CN114231526A - 一种高丰度粪便微生物基因组dna提取的方法 - Google Patents

一种高丰度粪便微生物基因组dna提取的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，基于磁珠法实现，本发明包括缓冲液RB1、缓冲液RB2、裂解液、缓冲液P、缓冲液M、清洗液1、清洗液2和洗脱液，其具体过程如下：粪便样本经预处理后经裂解、结合、洗涤以及洗脱后获得粪便微生物基因组DNA。所述样本经缓冲液RB1和RB2预处理后，可有效地去除样本中的蛋白质、腐殖酸、多糖、脂类等杂质，并对样本实现初步的裂解作用，再经后续进一步的消化裂解，最终得到高纯度高质量的样本DNA，为下游PCR等检测提供优质的质量保证。本发明同时还提高了提取粪便样本中微生物的丰度，并可结合磁珠法提取，实现自动化和高通量。

Description

一种高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，尤其涉及一种高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法。
背景技术
人的胃肠道内寄居着种类繁多的微生物，大约有上千种不同的物种，这些微生物称为肠道微生物群，而这样一类生活在机体肠道中的微生物群落总称为肠道菌群。近年来越来越多的研究证据表明，肠道菌群与多种人类疾病的发生直接相关，其中，包括《Nature》和《Science》在内的各大顶级学术期刊相继发表了多篇肠道微生物与人体健康关系的最新研究成果。科学家们发现肠道菌群与自闭症、阿尔兹海默症、帕金森病、高血压、2型糖尿病、炎症性肠病、结直肠癌，甚至渐冻症等多种疾病有关联。同时肠道微生物群也是人体的重要组成部分，包括帮助机体消化食物，产生维生素、降低胆汁酸、调节机体免疫力，甚至治疗癌症。
然而，研究人体肠道内的微生物，首先需要分离鉴定出肠道菌群，但自然界中很多微生物不能用现有的培养方式进行分离和鉴定，而且大部分肠道菌群的生长需要厌氧环境，同时，仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株进行准确的鉴定，这就造成了培养方法的局限性。近些年随着分子生物学的发展及推广应用，研究者通常结合培养方法与分子生物学方法，对感兴趣的菌群进行研究。肠道内所有微生物的基因，也称为微生物组，是人类基因组的 100~150 倍，肠道微生物有时也被称为“被遗忘的器官”。因此肠道微生物又被认为是人体的第二基因组。对于肠道微生物基因组的研究，需提取出浓度和纯度较高的微生物基因组DNA，进而对于研究肠道微生物多样性，需提取出种类较多丰度较高的微生物。
针对粪便微生物基因组DNA的提取，现在常见的提取方法包括酚/氯仿抽提法、过柱法和磁珠法。
其中酚/氯仿抽提法流程较为繁琐，且用到了氯仿等有毒试剂，严重影响操作者的身体健康；过柱法提取中用到了多步骤离心操作，过程费时费力；现有磁珠法提取多着重于优化提取流程或者有效去除样本中的抑制物，对于种类较多丰度较高的微生物DNA的提取方法少之又少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，实现自动化快速分离纯化DNA。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，基于磁珠法实现，其具体过程如下：
粪便样本经预处理后经裂解、结合、洗涤以及洗脱后获得粪便微生物基因组DNA，所述裂解过程为：加入200-500μL裂解液和20μL缓冲液P，震荡混匀，于70℃下以1500rpm加热裂解10min；
所述裂解液包括20-200mmol/L氯化钠，1-10mmol/L乙二胺四乙酸二钠，10-100mmol/L Tris-Hcl，2-5mol/L硫氰酸胍，30-40%异丙醇、1-10%聚乙二醇对异辛基苯基醚的混合物，所述Tris-Hcl的pH为8.0；所述缓冲液P为20-50mg/mL蛋白酶K。
进一步地，所述结合过程具体如下：于裂解完成后，加入200-500μL无水乙醇和15μL缓冲液M，于室温下震荡结合10min；磁性分离后，彻底去除上清液；
所述缓冲液M为超顺磁性硅羟基纳米磁性微球，粒径为50-500nm，浓度为50-200mg/mL。
