール群（10匹）とビヮ茶群（10匹）とに分け、コントロール群のマウスにはコン トロール用餌を自由摂取させた。 また、 ビヮ茶群のマウスにはねじめびわ茶群用 餌を自由摂取させた。 双方の群を、 それぞれ 7週間飼育した。
飼育期間中、 3 日おきにマウスの体重測定を行った。'また、 マウスの給水には 両群とも水道水を用い、 飼育期間中は自由給水とした。
飼育終了後、 各動物をネンブタールで麻酔し、 各群のマウスの臓器を摘出し、 その重量を測定した。
マウスの体重測定の結果を図 6に示す。 図 6は、 飼育期間中の両群のマウスの 体重推移を調べた結果である。 図 6中、 黒塗りの丸 コントロール群のマウスの 結果であり、白抜きの丸がビヮ茶群のマウスの結果である。なお、図 6において、 · *は Pく 0. 05を示し、 * *は Pく 0. 01を示す。 '
図 6に示すように、 飼育期間中、 両群のマウスの体重は増加したが、 ビヮ茶群 のマウスの体重はコントロール群のマウスの体重に比べて、 その増加が有意に (Pく 0. 01) 抑制されることが分かる。
飼育後の臓器重量を調べた結果を図 7に示す。 図 7は、 飼育終了後、 マウスの 腎臓周辺及び副睾丸周辺の脂肪組織の重量を測定した結果である。図 7において、 「コントロール」 はコントロール群のマウスの結果であり、 「ビヮ茶」 はビヮ茶群 のマウスの結果である。
図 Ίに示すように、腎臓周辺及ぴ副睾丸周辺の脂肪組織の重量を比較した結果、 - コントロール群のマウスの重量に比べ、 ビヮ茶群のマウスの重量のほうがより低 くなることが分かる。 特に、 腎臓周辺の脂肪組織の重量については、 ビヮ茶群の マウスの重量は有意に低い （図 7中、 *は Pく 0. 05であることを示す） ことが分か る。
〔実施例 2〕 ねじめびわ茶抽出物の高血糖値抑制効果 (1) ねじめびわ茶の抽出物の調製
市販のねじめびわ茶（50g)を熱湯（400ml)で抽出した。 これを 3回繰り返した。 得られた熱湯抽出液を凍結乾燥（Tokyo Rikakikai Co. , LTD, Freeze Dryer FR - 1) に供し、 乾燥粉末を得た。
用いたねじめびわ茶の総乾燥重量は 300. 0gであり、熱湯抽出液の総乾燥粉末量 は 51. 73gであった。従って、ねじめびわ茶に対する熱湯抽出液の乾燥粉末含量は、 17. 24%であった。
(2) 動物の準備
高血糖の （I I型糖尿病モデル） マウスとして KKAyマウス （日本クレア社製） を用いた。 飼養試験には上記の表 1に示す割合となるように各材料を計量したも のを混合し、 これを蒸留水にて混練した後、 凍結乾燥機にて乾燥させたものをコ ントロール用餌 （当該餌を給餌したマウスを本実施例では 「コントロール群」 と いう） として用いた。 また、 上記（1)で得られた熱湯抽出液の乾燥粉末を 1%とな るようにコントロール用餌に加え、 これをねじめびわ茶群用餌 （当該餌を給餌し たマウスを本実施例では 「ビヮ茶群」 という） として用いた。
- (3) I I型糖尿病モデルマウスの血糖値の測定
I I型糖尿病モデルマウスとして KKAyマウス （日本クレア社製） を 20匹用い て実験した。マウスをコントロール群（10匹）とビヮ茶群（10匹）とに分け、 コント ロール群のマウスにはコントロール用餌を自由摂取させた。 また、 ビヮ茶群のマ ウスにはねじめびわ茶群用餌を自由摂取させた。 双方の群をそれぞれ 7週間飼育 した。 マウスの給水には両群とも水道水を用い、 飼育期間中は自由給水とした。 飼育期間中、 1 週間おきにマウスの血糖値を測定した。 血糖値の測定には酵素 電極法を用いた。
飼育期間中の血糖値の推移を図 8に示す。 図 8中、 黒塗りの丸がコントロール 群のマウスの結果であり、 白抜きの丸がビヮ茶群のマウスの結果である。
図 8に示すように、 血糖値は両群の動物とも徐々に上昇し、 実験開始 1週目よ り血糖値に差が現れることが分かる。すなわち、コントロール群のマウスに比べ、 ビヮ茶群のマウスは血糖値の上昇が抑えられたことが分かる。 特に、 3、 5、 6週 目の血糖値については、 コントロール群のマウスに比べ、 ビヮ茶群のマウスの血 糖値は有意 （図 8中、 *は Pく 0. 05であることを示す） に低くなることが分かる。 (4) I I型糖尿病モデルマウスのブドウ糖負荷試験
上記（3)での飼育終了後、 各群のマウスを 14時間絶食させ、 これにブドウ糖を 投与した。 ブドウ糖の投与量は、 マウス体重 X l/200 (ml)のブドウ糖 4g/10ml (蒸 留水） であった。 この投与量をステンレス製ゾンデにて各マウスの胃に直接注入 し、 強制的に投与した。 投与後、 経時的に血糖値を測定した。
