CN111150754B - 板栗花提取物在制备食品或抗炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及板栗花提取物在制备抗炎药物或食品中的应用，该板栗花提取物至少由以下制备步骤制备得到：将板栗花的水提物通过乙酸乙酯萃取。板栗花提取物可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞产生过量的炎症介质NO及三种炎症细胞因子：TNF‑α、IL‑1β、IL‑6。并且还可有效抑制LPS诱导的细胞过量表达的炎症信号通路中的两个关键酶：一氧化氮诱导合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX‑2)。此外，该板栗花组合物还可有效抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致小鼠足肿胀，进一步证实其抗炎作用，可以为其在制备抗炎制品中的应用提供科学依据。

Description

板栗花提取物在制备食品或抗炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种板栗花提取物在制备抗炎药物或食品中的应用。
背景技术
板栗(Castanea mollissima Blume)，又名栗、栗子和风腊，属于山毛榉科栗属(Castanea Mill)植物，原产于中国，是我国据历史记载栽培最早的果树之一，约有两千多年的栽培历史。栗树为雌雄同株，异花授粉，雌雄花数量比可达1:2349，研究表明，只有少量的雄花即可满足授粉需要，大量的雄花都是多余的，白白消耗了树体营养，疏除90％左右雄性花序，可提高板栗产量。上世纪末起，随着我国板栗加工业有的进一步发展，板栗消费量逐年增大，板栗的种植面积也随之迅猛扩大。而板栗雄花大多被作为废物丢弃，导致了资源的巨大浪费。
栗花性味甘、平，无毒。作为民间用药，在临床上早有应用，并有一定的治疗效果。据《本草纲目》记载，栗花可以通过食用治疗瘰病和赤白痢疾等症状，也可以外用，捣碎取汁外用可治疗漆疮症。《滇南本草》记载栗花能够“治日久赤白痢疾，大肠下血”。将栗花用水煎服，能够治疗小儿呕吐等肠道疾病。现有文献报道板栗花药理活性部位多为醇提物，活性主要包括抗氧化、抗黑色素、抗肿瘤和抗菌四方面。然而提取板栗花采用不同溶剂、不同纯化方法，其化学成分和活性功能都差异明显，因此，板栗花的药用功效还未得到充分开发。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种板栗花提取物在制备抗炎药物中的应用，以提供板栗花新的药用功效。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了板栗花提取物在制备抗炎药物中的应用，该板栗花提取物至少由以下制备步骤制备得到：将板栗花的水提物通过乙酸乙酯萃取。
通过特定的板栗花的水提物的乙酸乙酯萃取成分，其可以有效地充分具备抗炎的药性。
可选地，板栗花的水提物通过以下步骤制备：将板栗花在60～100℃的水中提取，在该温度下能够充分有效地对活性成分进行提取出来。进一步地，为了使得水提效果达到更佳，在选择水提的原料时，将新鲜板栗花干燥粉碎后，再进行提取，可选地，粉碎后过60目筛。
为了达到充分提取的目的，水提时，采用间歇式提取三次，可选地，每次提取时间2～4小时，每次提取的液固质量比为10～20:1。即每次提取的时间可以为2小时、2.5小时、3小时、3.5小时或4小时；水和板栗花的质量比可以为10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1 或20:1。
进一步地，用乙酸乙酯萃取时，按照体积比位1～2：1的乙酸乙酯对水提后的液体进行萃取，萃取后减压浓缩乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至将溶剂蒸干。
为了进一步提高板栗花水提物的活性，其制备步骤还包括将通过乙酸乙酯萃取得到的萃取物依次通过聚酰胺柱和大孔树脂进行纯化。聚酰胺是一类结构中含有重复单元酰胺键(-CO-NH-)的高分子聚合物，酰胺基团上的O、N原子在酸性截止中结合质子而带正电荷，以经典引力形成吸附溶液中的阴离子，进而与酚类、黄酮类、醌类等富含酚羟基的化合物形成氢键而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离。进一步地大孔树脂在聚酰胺吸附后的基础上再进一步纯化除杂，提高了提取物的活性。