进一步地，所述洗涤过程具体如下：向离心管中加入500-1000μL清洗液，涡旋振荡1min后将离心管置于磁力架上，静置待磁珠吸附完全，彻底去除上清即完成清洗过程。
进一步地，所述清洗液包括清洗液1以及清洗液2，
所述清洗液1包括6-8mol/L盐酸胍，5-50mmol/L柠檬酸，5-50mmol/L柠檬酸钠，浓度为60-80%乙醇溶液，清洗液1的pH于4-6之间；
所述清洗液2为80%乙醇。
进一步地，所述清洗过程依次以清洗液1以及清洗液2完成清洗过程。
进一步地，于所述洗脱过程中，加入50-100μL洗脱液至离心管中，涡旋混匀20s，于60℃下以1300rpm恒温震荡10min；所述洗脱液为5-10mmol/L Tris-Hcl，洗脱液pH为8.0。
进一步地，于所述洗脱之前进行除醇，所述除醇过程为将离心管置于磁力架上，于通风橱中风干5min。
进一步地，所述预处理过程包括样本处理以及抑制剂去除；
所述样本处理过程具体如下：取50-200mg粪便样本于2 mL离心管中，加入400-800µL缓冲液RB1，充分涡旋震荡混匀后，于70℃下以1500rpm加热震荡裂解15min，然后12,000rpm离心2 min，转移约300-600µL上清液至新的2 mL离心管；
所述抑制剂去除过程具体如下：加入100-400 µL缓冲液RB2，涡旋震荡混匀，4℃放置5 min，12,000 rpm离心2 min，转移200-500 µL上清液至新的2 mL离心管。
进一步地，所述缓冲液RB1包括20-200mmol/L氯化钠，10-20mmol/L乙二胺四乙酸二钠，10-100mmol/L Tris-Hcl，20-200mmol/L硫氰酸胍，0.5-2%十二烷基硫酸钠、0.5-5%聚乙二醇对异辛基苯基醚，所述Tris-Hcl的pH为8.0；
所述缓冲液RB2包括0.5-2mol/L乙酸钾，2-5mol/L盐酸胍，0.1-10mmol/L聚合氯化铝，缓冲液RB2的pH于5-6之间。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：增加了提取的粪便微生物的种类，且结合磁珠法提取，可实现自动化和高通量。
附图说明
参照附图来说明本发明的公开内容。应当了解，附图仅仅用于说明目的，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。在附图中，相同的附图标记用于指代相同的部件。其中：
图1示意性显示了使用本发明提取的3份不同粪便样本DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中M表示DL 15000 DNA Marker；1表示粪便样本1提取基因组DNA；2表示粪便样本2提取基因组DNA；3表示粪便样本3提取基因组DNA；
图2示意性显示了以柱式法以及磁珠法提取样品属分类水平中物种profiling柱状图。
具体实施方式
容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式以及附图仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。
一种高丰度粪便微生物基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
S1. 样本处理：取50-200mg粪便样本于2 mL离心管中，加入400-800µL缓冲液RB1，充分涡旋震荡混匀后，于70℃以1500rpm加热震荡裂解15min。然后12,000 rpm离心2 min，转移约300-600µL上清液至新的2 mL离心管。
S2. 抑制剂去除：加入100-400 µL缓冲液RB2，涡旋震荡混匀，4℃放置5 min。12,000 rpm离心2 min，转移200-500 µL上清液至新的2 mL离心管。
S3. 核酸裂解：加入200-500 µL 裂解液和20 µL 缓冲液P，震荡混匀，于70℃以1500rpm加热裂解10min 。
S4. 核酸结合：裂解完成后，加入200-500 µL 无水乙醇和15µL 缓冲液M，室温震荡结合10min。磁性分离，彻底去除上清液，期间避免接触磁珠。
S5. 清洗1：向离心管中加入500-1000μL清洗液1，涡旋振荡1min。将离心管置于磁力架上，静置待磁珠吸附完全，彻底去除上清。