測定後、 マウスをネンブタールで麻酔し、 心臓より採血を行い、 HbAlC の値を 測定した。
飼育後の耐糖能試験の結果を図 9に示す。 図 9中、 黒塗りの丸がコントロール 群のマウスの結果であり、 白抜きの丸がビヮ茶群のマウスの結果である。 なお、 図 9中、 *は Pく 0. 05であることを示す。
図 9に示すように、 血糖値はブドウ糖投与により、 両群とも速やかな上昇を示 し、 15分後にはおよそ 400mg/dlの高い値となった。 30分後、 コントロール群の マウスの血糖値はさらに上昇を続け、 その後は減少することが分かる。 これに対 して、 ビヮ茶群のマウスの血糖^ Sについては、 30分後の値がコントロール群の値 に比べて低く抑えられ （Pく 0. 05 水準で有意差あり）、 その後はコン'トロール群の 値と同様に血糖値は低下することが分かる。 また、 各測定時間におけるビヮ茶群 のマウスの血糖値は、 コントロール群の血糖値に比べて、 常により低い値をとつ て推移していくことが分かる。
さらに、 耐糖能試験後の血中 HbAlC値の測定結果を図 1 0に示す。 図 1 0にお いて、 「コントロール」 はコントロール群のマウスの結果であり、 「ビヮ茶」 はビ ヮ茶群のマウスの結果である。
図 1 0に示すように、 コントロール群のマウスの血中 HbAlC値に比べ、 ビゥ茶 群のマウスの血中 HbAlC値が有意に（図 1 0中、 * *は Pく 0. 01であることを示す） 低いことが分かる。 '
〔実施例 3〕 ねじめびわ茶の粗製分画物の血糖値上昇の抑制効果
(1) ねじめびわ茶の粗製分画物の調製
市販のねじめびわ茶（50g)を熱湯（400ml)で抽出した。 これを 3回繰り返した。 得られた熱湯抽出液を凍結乾燥（Tokyo Rikakikai Co. ' LTD, Freeze Dryer FR- 1) に供し、 乾燥粉末を得た。 なお、 用いたねじめびわ茶の総乾燥重量は 950. 0gであ つた。
得られた熱湯抽出液を、 冷後、 順次、 MCI gel CHP-20P のオープンカラムクロ マトに付した なお、 ゲルの量は乾燥重量として、 1kg 前後量を使用することが 好ましい。 また、 使用したガラスカラムのサイズは内径 8cmであった。 本実施例 では、 ガラスカラムを使用したが、 カラムの材質はガラス、 アクリル材質などに 限定されなくても良い。 溶媒を、 水（2L)、 30%エタノール水溶液（2L)、 70%エタ ノール水溶液（2L)及び水ーァセトン（1： 1の比率） (2L)をそれぞれ用いて溶出させ、 4つの分画を得た。 4つの乾燥粗製分画物の収量は、水（2L)で溶出した乾燥粗製分 画物（以下、 「分画 1」 という'）が 98. 0g、 30%エタノール水溶液（2L)で溶出した乾 燥粗製分画物 （以下、 「分画 2」 という） が 45. 3g、 70%エタノール水溶液（2L)で 溶出した乾燥粗製分画物 （以下、 「分画 3」 という） が 18. 3g、 水一アセトン（1 : 1 の比率）（2L)で溶出した乾燥粗製分画物 （以下、 「分画 4」 という） が 2. lgであつ た。
これら分画 1〜4の薄層クロマ卜グラフ (Thin Layer Chromatography, 以下 「T LC」 という） を図 1 1に示す。 図 1 1中、 1〜4 の番号はそれぞれ分画 ί〜4の結 果を示す。 なお、 TLCに用いた展開溶媒は、 ベンゼン—ギ酸ェチルーギ酸の 3種 の溶媒を用い、 その比率を 3 : 6 : 1の溶液用量で混合したものを用いた。 発色試 薬は、 塩化第二鉄 （FeCl3) を 5%程度メタノールに溶解したものを用い、 TLCへ 直接噴霧することにより、 化合物を発色検出した。
図 1 1に示すように、 分画 1及び 2には、 クロロゲン酸様の物質が、 Rf 値約 0. 1付近にあることが分かる。 また、 分画 3及び 4には、 有機酸及びクロロゲン酸 様の物質があまり含まれていないことが分かる。
(2) 動物の準備 - 高血糖の （ I I型糖尿病モデル） マウスとして KKAyマウス (日本クレア社製） を用いた。 飼養試験には、 上記の表 1に示す割合となるように各材料を計量した ものを混合し、 これを蒸留水にて混練した後、 凍結乾燥機にて乾燥させたものを コントロール用餌 （当該餌を給餌したマウスを本実施例では 「コントロール群」 とレヽう） として用いた。 また、 上記（1)で得られた分画 1、 分画 2又は分画 3 と 4 をコントロール用餌に対して 1 %となるようにそれぞれ加え、 ねじめびわ茶群用 餌 （当該餌をそれぞれ給餌したマウスを本実施例では合わせて 「ビヮ茶群」 とい う） として用いた。