具体地，将通过乙酸乙酯萃取得到的萃取物通过聚酰胺柱包括将萃取物用1～3倍体积的水溶解上聚酰胺柱，用水洗脱至无色后，再用乙醇洗脱，可选乙醇溶液的质量分数为30％～60％，乙醇溶液用量为6～10柱体积；
可选地，通过大孔树脂纯化包括将通过聚酰胺柱纯化后的浓缩物水解后上大孔树脂，水洗至无色后用乙醇溶液洗脱，然后干燥，优选乙醇溶液的质量分数为30％～60％，乙醇溶液用量为6～10柱体积。
可选地，板栗花提取物的制备方法具体为：将新鲜板栗花干燥后粉碎，过60目筛，用水作溶剂，提取用水量为原料的10-20倍，提取温度为 60-100℃，提取时间为2-4小时，间歇提取三次，过滤收集滤液，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯萃取液至溶剂完全蒸发，得到浸膏A，A用 1-3倍体积的水溶解上聚酰胺柱，先用水洗脱至无色，再用6-10柱体积的30％-60％的乙醇洗脱，合并滤液减压浓缩得到浸膏B，B再用水溶解上大孔树脂，水洗无色后用30％-60％乙醇洗脱，浓缩除醇后，干燥得板栗花提取物C。
可选地，上述抗炎药物为抗巨噬细胞产生的炎症的药物。
第二方面，本发明实施例提供了板栗花提取物在制备用于抑制巨噬细胞产生促炎细胞因子的抑制剂中的应用，所述促炎细胞因子包括TNF-α、 IL-1β和IL-6中的至少一种，优选地，所述促炎细胞因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6。
第三方面，本发明实施例提供了板栗花提取物在制备用于抑制巨噬细胞生成炎症介质NO的抑制剂中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了板栗花提取物在制备用于抑制一氧化氮诱导合酶的表达的抑制剂中的应用。
第五方面，本发明实施例提供了板栗花提取物在制备用于抑制环氧合酶2的表达的抑制剂中的应用。
第六方面，本发明实施例提供了板栗花提取物在制备治疗炎性耳肿胀的药物中的应用。
第七方面，本发明实施例提供了板栗花提取物在制备治疗炎性足肿胀的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的板栗花提取物可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞产生过量的炎症介质NO及三种炎症细胞因子：TNF-α、IL-1β、IL-6。并且还可有效抑制LPS诱导的细胞过量表达的炎症信号通路中的两个关键酶：一氧化氮诱导合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)。此外，该板栗花组合物还可有效抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致小鼠足肿胀，进一步证实其抗炎作用，可以作为原料或辅助剂用于制备抗炎药物或食品。进一步地，该板栗花组合物具有原料来源丰富、工艺方法操作简便、成本低、易于产业化、无毒副作用等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为MTT法检测化合物对细胞增殖的影响；
图2为板栗花提取物对iNOS基因表达量的影响；
图3为板栗花提取物对COX-2基因表达量的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施方式的涉及的板栗花提取物在制备抗炎药物中的应用进行具体说明。
本发明实施方式的板栗花提取物的制备方法如下：
将新鲜板栗花干燥后粉碎，过60目筛，用水作溶剂，提取用水量为原料的15倍，提取温度为80℃，提取时间为3小时，间歇提取三次，过滤收集滤液，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯萃取液至溶剂完全蒸发，得到浸膏A，A用2倍体积的水溶解上聚酰胺柱，先用水洗脱至无色，再用8 柱体积的50％的乙醇洗脱，合并滤液减压浓缩得到浸膏B，B再用水溶解上大孔树脂，水洗无色后用50％乙醇洗脱，浓缩除醇后，干燥得板栗花提取物C。
实施例1
(1)小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7的制备和培养
C57BL/6小鼠，雄性，体重20克，腹腔注射4％巯基乙醇酸钠溶液，4 天后，断头处死，用剪刀沿小鼠腋下剪开，剥开腹部皮肤。用10mL注射器从第二肋间向腹腔方向(小心避免戳到肝脏和脾脏)进针，以冰冷的PBS 缓冲液冲洗细胞两次，每次8毫升，收集细胞洗出液，1000r/min离心5分钟，冰冷的RPMI1640培养基洗涤一次，计数细胞，用含10％FCS的1640培养基将细胞调节为1.2×106cells·mL-1。