S6. 清洗2：向离心管中加入500-1000μL清洗液2，涡旋振荡1min。将离心管置于磁力架上，静置待磁珠吸附完全，彻底去除上清。重复本步骤1次。
S7. 除醇：将离心管置于磁力架上，放置通风橱中，风干5min。
S8. 洗脱：加入50-100μL洗脱液，涡旋混匀20s，于60℃以1300rpm恒温震荡10min。
S9.核酸转移：将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后将上清转移至新的离心管中，即得粪便微生物基因组DNA。
其中，缓冲液RB1包括20-200mmol/L氯化钠，10-20mmol/L乙二胺四乙酸二钠，10-100mmol/L Tris-Hcl（pH 8.0），20-200mmol/L硫氰酸胍，0.5-2%十二烷基硫酸钠、0.5-5%聚乙二醇对异辛基苯基醚。缓冲液RB2包括0.5-2mol/L乙酸钾，2-5mol/L盐酸胍，0.1-10mmol/L聚合氯化铝，pH 5-6。优选的缓冲液RB1和RB2可以有效地去除样本中的蛋白质、腐殖酸、多糖、脂类等杂质，从而获得纯度较高的样本DNA，为下游PCR等检测提供优质的质量保证。乙二胺四乙酸二钠是一种能与Mg2+、Ca2+、Mn2+等二价金属离子结合的螯合剂，由于多数核酸酶类作用需要Mg2+，如Dnase酶，所以常用做核酸酶的抑制剂，以保护DNA不被变性或降解。硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可以溶解蛋白质，主要作用是裂解细胞，使细胞中的核酸物质解聚得到释放。十二烷基硫酸钠是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂，可以溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，而破坏细胞膜，在高温下可以破坏蛋白质与核酸的结合，促进核酸释放。聚乙二醇对异辛基苯基醚是一种常见的非离子表面活性剂，常用的细胞裂解液成分之一，可提高细胞膜的通透性。乙酸钾中的钾离子可与十二烷基硫酸钠反应形成沉淀，而十二烷基硫酸钠可以蛋白质结合，平均两个氨基酸上可结合一个十二烷基硫酸钠分子，钾钠离子置换所产生的沉淀则可使得大部分蛋白质沉淀。聚合氯化铝常作为絮凝剂，样本中的腐殖酸可与铝盐形成混凝作用，从而有效降低样本中的腐殖酸含量，提高DNA的纯度。缓冲液中另加入了较高浓度的盐酸胍，其可溶解蛋白质，破坏细胞结构，破坏核蛋白二级结构，将纯的DNA释放出来，实现初步裂解细胞的作用，为进一步的裂解结合奠定基础。
裂解液包括20-200mmol/L氯化钠，1-10mmol/L乙二胺四乙酸二钠，10-100mmol/LTris-Hcl（pH 8.0），2-5mol/L硫氰酸胍，30-40%异丙醇、1-10%聚乙二醇对异辛基苯基醚。缓冲液P为20-50mg/mL蛋白酶K。优选的裂解液及缓冲液P的加入进一步对DNA样本实现充***解，从而获得浓度较高的DNA样本。Tris-Hcl是一种常见的缓冲剂，为裂解液及核酸提供一个比较适宜的环境。蛋白酶K是一种强力蛋白溶解酶，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中。异丙醇属于强亲水性溶剂，加入到溶液中时，水溶液被饱和，DNA分子呈现出一从溶液中逃逸的趋势，从而被吸附到固相载体表面。
缓冲液M为超顺磁性硅羟基纳米磁性微球，粒径为50-500nm，浓度为50-200mg/mL。优选的缓冲液M中的磁性微球是使用最广泛的磁珠之一，其可在高离子浓度盐下吸附DNA、低离子盐下释放DNA。
清洗液1包括6-8mol/L盐酸胍，5-50mmol/L柠檬酸，5-50mmol/L柠檬酸钠，浓度为60-80%乙醇溶液，pH4-6。清洗液2为80%乙醇。优选的清洗液1和清洗液2可去除样本DNA中的蛋白，盐类等杂质，最终获得高纯度的DNA。盐酸胍不仅能够快速地破坏细胞膜，变性蛋白质，使得蛋白质变性沉淀，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕，其还是核酸酶的强抑制剂。柠檬酸钠可控制反应体系中的离子强度，且还具有一定的缓冲作用，保证缓冲液中pH相对稳定。80%乙醇中DNA是不溶的，而盐离子可溶，因此DNA通过该溶液清洗，可有效去除残留的盐类。