(3) I I型糖尿病モデルマウスの血糖値の測定
I I型糖尿病モデル KKAyマウス （日本クレア社製） を 32匹用いて実験した。 マウスをコントロール群（8匹）、 分画 1を含有するねじめびわ茶群用餌を与える ビヮ茶群（8匹）、分画 2を含有するねじめびわ茶群用餌を与えるビヮ茶群（8匹）、 分画 3と 4を混合して含有するねじめびわ茶群用餌を与えるビヮ茶群（8匹）、の 4 群に分け、 コントロール群のマウスには 1 日 1回、 1, 5gのコントロール用餌を給 餌し、 不足分はマウス用 ΐ販餌を飽食状態となるよう与えた。 また、 各ビヮ茶群 のマウスには 1 日 1回、 1. 5gのコントロール用餌に 15mgの各分画を含むねじめ びわ茶群用餌を給餌し、 不足分はマウス用巿販餌を飽食状態となるよう与えた。 各群をそれぞれ 7週間飼育した。 マウスの給水には各群とも水道水を用い、 飼育 期間中は自由給水とした。
飼育期間中、 1 週間おきにマウスの血糖値を測定した。 血糖値の測定には酵素 電極法を用いた。
飼育期間中の血糖値の推移を図 1 2に示す。 図 1 2中、 黒塗りの丸がコント口 ール群のマウスの結果であり、 白抜きの四角が、 分画 1を含有するねじめびわ茶 群用餌を給餌したビヮ茶群のマウスの結果である。 また、 白抜きの三角が、 分画 2 を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビヮ茶群のマウスの結果であり、 白 抜きの丸が、 分画 3と 4を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビヮ茶群のマ ウスの結果である。
図 1 2に示すように、 飼育期間中、 血糖値はコントロール群及び各ビヮ茶群の マウスの血糖値は上昇した。 しかし、 分画 3と 4を給餌し ·たビヮ茶群の血糖値は 実験開始 3週目より上昇が頭打ちとなり、 コントロール群の血糖値に比べて低い 値で推移することが分かる。
(4) I I型糖尿病モデルマウスのブドウ糖負荷試験
上記（3)での飼育終了後、 各 4群のマウスを 14時間絶食させ、 これにブドウ糖 を投与した。ブドゥ糖の投与量は、マウス体重 X 1/200 (ml)のブドゥ糖 4g/10ml (蒸 留水） であった。 この投与量をステンレス製ゾンデにて各マウスの胃に直接注入 し、 強制的に投与した。 投与後、 経時的に血糖値を測定した。
測定後、 マウスをネンブタールで麻酔し、 心臓より採血を行い、 HbAlC の値を 測定した。
分画 3と 4を給餌したビヮ茶群について、 飼育終了後に耐糖能試験を行った結 果を図 1 3に示す。 図 1 3中、 黒塗りの丸がコントロール群のマウスの結果であ り、 白抜きの丸が、 分画 3と 4を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビヮ茶 群のマウスの結果である。
図 1 3に示すように、 分画 3と 4を給餌したビヮ茶群の血糖値はブドウ糖投与 により、 コントロール群と同様に投与直後から速やかな上昇が認められ、 15分後 にはおよそ 500mg/dl と上昇した。 30分後には、 コントロール群はさらに上昇を 続け、 その後、 減少することが分かる。 これに対し、 分 ® 3と 4を給餌したビヮ 茶群では、 30分後既に血糖値の低下が始まり、 その後、 速やかに下降することが 分かる。 特に、 30、 60分後では有意に （図 1 3中、 ' *は Pく 0. 05であることを示 す） 低いことが分かる。
さらに、 耐糖能試験後の血中 HbAlC値の測定結果を図 1 4に示す。 図' 1 4にお いて、 「コントロール」 はコントロール群のマウスの結果であり、 「ビヮ茶 1」 は、 分画 1を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビヮ茶群のマウスの結果である。 また、 「ビヮ茶 2」 、 分画 2を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビヮ茶群 のマウスの結果であり、 「ビヮ茶（3+4)」 力 分画 3と 4を含有するねじめびわ茶 群用餌を給餌したビヮ茶群のマウスの結果である。
図 1 4に示すように、 コントロール群のマウスの血中 HbAlC値に比べ、 分画.3 と 4を給餌したビヮ茶群のマウスの血中 HbAlC値が有意に （図 1 4中、 *は Pく 0.
05であることを示ず） 低いことが分かる。 . .