(2)Griess法检测化合物对小鼠腹腔巨噬细胞NO生成的影响
将对数生长的细胞接种于48孔酶标板上，每孔接种500μL，37℃，CO2孵箱中静置2.5小时使细胞贴壁。控干上清液后，用1640培养基洗板2次，重新加入490μL 1640培养基，加5μL细菌脂多糖LPS，再分别加5μL不同浓度(1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、125μg/mL、625μg/mL)的浸膏A、浸膏B和板栗花提取物C，同时设空白对照组(无LPS及被测样品)和模型组(加LPS不加被测样品)，CO2孵箱中继续培养24小时。取出上清与等量的Griess试剂(含有2.5％磷酸的1％磺胺溶液与0.1％萘乙二胺溶液临用时1：1混合)于微量振荡器上混匀，而后置于室温下静置10分钟。550nm 滤光片酶标仪测定读数，根据NO2-标准曲线计算NO的含量。结果用半抑制浓度IC50表示对NO生成的影响，结果如表1所示。
表1.不同提取物对NO生成的影响
NO抑制 浸膏A 浸膏B 板栗花提取物C
IC<sub>50</sub>(μg/mL) 464.3 197.1 65.4
由表1的结果可知，本发明中的板栗花提取物C相对于粗提的浸膏A 和浸膏B对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型生成NO明显具有更显著的抑制作用。
(3)MTT法检测化合物对细胞的毒性
MTT法检测化合物对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7存活的影响：每孔加入细胞悬液100μL及5μL不同浓度(1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、 125μg/mL、625μg/mL)的板栗花提取物C，以无细胞孔作为全空白对照，设四个复孔，37℃，5％CO2的细胞培养箱内培养24h后，5加入MTT(mg.mL-1) 20μL，继续培养4小时，每孔加入10％SDS溶液，振摇混匀，细胞培养箱内放置12小时，测定570nm处的O.D.值。MTT法检测化合物对细胞增殖的影响如图1所示，从图中可以看出板栗花提取物C浓度在1-625μg/mL范围内，对小鼠巨噬细胞RAW264.7的生长均没有毒性作用(图1)。
实施例2
ELLISA法检测促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量
将对数生长的细胞接种于48孔酶标板上，每孔接种500μl，37℃，CO2孵箱中静置24小时。控干上清液后，用1640培养基洗板2次，重新加入 490μl 1640培养基培养。实验分为空白组、LPS组和实验组。实验组每孔加入5μl不同浓度的板栗花提取物C(1、5、25、125、625μg/mL)和LPS (1μg/mL)，LPS组(不加入被测样品)，空白对照组加入培养基，每个样品设3个重复孔，CO2孵箱中继续培养16小时。取出上清液，严格按照 ELISA试剂盒说明进行操作。
抑制率通过以下公式进行计算，且结果如表2所示。
抑制率＝(LPS组-实验组)/(LPS组-空白组)*100％
表2.板栗花提取物C对炎性因子生成的影响
Figure BDA0002390587850000071
由表2的结果可知，本发明中的板栗花提取物C对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型具有显著的改善作用，有效抑制炎症因子TNF-α、 IL-1β、IL-6的释放，从而表现出显著的体外抗炎作用。
实施例3
板栗花提取物对COX-2和iNOS mRNA表达水平的检测
(1)RAW264.7巨噬细胞中总RNA的提取
取对数期RAW264.7细胞，以2×105个细胞/孔接种于6孔板中，孵育24h，倒出上清液。同时设置三组：空白组，LPS组，实验组(LPS加不同浓度板栗花提取物C 5、25、125μM)，给药后置于37℃，CO2培养箱12h，吸出上清液，用PBS洗涤2次。采用Trizol试剂裂解细胞(参考Trizol 提取说明书)，采用微板法测RNA浓度。并用逆转录试剂盒(RT-PCR)(按照PrimeScript TMRT Master Mix试剂盒进行)进行RNA逆转录。采用Step One PlusTM Real-TimePCR System试剂盒进行荧光定量PCR反应，反应体系如下表3和表4：
表3.RT-PCR反应液配置
成分 体积(μL)
SYBRGreen 10
Fprimer 0.8