洗脱液为5-10mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0。优化的洗脱液选用Tris-Hcl缓冲体系，保证溶液中pH的相对稳定，且其对DNA的洗脱效率要高于灭菌水。
以下结合实施例对于本发明的技术效果作具体说明。
实施例1 选取3份不同的粪便样本使用本方法进行提取
1.样本处理：取100mg粪便样本于2 mL离心管中，加入700µL缓冲液RB1，充分涡旋震荡混匀后，70℃ 1500rpm加热震荡裂解15min。然后12,000 rpm离心2 min，转移约500µL上清液至新的2 mL离心管。
2.抑制剂去除：加入200 µL缓冲液RB2，涡旋震荡混匀，4℃放置5 min。12,000 rpm离心2 min，转移400 µL上清液至新的2 mL离心管。
3.核酸裂解：加入400 µL 裂解液和20 µL 缓冲液P，震荡混匀，70℃ 1500rpm加热裂解10min。
4.核酸结合：裂解完成后，加入400 µL 无水乙醇和15µL 缓冲液M，室温震荡结合10min。磁性分离，彻底去除上清液，期间避免接触磁珠。
5.清洗1：向离心管中加入800μL清洗液1，涡旋振荡1min。将离心管置于磁力架上，静置待磁珠吸附完全，彻底去除上清。
6.清洗2：向离心管中加入800μL清洗液2，涡旋振荡1min。将离心管置于磁力架上，静置待磁珠吸附完全，彻底去除上清。重复本步骤1次。
7. 除醇：将离心管置于磁力架上，放置通风橱中，风干5min。
8. 洗脱：加入80μL洗脱液，涡旋混匀20s，60℃ 1300rpm恒温震荡10min。
9.核酸转移：将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后将上清转移至新的离心管中，即得粪便微生物基因组DNA。
提取完成后，使用微量紫外分光光度计（NanoDrop）测定洗脱液中DNA的含量和纯度如表1所示，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量如图1所示。依据下述结果，从表中可以看出使用本发明提取的粪便微生物基因组DNA浓度高、纯度高，从电泳图可以看出本发明提取基因组DNA主条带清晰，基本无杂带，完整性较好。
表1 NanoDrop测定实施例1洗脱液中DNA的含量和纯度
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2 本发明提取效果与现有柱式法粪便基因组DNA提取试剂盒比较
选取3份不同的粪便样本，每份样本各取两份100mg，分别置于2 mL离心管中，并分别使用本方法及现有柱式法粪便基因组DNA提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool MiniKit，货号：51604）进行提取，提取方法参照外购试剂盒说明书进行。提取完成后，将上述两种方法提取的粪便基因组DNA使用微量紫外分光光度计（NanoDrop）测定洗脱液中DNA的含量和纯度如表2所示，同时对上述两种方法提取的粪便基因组DNA进行下游16s建库测序，随后对测序数据进行分析如表3和图2所示。
依据下述结果可见，本发明提取粪便基因组DNA的提取量明显高于现有柱式法试剂盒；同时通过测序结果分析发现，本发明提取样品的OTU丰度及香浓指数均高于现有柱式法，且柱状图也表明本发明提取样品的物种较丰富，说明本发明提取样品多样性较高，为后续的肠道菌群研究提供了一种有利的提取方法。
表2 NanoDrop测定实施例2洗脱液中DNA的含量和纯度
Figure 743710DEST_PATH_IMAGE002
表3 上述两种方法提取样品DNA 16s测序OTU丰度及Shannon指数分析
Figure DEST_PATH_IMAGE003
注： OTUs即Operational Taxonomic Units的缩写，在***发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，属，种、分组等）设置的同一标志。理论上一个OTU代表一个微生物物种。
Shannon即香浓指数，是菌群多样性的指数之一，Shannon值越大，说明群落多样性越高。