〔実施例 4〕 ねじめびわ茶の粗製分画物の抗酸化作用の効果
(1) ねじめびわ茶の粗製分画物の調製
市販のねじめびわ茶（1247g)を 80%水性ァセトン（5000ml)で抽出した。これを 3 回繰り返した。 得られた 80%水性アセトン抽出液は、減圧下で溶媒を留去するこ とで、 シロップ状のエキス（448. 2g)を得た。 得られたエキスの一部（278g)を分取 し、 MCI gel CHP-20P のカラムクロマトに付した。 なお、 ゲルの量は乾燥重量と して、 1kg 前後量を使用することが好ましい。 また、 使用したガラスカラムのサ ィズは内径 8cmであった。 本実施例では、 ガラスカラムを使用したが、 カラムの 材質はガラス、 アクリル材質などに限定されなくても良い。 移動相に A液として 水、 B液としてメタノールを用い、 A液から B液へのリ二ァーグラジェントによつ てクロマトグラフィーを行った。 より詳しくは、 A液と B液とを 1： 0の比率（300 ml)及び 95： 5の比率（300ml)で溶出した分画溶液をまとめたものを粗製分画 1 と した。 A液と B液とを 9： 1の比率（300ml)、 8： 2の比率（300ml)及び 7： 3の比率（3 00ml)で溶出した分画溶液をまとめたものを粗製分画 2とした。 A液と B液とを 6 : 4の比率（300ml)で溶出した分画溶液を粗製分画 3 とした。 A液と B液とを 5： 5 の比率（300ml)で溶出した分画溶液を粗製分画 4とした。 A液と B液とを 4： 6の 比率（300ml)で溶出した分画溶液を粗製分画 5 とした。 A液と B液とを 3： 7の比 率（300ml)で溶出した分画溶液を粗製分画 6とした。 A液と B液とを 2 : 8の比率（3 00ml)で溶出した分画溶液を粗製分画 7とした。 A液と B液とを 1： 9の比率（300m 1)で溶出した分画溶液を粗製分画 8 とした。 A液と B液とを 0： 1の比率（300ml) で溶出した分画溶液を粗製分画 9 とした。 最後に C液としてアセトンを用い、 A 液と C液との比率を 50： 50 (1L)にしてクロマトグラフィーを行った。 なお、 この A液と C液との比率を 50： 50 (1L)にしてク口マトグラフィーを行い、 得ることが できる分画溶液は、上記の粗製分画 9と混合した。 この結果、粗製分画 1〜9と称 する 9つの粗製分画物を得た。 9つの粗製分画物の収量は、 粗製分画 1が 12. 3g、 粗製分画 2が 12. 8g、 粗製分画 3が 0. 4g、 粗製分画 4が 2. 9g、 粗製分画 5が 8. 3 g、粗製分画 6が 6. 7g、粗製分画 7が 19. 9g、粗製分画 8が 5. 0g、粗製分画 9が 4· 9g、 であった。
これら 9つの粗製分画物のうち粗製分画 2〜8の TLCを図：！ 5に示す。図 1 5中、 2〜8の番号はそれぞれ粗製分画 2〜8の結果を示す。 なお、 TLCに用いた展開溶媒 は、 ベンゼンーギ酸ェチルーギ酸の 3種の溶媒を用い、 その比率を 3 : 6 : 1の溶 液用量で混合したものを用いた。 発色試薬は、 塩化第二鉄 （FeCl3) を 5%程度メ タノールに溶解したものを用い、 TLC へ直接噴霧することにより、 化合物を発色 検出した。 図 1 5に示すように、 緑色から青色に発色するものはフエノール性の物質であ ることが分かる。
(2) 抗酸化作用の実験
抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Harwat, K. S. M. et al. , Free Radical Res. , 36： 177-187, 2002)。
サンプルは、 上記（1)で得られた 9つの粗製分画物をそれぞれ 10 g/mlの濃度 で調整したもの、 コントロールとしてビヮ茶の熱湯抽出物の乾燥粉末を 10 g/ml の濃度で調整したもの、 標準品として、 ビタミン C (ァスコルビン酸） を 5 g/m 1の濃度で調整したもの、ビタミン Eを S/z g/mlの濃度で調整したものを用いた。 これらのサンプルを平底のプレート（96well)にカ卩え、 さらに DPPH(1, 1- dipheny l-2-picrylhydrazyl, マイクロモーラ一の濃度で調整したもの） を 190 μ ΐ加え、 10秒間混合した後、 遮光して 30分間放置した。 この反応後、 各ゥエルの反応溶 液を、 490nm の波長の吸光度を用いてマイクロプレートリーダーで測定し、 その 吸光度の値から Troloxの吸光度標準曲線を用いて Trolox濃度を換算した。 その 換算値より、 Troloxのラジカル消去能標準曲線からラジカル消去率を算出した。 抗酸化作用の実験結果を図 1 6に示す。図 1 6中、 1〜9のサンプルナンバーは、 それぞれの粗製分画 1〜9に対応する。 また、 サンプルナンバー 10はビヮ茶の熱 湯抽出物の乾燥粉末である。 VCはビタミン Cであり、 VEはビタミン Eを示す。 図 1 6に示すように、粗製分画 6、 8及び 9に強い抗酸化作用があることが分か る。 その程度は、 ビタミン Eと同程度かそれ以上であり、 ビタミン Cの 2分の 1 程度である。 また、 粗製分画 6、 8及び 9の抗酸化作用は、 ビヮ茶の熱湯抽出物の 乾燥粉末に比べ 3倍程度強くなることが分かる。
〔実施例 5〕 ねじめびわ茶の粗製分画物の抗酸化作用の効果 2