Rprimer 0.8
Rox Reference Dye 0.4
dH<sub>2</sub>O 6
cDNA 2
表4.荧光定量PCR引物序列表
Figure BDA0002390587850000081
NO作为重要的炎症介质，主要由一氧化氮诱导合酶(iNOS)诱导产生，抑制其表达可以有效控制炎症的发生发展。为明确板栗花提取物的抗炎效果，对iNOS的表达情况进行检测。结果如图2所示：将阴性对照的iNOS 表达量设为1，LPS共培养可使细胞的iNOS表达量显著上升，而加入不同浓度的板栗花提取物C可以显著抑制由LPS诱导的iNOS的上调，并且抑制率和浓度成正比关系。
***素PGE2是可被LPS诱导产生的炎症介质，进而影响炎症反应，而环氧合酶2(COX-2)可以催化PGE2的合成。因此，抑制COX-2的表达可以有效抑制炎症的发生。由图3可见，将未用LPS诱导的正常细胞COX-2 表达量设为1，经LPS诱导后COX-2表达量提高至其27倍左右，而不同浓度的板栗花提取物C均可以抑制由LPS诱导的COX-2的表达，并且浓度越高抑制效果越好。
通过RT-PCR检测，结果显示，LPS处理后可明显增加炎性基因iNOS和 COX-2的mRNA的相对表达量，与空白组相比，差异有统计学意义 (P<0.05)；板栗花提取物C处理后可降低i NOS和COX-2m RNA的相对表达量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。需要说明的是，图 2和图3中的板栗花组合物即为上述板栗花提取物C。
实施例4
板栗花提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
取体重20-22g小鼠，随机分为5组，模型组对照组、阳性对照组、板栗花提取物高中低计量组。分别皮下注射给予分组设置剂量药物(板栗花提取物C)(100、200、400mg/mL)，对照组给予等体积的药物溶媒，阳性对照组涂抹***软膏，给药1h后，于小鼠右耳两面涂二甲苯0.1mL 致炎，左耳作为正常对照。致炎4h后处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径6mm打孔器分别取下左右耳相同位置的耳片，称重，左右耳片质量差值表示炎性肿胀度，并计算肿胀抑制率(％)＝(对照组肿胀度-给药组肿胀度)/对照组肿胀度*100。
表5.板栗花提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀评价结果
Figure BDA0002390587850000091
Figure BDA0002390587850000101
表5的结果显示，板栗花提取物给药组对二甲苯所致的小鼠耳肿胀均有明显的抑制作用，三个不同剂量组肿胀抑制率呈明显的剂量依赖关系，抑制作用随剂量的增大而升高。与空白对照组相比，阳性对照组及可显著抑制小鼠耳肿胀，具有明显统计学差异(P＜0.01)，低剂量组和对照组对肿胀无统计学差异(P＞0.05)。
实施例5
板栗花提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响
取体重20-22g小鼠，随机分为5组，模型组对照组、阳性对照组、板栗花提取物C高中低计量组。在每只小鼠右踝关节的突起点处用笔划线作为测量标志，用足趾肿胀测定仪测定小鼠正常足容积。分别皮下注射给予分组设置剂量药物(板栗花提取物C)(100、200、400mg/mL)，对照组给予等体积生理盐水，阳性对照组为***注射液，给药45min后，于小鼠右后足跖腱膜下注射1％角叉菜胶致炎，6h后测量右后足体积，记录数据并计算肿胀抑制率。
肿胀抑制率(％)＝(对照组肿胀度-给药组肿胀度)/对照组肿胀度×100％。
表6.板栗花提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀评价结果
Figure BDA0002390587850000102
由表6可知，板栗花提取物低中高计量组均能减小小鼠足体积，与空白对照组相比，阳性对照组及板栗花提取物高计量组可显著抑制小鼠足肿胀，具有明显统计学差异(P＜0.01)，低剂量组和对照组对肿胀无统计学差异(P＞0.05)。
由此可以说明，板栗花提取物能够减轻二甲苯诱导的耳肿胀和角叉菜胶致小鼠足肿胀炎症反应，进一步证实其体内抗炎作用，可以为刺激性或接触性皮炎提供新的靶点。