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，其特征在于，基于磁珠法实现，其具体过程如下：
粪便样本经预处理后经裂解、结合、洗涤以及洗脱后获得粪便微生物基因组DNA，所述裂解过程为：加入200-500μL裂解液和20μL缓冲液P，震荡混匀，于70℃下以1500rpm加热裂解10min；
所述裂解液包括20-200mmol/L氯化钠，1-10mmol/L乙二胺四乙酸二钠，10-100mmol/LTris-Hcl，2-5mol/L硫氰酸胍，30-40%异丙醇、1-10%聚乙二醇对异辛基苯基醚的混合物，所述Tris-Hcl的pH为8.0；所述缓冲液P为20-50mg/mL蛋白酶K。
2.根据权利要求1所述的高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，其特征在于，所述结合过程具体如下：于裂解完成后，加入200-500μL无水乙醇和15μL缓冲液M，于室温下震荡结合10min；磁性分离后，彻底去除上清液；
所述缓冲液M为超顺磁性硅羟基纳米磁性微球，粒径为50-500nm，浓度为50-200mg/mL。
3.根据权利要求1所述的高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，其特征在于，所述洗涤过程具体如下：向离心管中加入500-1000μL清洗液，涡旋振荡1min后将离心管置于磁力架上，静置待磁珠吸附完全，彻底去除上清即完成清洗过程。
4.根据权利要求3所述的高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，其特征在于，所述清洗液包括清洗液1以及清洗液2，
所述清洗液1包括6-8mol/L盐酸胍，5-50mmol/L柠檬酸，5-50mmol/L柠檬酸钠，浓度为60-80%的乙醇溶液，清洗液1的pH于4-6之间；
所述清洗液2为80%乙醇。
5.根据权利要求3或4任一所述的高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，其特征在于，所述清洗过程依次以清洗液1以及清洗液2完成清洗过程。
6.根据权利要求1所述的高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，其特征在于，于所述洗脱过程中，加入50-100μL洗脱液至离心管中，涡旋混匀20s，于60℃下以1300rpm恒温震荡10min；所述洗脱液为5-10mmol/L Tris-Hcl，洗脱液pH为8.0。
7.根据权利要求1所述的高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，其特征在于，于所述洗脱之前进行除醇，所述除醇过程为将离心管置于磁力架上，于通风橱中风干5min。
8.根据权利要求1所述的高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，其特征在于，所述预处理过程包括样本处理以及抑制剂去除；
所述样本处理过程具体如下：取50-200mg粪便样本于2 mL离心管中，加入400-800µL缓冲液RB1，充分涡旋震荡混匀后，于70℃下以1500rpm加热震荡裂解15min，然后12,000 rpm离心2 min，转移约300-600µL上清液至新的2 mL离心管；
所述抑制剂去除过程具体如下：加入100-400 µL缓冲液RB2，涡旋震荡混匀，4℃放置5min，12,000 rpm离心2 min，转移200-500 µL上清液至新的2 mL离心管。
9.根据权利要求8所述的高丰度粪便微生物基因组DNA提取的方法，其特征在于，
所述缓冲液RB1包括20-200mmol/L氯化钠，10-20mmol/L乙二胺四乙酸二钠，10-100mmol/L Tris-Hcl，20-200mmol/L硫氰酸胍，0.5-2%十二烷基硫酸钠、0.5-5%聚乙二醇对异辛基苯基醚，所述Tris-Hcl的pH为8.0；
所述缓冲液RB2包括0.5-2mol/L乙酸钾，2-5mol/L盐酸胍，0.1-10mmol/L聚合氯化铝，缓冲液RB2的pH于5-6之间。
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