(1) 実施例 3で調製した分画 1〜4の抗酸化作用の実験 . - 抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Harwa t， K. S. M. et al. , Free Radical Res.， 36： 177—187， 2002)。
サンプルは、 実施例 3で得られた 4つの粗製分画物；分画 1〜4をそれぞれ 10 β g/mlの濃度で調整したもの、 コントロールとして実施例 1で得られたねじめび わ茶熱湯抽出液の乾燥粉末を 10 / g/mlの濃度で調整したものを用いた。 これ ら のサ ン プルを平底のプ レ一 ト （96wel l) に力 [1 え、 さ ら に DPPH (1, l_diphenyl- 2- picrylhydrazyl、マイク口モーラーの濃度で調整したもの） を 190 μ 1加え、 10秒間混合した後、 遮光して 30分間放置した。 この反応後、 各 ゥエルの反応溶液を、 490nm の波長の吸光度を用いてマイクロプレートリーダー で測定し、 その吸光度の値から Troloxの吸光度標準曲線を用いて Trolox濃度を 換算した。 その換算値より、 Troloxのラジカル消去能標準曲線からラジカル消去 率を算出した。
抗酸化作用の実験結果を図 1 7に示す。図 1 7中、縦軸は DPPHラジカル消去率. を％として表示し、 横軸の分画 1〜分画 4のサンプルは、 実施例 3で調製したそ れぞれの分画 1〜4に対応する。また、 ビヮ茶は実施例 1で得られたねじめびわ茶 熱湯抽出液の乾燥粉末である。
図 1 7に示すように、 分画 2、 分画 3及び分画 4に強い抗酸化作用があること が分かる。 その程度は、 実施例 1で得られたねじめびわ茶熱湯抽出液の効果より 大きいことがわかる。 また、 分画 3の抗酸化作用は、 実施例 1で得られたねじめ びわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末に比べ 1. 6倍程度強いことが分かる。
• (2) ねじめびわ茶の粗製分画物の調製
実施例 3によって得られた分画 3の乾燥粉末 5. 0gを秤量し、これを適量の水に 溶解した後、 オープンカラムクロマトグラフィーに付した。 オープンカラムクロ マトグラフィ一の条件は、 固定相にクロマ トレックス ODS (Chromatorex 0DS、 富 士シリシァ化学株式会社、 Fuj i Si lysia Chemical LTD. ) を用い、 移動層に A液 として蒸留水 （H20)、 B液としてメタノール（MeOH)を用い、 A液から B液の含量を 増やすことによって各種クロマトグラフィーを行った。具体的には、溶媒を、 80%
H20-20%MeOH (400ml)、 70%H20-30%MeOH (400ml)、 60%H20-40%MeOH (400ml)、
50%H20-50%Me0H (400ml)、 40%¾0-60%MeOH (400ml)、 30%H20-70%Me0H (400 ml)、 20%H20-80%Me0H (400ml)、 10%H20-90%MeOH (400ml)、 100% MeOH (400ml) で溶出させ、 各 400ml溶出画分を分取し、 3-1から 3 - 9までの計 9個の分画を得 た。 各分画の収量と収率は次のとおりであった。 分画 3 - 1 (0. 19g、 3. 9%)、 分画
3—2 (0. 28g、 5. 7%)、 分画 3- 3 (0. 57g、 11. 6%)、 分画 3- 4 (0· 85g、 17. 3%)、 分 画 3-5 (0. 64g、 13. 1%)、 分画 3- 6 (0. 79g、 16. 1%)、 分画 3 - 7 (0. 54g、 1 1. 0%)、 分画 3- 8 (0, 78g、 15. 9%)、 分画 3- 9 (0. 17g、 3. 5%)。
(3) 実施例 3の分画 3から更に得られた分画 3 - 1〜3 - 9の抗酸化作用の実験 抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Harwat, K. S. M. et al . , Free Radi cal Res. , 36： 177-187， 2002)。
サンプルは、 上記（2)で得た 9つの粗製分画物：分画 3- 1〜3- 9をそれぞれ 10 μ g/mlの濃度で調整したものと、 コントロールとして実施例 3で得られた分画 3の 乾燥粉末を 10 μ g/mlの濃度で調整したものを用いた。
これらのサンプルを平底のプレート（96wel l)に加え、 さらに DPPH (1, 1- dipheny l-2-pi crylhydrazyl , マイクロモーラーの濃度で調整じたもの） を 190 μ ΐ加え、 10秒間混合した後、 遮光して 30分間放置した。 この反応後、 各ゥエルの反応溶 液を、 490nm の波長の吸光度を用いてマイクロプレートリーダーで測定し、 その 吸光度の値から Trol oxの吸光度標準曲線を用いて Trolox濃度を換算した。 その 換算値より、 Troloxのラジカル消去能標準曲線か.らラジカル消去率を算出した。 抗酸化作用の実験結果を図 1 8に示す。図 1 8中、縦軸には DPPHラジカル消去 率を％の値として表示し、横軸の 3-1〜3- 9のサンプルは、調製したそれぞれの分 •画 3- 1〜3 - 9に対応する。 また、 分画 3は実施例 3で調製した分画 3である。
図 1 8に示すように、分画 3-1、 3-2及び 3 - 4に強い抗酸化作用があることが分 かる。 その程度は、 実施例 3で調製した分画 3の効果より大きいことがわかる。 特に、分画 3-1の抗酸化作用は、分画 3の乾燥粉末に比べ 1. 37倍程度強いことが 分かる。