综上所述，本发明提供的板栗花提取物对RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；可有效抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7产生过量的炎症介质NO及三种炎症细胞因子：TNF-α、IL-1β、IL-6，且其作用呈现剂量依赖。此外，还可有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞过量标的炎症信号通路中的两个关键酶：一氧化氮诱导合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)。并且该板栗花提取物还可有效抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致小鼠足肿胀。进一步证实其抗炎作用，可以为刺激性或接触性皮炎提供新的靶点。
进一步地，本发明提供的板栗花提取物具有原料来源丰富、工艺方法操作简便、成本低、易于产业化、无毒副作用等优点，同时本发明板栗花提取物具有良好的体内外抗炎活性，可作为抗炎药物或其原料或辅料，以用于预防或治疗由NO、TNF-α、IL-1β、IL-6过量而导致的炎症或刺激性或接触性皮炎。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.板栗花提取物在制备食品或抗炎药物中的应用，其特征在于，所述板栗花提取物至少由以下制备步骤制备得到：将板栗花的水提物通过乙酸乙酯萃取；
所述板栗花提取物的制备步骤还包括将通过乙酸乙酯萃取得到的萃取物依次通过聚酰胺柱和大孔树脂纯化；
其中，将通过乙酸乙酯萃取得到的萃取物通过聚酰胺柱包括将所述萃取物用1~3倍体积的水溶解上聚酰胺柱，用水洗脱至无色后，再用乙醇溶液洗脱，聚酰胺柱洗脱过程中所用乙醇溶液的质量分数为30%~60%，乙醇溶液用量为6~10柱体积；
通过大孔树脂纯化包括将通过聚酰胺柱纯化后的浓缩物水解后上大孔树脂，水洗至无色后用乙醇溶液洗脱，然后干燥，大孔树脂洗脱过程中所用乙醇溶液的质量分数为30%~60%，乙醇溶液用量为6~10柱体积。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述板栗花的水提物通过以下步骤制备：将板栗花在60~100℃的水中提取。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将新鲜板栗花干燥粉碎后，再进行提取。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，粉碎后过60目筛后再进行提取。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述板栗花在水中提取是：间歇提取三次，每次提取时间2~4小时，每次提取的液固质量比为10~20:1。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，按照体积比为1~2：1的乙酸乙酯对水提后的液体进行萃取，萃取后减压浓缩乙酸乙酯萃取液。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物为抗巨噬细胞产生的炎症的药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物为以板栗花提取物为主要活性成分的口服剂或外用制剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在所述抗炎药物中，所述板栗花提取物作为原料或辅助剂。
10.如权利要求1~9任一项所述的应用中的板栗花提取物在制备用于抑制巨噬细胞产生促炎细胞因子的抑制剂中的应用，其特征在于，所述促炎细胞因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述促炎细胞因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6。
12.如权利要求1~9任一项所述的应用中的板栗花提取物在制备用于抑制巨噬细胞生成炎症介质NO的抑制剂中的应用。
13.如权利要求1~9任一项所述的应用中的板栗花提取物在制备用于抑制一氧化氮诱导合酶的表达的抑制剂中的应用。
14.如权利要求1~9任一项所述的应用中的板栗花提取物在制备用于抑制环氧合酶2的表达的抑制剂中的应用。
15.如权利要求1~9任一项所述的应用中的板栗花提取物在制备治疗炎性耳肿胀的药物中的应用。
16.如权利要求1~9任一项所述的应用中的板栗花提取物在制备治疗炎性足肿胀的药物中的应用。
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