〔実施例 6〕 ねじめびわ茶抽出物の高血圧抑制の効果
(1) 動物の準備
SHRラット （高血圧自然発症ラット） の雄 （5週齢） を I2匹 （日本 SLC社製） 用いた。 飼養試験には、 下記の表 2に示す割合となるように各材料を計量したも- のを混合し、 これを蒸留水にて混練した後、 凍結乾燥機にて乾燥させたものをコ ントロール用餌 （当該餌を給餌したラットを本実施例では 「コントロール群」 と いう） として用いた。 また、 実施例 1で得られた熱湯抽出液の乾燥粉末を 0. 2% となるようにコントロール用餌に加え、 これをねじめびわ茶群用餌 （当該餌を給 餌したラットを本実施例では 「ビヮ茶群」 という） として用いた。 表 2
Figure imgf000026_0001
(2) ラットの血圧の測定
SHRラット （高血圧自然発症ラット） 雄 （5週齢） （日本 SLC社製） を I2匹用い て、血圧を測定した。 これらラットをコントロール群（6匹）とビヮ茶群（6匹）とに 分け、 コントロール群のラットにはコントロール用餌を自由摂取させた。 また、 ビヮ茶群のラットにはねじめびわ茶群用餌を自由摂取させた。 双方の群を、 それ ぞれ 50日間飼育した。
飼育期間中、飼料、飲水は自由摂食、 自由飲水とした。また飼育室は 23°Cとし、 . 12時間照明 （7： 00〜19： 00)' とした。
飼育終了後、 各動物の血圧を測定するために、 血圧測定装置として無加温型力 フ式血圧測定器 （室町機械 （株)） を用いた。
ラットの血圧測定の結果を図 1 9に示す。 図 1 9は、 飼育期間中の両群のラッ トの血圧推移を調べた結果である。 図 1 9中、 抜きの丸がコントロール群のラ ットの結果であり、黒塗りの丸がビヮ茶群のラットの結果である。 また、血圧（最 大血圧） は一定時刻 （午前中 10時頃） より測定した。 測定は各個体について平均 10回繰り返し、 その平均値で表記した。 縦棒は標準誤差を示す。 血圧測定の実験 的な困難さとして、 血圧の値は大変容易に変動し、 ラットの精神状態、 環境条件 で極めて容易に変動することがあるので、実験はラットを出来るだけ落ち着かせ、 静かな環境下で行った。
図 1 9に示すように、 スタート時にはコントロール群とビヮ茶群の最大血圧の 平均値はともに 134 mmHg程度であった。 コントロール群の血圧は飼育期間の経過. に伴って 10日過ぎより上昇し、 20日以降はかなり高めに推移した。それに対し、 ビヮ茶群は 21 日までほとんど上昇せず、 特に 21 日ではコントロール群と有意差 が認められた （P〈0. 05)。 その後は実験日数の進展に伴って上昇していく力 S、 コン トロ一ル群に較べて 10 mmHg以下低い血圧を示し、 ねじめびわ茶抽出物の高血圧 を抑制する効果が認められた。 この結果、 ねじめびわ茶抽出物は血圧の上昇を抑 制することがわかる。
〔実施例 7〕 ねじめびわ茶の粗製分画物の癌細胞増殖抑制作用の効果
' (1) 実施例 3で調製した分画 1〜4の癌細胞増殖抑制効果 '
ヒ ト急性前骨髄性白血病疾患細胞 （HL- 60細胞） の 50%生存率は以下の文献記 載の方法で測定した （Mosmann, T. , J. Immunol. Methods, 65 : 55-63， 1983)。 HL-60細胞は、 10%の牛胎児血清を含む RPMI1640培地を用いて培養した。 実施例 1で得たねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末と、 実施例 3で調製した分画 1〜4 を、 0、 25、 50、 75、 100、 125、 150 ,u g/ml の濃度で含むように、 0. 1%DMS0 (ジ メチルスルフォキシド） 溶液に溶解し、 HL-60細胞を 6時間処理した。
処理後、 細胞を遠心分離法により回収し、 細胞溶解緩衝液により細胞膜を琅り 除き、 RNA分解酵素により RNAを分解し、 さらにタンパク質分解酵素によりタン パク質を除去した。 得られた DNA断片を 2%ァガロースゲル電気泳動法により分 離し、 染色後、 UV トランスイルミネーターにより検出し、 DNAの断片率を算出し た。 48時間後の HL- 60細胞生存率に対する 50%抑制濃度 （IC5。） を算出した。 そ の結果を表 3に示した。 なお、 表 3における抽出物は、 実施例 1で得たねじめび わ茶熱湯抽出液の乾燥粉末の結果である。 表 3
Figure imgf000028_0001
表 3に示すように、 ねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末に対して、 分画 2〜4 は比較的強い HL- 60細胞増殖抑制効果を有した。中でも、分画 4は最も強い HL-60 細胞増殖抑制効果を有することが分かる。
(2) 実施例 5で調製した分画 3- 1〜3- 9の癌細胞増殖抑制効果
上記（1)と同様の方法で、 実施例 5で調製した分画 3- 1〜3 - 9の HL- 60細胞増殖 抑制効果を検討した。
HL - 60細胞の 50%生存率は以下の文献記載の方法で測定した （Mo-smann, T.， J. Immunol. Methods, 65： 55-63， 1983)。 HL-60 細胞は、 10%の牛胎児血清を含む RPMI1640培地を用いて培養した。実施例 1で得たねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥 粉末と、 実施例 5で調製した分画 3-1〜3- 9 を、 0、 25、 50、 75、 100、 125、 150 μ g/ml の濃度で含むように、 0. 1 %DMS0 (ジメチルスルフォキシド) 溶液に溶解 し、 HL - 60細胞を 6時間処理した。
処理後、 細胞を遠心分離法により回収し、 細胞溶解緩衝液により細胞膜を取り 除き、 RNA分解酵素により RNAを分解し、 さらにタンパク質分解酵素によりタン パク質を除去した。 得られた DNA断片を 2%ァガロースゲル電気泳動法により分 離し、 染色後、 UV トランスイルミネーターにより検出し、 DNAの断片率を算出し た。 48時間後の HL- 60細胞生存率に対する 50%抑制濃度 （IC5。） を算出した。 そ の結果を表 4に示した。 なお、 ねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末についての結 果は、 表 3に示す結果である。 表 4
Figure imgf000029_0001
表 4に示すように、分画 3-1、 3-2及び 3-4は比較的強い HL-60細胞増殖抑制効 果を有した。 中でも、 分画 3 - 4は最も強い HL- 60細胞増殖抑制効果を有すること が分かる。
〔実施例 8〕 ねじめびわ茶の粗製分画物の癌細胞アポトーシス誘導作用の効果
(1) 実施例 3で調製した分画 1〜4の癌細胞アポトーシス誘導効果
ヒ ト急性前骨髄性白血病疾患細胞 （HL- 60細胞） の DNA断片化については以下 の文献記載の方法で測定した （Hou， D. X. et al. , Int. J. Oncol. , 23 : 705-712， 2003)。 実施例 3で調製した各分画 2、 分画 3及び分画 4を 250、 500、 750 g/ml の 3つの濃度に調整し、 HL- 60細胞を 6時間処理し、細胞核から DNAを抽出した。 得られた DNAについてァガロースゲル電気泳動を行い、 その結果を図 2 0に示し た。 ' 図 2 0中、 Mは DNAマーカー、 Cは濃度 O /i g/mlのコントロールを示す。 この結 果、 分画 3の 500 i g/ml と 75'C i g/inl の濃度に DNAラダーが観察され、 アポトー シスを誘導することが分かる。
(2) 実施例 5で調製した分画 3- 1〜3- 9の癌細胞アポトーシス誘導効果
上記（1)と同様の方法で、 実施例 5で調製した分画 3-1〜3-9の癌細胞アポトー シス誘導効果を検討した。 HL- 60細胞の DNA断片化については以下の文献記載の方法で測定した（Hou， D. X. et al.， Int. J. Oncol. , 23 : 705-712， 2003)。 実施例 5にて調製した各分画 3-1 〜3- 9を 500 μ §/πι1の濃度に調整し、 HL-60細胞を 6時間処理し、 細胞核から DNA を抽出した。 得られた DNAについてァガロースゲル電気泳動を行い、 その結果を 図 2 1に示した。
図 2 1中、 Μは DNAマーカー、 Cは濃度 0 / g/mlのコントローノレを示す。 この結 果、 分画 3-1、 3-2、 3 - 4及び 3-6に DNAラダーが観察され、 アポトーシスを誘導 することが分かる。 特に、 分画 3-2と 3 - 4には強い DNAラダーが観察され、 アポ ト シスを強く誘導することが分かる。 '
〔実施例 9 ) ねじめびわ茶の粗製分画物の活性酸素種産生作用の効果
(1) 実施例 3で調製した分画 1〜4の活性酸素種産生効果
ヒ ト急性前骨髄性白血病疾患細胞 （HL- 60細胞） を 2. .0 X 106 cel l s I ml で継 代した。 これを' RPMI1640培地で 4倍に希釈し、 2. 0 X 105 cells / 400 1 とした。 必要量は 1 wellあたり 400 μ ΐ細胞液であり、 従って、 1 plateあたり 20 ml の 細胞液を準備した。プレートを軽く振って細胞の偏りを防ぎながら、これを、 37°C、 5%C02気流下で 24時間培養した。 ―
2 時間の培養後、 この培養液に、 実施例 3で調製した分画 1〜4を 500 1 の濃度になるように添加した。 また、 比較のために、 実施例 1で調製したねじめ びわ茶熱湯抽出液を同様に添加した。 これを 37°C、 5%C02のインキュベーターで 15分間培養した。 培養後、 それぞれの wel l に MTT液 （5 mM DCFH- DA： DCFH- DA の 1 mgをエタノール 413 μ 1で溶かしたもの ； DCFA - DA、 ジク口口フルォレシン 2 酢酸） を 1. 6 μ 1ずつ分注し、 引き続き、 37°C、 5%C02気流下のインキュベーター でさらに 30分間培養した。
培養後、 各 well をマイクロプレートリーダー （excitation 波長： 485 nm ，' emission波長： 530 nm)により'測定し、コントロールと比較して、吸光度から HL- 60 細胞内で産生された活性酸素の量を算出した。 その結果を図 2 2に示す。 なお、 コントロールは HL- 60細胞のみで試験を行った場合の結果である。
図 2 2中、 コントロールは対照を示す。 また、 図 2 2において、 抽出物は、 実 施例 1で調製したねじめびわ茶熱湯抽出液である。 この結果、 分画 3は HL - 60細 胞内に対して強い活性酸素産生能を有することが分かる。
(2) 実施例 5で調製した分画 3- 1〜3- 9の活性酸素種産生効果
上記（1)と同様の方法で、 実施例 5で調製した分画 3- 1〜3- 9の活性酸素種産生 効果を検討した。
HL - 60細胞を 2. 0 X 106 cel l s / mlで継代した。 これを RPMI1640培地で 4倍に 希釈し、 2. 0 X 105 cells / 400 μ 1 とした。 必要量は 1 wel lあたり 400 1細胞 液であり、 従って、 1 plateあたり 20 mlの細胞液を準備した。 プレートを軽く 振って細胞の偏りを防ぎながら、これを、 37°C、5%C02気流下で 24時間培養した。
24時間の培養後、この培養液に、実施例 5で調製した分画 3- 1〜3_9を 500 μ g/ml の濃度になるように添加した。 これを 37°C、 5%C02のインキュベーターで 15分 間培養した。 培養後、 それぞれの wel lに MTT液 （5 mM DCFH-DA： DCFH-DAの 1 mg をエタノール 413 μ 1で溶かしたもの ； DCFA- DA、 ジクロロフルォレシン 2酢酸） を 1. 6 / 1ずつ分注し、 引き続き、 37°C、 5%C02気流下のィンキュベータ一でさら に 30分間培養した。
培養後、 各 well をマイクロプレートリーダー （excitation 波長： 4.85 nm ， ■emission波長： 530 nm)により測定し、コントロールと比較して、吸光度から HL- 60 細胞内で産生された活性酸素の量を算出した。 その結果を図 2 3に示す。 なお、 コントロールは HL- 60細胞のみで試験を行った場合の結果である。
図 2 3中、 コンドロールは対照を示す。 この結果、 分画 3- 3-2、 3- 3及び 3- 5がコントロールより強い活性酸素産生能を有することが分かる。 特に、 分画 3- 1は HL - 60細胞内に対してコントロールと比較して約 2. 6倍程度強い活,性酸素産 生能を有することが分かる。 産業上の利用可能性 - 本発明によれば、 抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌 細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び/又は抗酸 化作用を有し、 ビヮ葉又はビヮ茶の抽出物又は精製物を含有する飲食品又は医薬 品が提供される。本発明に係る飲食品（特に、健康補助食品もしくは特定保健用食 品）又は医薬品は、 抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌細 胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び/又は抗酸化 作用を有することから、 抗高脂血症用剤、 高血圧抑制剤、 癌細胞増殖抑制剤、 癌 細胞アポトーシス誘導剤、 活性酸素種産生剤、 高血糖降下剤、 抗酸化剤として使 用できる。
本明細書で引用レた全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . ビヮ茶の抽出物又は精製物を有効成分として含有し、 且つ抗高脂血症作 用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘導作用、 活性 酸素種産生作用、 高血糖降下作用及び抗酸化作用から成る群から選択される 1以 上の作用を有する飲食品又は医薬品。
2 . 上記ビヮ茶がねじめびわ茶であることを特徴とする、 請求項 1記載の飲 食品又は医薬品。
3 . 上記精製物がクロロゲン酸、 クェルセチン 3-サンブビオシド、 メチルク ロロゲン酸、 ケンフェローノレ 3-ラムノシド、 クエノレセチン 3-ラムノシド、 2ひ - ヒ ドロキシゥルソール酸及びウルソール酸から成る群から選択される 1以上の化 合物を含まないことを特徴とする、 請求項 1記載の飲食品又は医薬品。
4 . 上記飲食品が抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌細胞アポトーシス誘導作用、 活性酸素種産生作用、 高血糖降下作用及び抗酸化 作用から成る群から選択される 1以上の作用を有する旨の表示を有するものであ
+ることを特徴とする、 請求項 1記載の飲食品又は医薬品。
5 . ビヮ茶を熱水抽出又は溶媒抽出に供し、 抽出物を得る工程を含むことを 特徴とする、 抗高脂血症作用、 高血圧抑制作用、 癌細胞増殖抑制作用、 癌細胞ァ ポトーシス誘導作用、 活性酸素種産生作用、 高血糖降下作用及び抗酸化作用から 成る群から選択される 1以上の作用を有する飲食品又は医薬品の製造方法。
6 . 上記抽出物を精製手段に供し、 精製物を得る工程をさらに含むことを特 徴とする、 請求項 5記載の製造方法。 ，
7 . 上記精製手段がカラムクロマトグラフィーであることを特徴とする、'請 求項 6記載の製造方法。 . .
8 . 上記ビヮ茶がねじめびわ茶であることを特徴とする、 請求項 5記載の製 造方法。
9 . 上記精製物がクロロゲン酸、 クェルセチン 3-サンブビオシド、 メチルク ロロゲン酸、 ケンフェローノレ 3-ラムノシド、 クエノレセチン 3-ラムノシド、 2ひ - ヒ ドロキシゥルソール酸及びウルソール酸から成る群から選択される 1以上の化 合物を含まないことを特徴とする、 請求項 6記載の製造方法。
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