CN113136415A - 一种核酸提取方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸提取方法，所述方法包括：a.根据核酸上的目的核酸序列设计探针；b.将所述探针与固相载体连接，得到捕获载体；c.将所述捕获载体与样品混合，通过温度变化，使所述捕获载体与样品中的靶核酸结合；d.将捕获载体从样品中分离，通过温度变化将核酸与捕获载体解离，收集核酸。其中，靶核酸可以是cfDNA、基因组DNA或RNA。本发明采用杂交法对样品中的靶核酸进行提取，能够实现特定基因片段的靶向富集和提取，有利于降低后续的检测背景；通过调整野生型或者突变型探针的比例，使提取产物中突变型基因片段的比例上升，便于后续对低比例突变的检测，可大大提高检测灵敏度；并且本发明方法操作过程简单，有利于自动化操作。

Description

一种核酸提取方法及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种核酸提取方法，特别是涉及一种低丰度突变核酸的提取方法。
背景技术
提取生物样本中的核酸对目的核酸序列进行检测在产前诊断、肿瘤诊断筛查和预后检测以及免疫性疾病等非肿瘤类疾病的病情分析与疗效观察等领域具有重要意义，但相关样本中核酸的丰度一般较低，需要对其进行提取纯化。
目前市场上多数核酸纯化试剂盒是通过硅胶膜离心柱或者表面经过特殊标记处理的磁珠进行纯化。该纯化原理是在高盐和低pH的溶液条件下，硅胶膜和磁珠能专一性的吸附核酸，由此将样本中的核酸吸附到硅胶膜或者磁珠之类的固相载体上；然后使用含有胍盐（盐酸胍或者异硫氰酸胍）的酒精溶液进行洗涤，去除固相载体上的蛋白质、脂质和盐离子；由于在低盐以及较高的pH溶液条件下，结合在硅胶膜或者磁珠上的核酸会与它们分离，最后用去离子水或TE buffer（Tris-EDTA）进行洗脱，即得。如果目的核酸在样品中含量相对较少，为了提高核酸提取产量，一般在提取试剂盒中准备Carrier RNA，在提取的过程中将Carrier RNA加入到样品中，有利于核酸与固相基质（硅胶膜或者磁珠）结合，从而提高核酸的整体提取效率。
然而这种纯化方法并不适用于核酸浓度较低的样品，基于这种提取方法的整体提取效率并不高，进一步地，比如在用于肿瘤的个体化用药指导和预后的核酸检测方面，突变核酸只占总核酸的一小部分，用这种传统方法所提取得到的核酸包含了人类基因组中所有的DNA片段，这些DNA片段在后续的检测（包括PCR、测序和杂交检测）过程中，绝大多数都是背景噪音；此外，这种传统的提取方法需要较多的提取步骤，在提取的过程中需要用到多种化学试剂，不便于自动化操作。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种核酸提取方法，特别是用于低丰度突变的核酸提取方法，所述方法包括：a 根据核酸上的目的核酸序列设计探针；b 将所述探针与固相载体连接，得到捕获载体；c 将所述捕获载体与样品混合，通过温度变化，使所述捕获载体与样品中的靶核酸结合；d 将捕获载体从样品中分离，通过温度变化将核酸与捕获载体解离，收集核酸。
本发明的靶核酸为cfDNA、基因组DNA或RNA。cfDNA，即循环游离DNA或者细胞游离DNA（Circulating free DNA or Cell free DNA，cfDNA），是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。相比组织样品中基因组DNA含量而言，血清或血浆样品中cfDNA的含量很低，血液中cfDNA的来源主要是细胞凋亡、死亡和正常细胞的主动外排，来自肿瘤细胞的cfDNA也就是要检测的ctDNA(circuling tutor DNA)只占所有cfDNA的一小部分。
本发明所述探针包含DNA探针或PNA探针。PNA（Peptide nucleic acid，肽核酸）是一种人工合成的类似于DNA，RNA的化学物质；PNA的骨架是由重复的N-2-(氨乙基)-甘氨酸为单位，经由肽键组合而成；碱基与骨架之间是以亚甲羧键相连，与多肽相似的是，PNA也有N端和C端的差别。
本发明所述DNA探针包括突变型DNA探针和野生型DNA探针。所述突变型DNA探针根据突变序列设计，具有突变位点，与野生型DNA探针的碱基不完全匹配；所述野生型DNA探针根据野生型DNA序列设计，与野生型DNA探针的碱基完全匹配。优选地，所述突变型DNA探针浓度高于野生型DNA探针。
本发明所述PNA探针包括突变型PNA探针和野生型PNA探针。所述突变型PNA探针根据突变序列设计，具有突变位点，与野生型PNA探针的碱基不完全匹配；所述野生型PNA探针根据野生型PNA序列设计，与野生型PNA探针的碱基完全匹配。优选地，所述突变型PNA探针浓度高于野生型PNA探针。
在本发明的一种实施方式中，使用两种PNA探针——突变型PNA探针和野生型PNA探针，并使突变型PNA探针数量占绝大部分，因此在对样品中的DNA进行捕获的过程中，突变型的捕获产物比例会大幅度增加，这样就会大大提高后续检测过程中突变型基因的检出效率。
在一些优选实施例中，所述DNA探针还包括公共序列DNA探针。
在一些优选实施例中，所述PNA探针还包括公共序列PNA探针。
本发明所述固相载体包括磁珠、磁性颗粒、微球、玻璃片、硅片或聚合物基片，所述固相载体表面标记有羧基或醛基。
另一方面，本发明还提供上述核酸提取方法在产前诊断、肿瘤筛查以及免疫性疾病筛查过程中提取核酸的应用。包括但不限于动物cfDNA的提取、基因组DNA的提取、RNA的提取。
本发明还提供一种用于实施上述方法的核酸提取试剂盒，包括捕获载体和洗脱液，所述捕获载体由探针与固相载体连接得到，所述探针根据DNA上的目的核酸序列设计得到，所述洗脱液选自去离子水或TE缓冲液。
本发明采用杂交法对样品中的靶DNA（尤其是低丰度突变DNA）进行提取，能够实现特定基因片段的靶向富集和提取，有利于降低后续的检测背景；通过调整野生型或者突变型探针的比例，使提取产物中突变型基因片段的比例上升，便于后续对低比例突变的检测，可大大提高检测灵敏度；并且本发明方法操作过程简单，有利于自动化操作。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。下述实施例中所使用的材料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。
实施例 EGFR（2171位点）基因突变基因型富集提取
A. 根据基因EGFR（2171位点）设计PNA探针序列：
EGFR野生型PNA探针：TTTGGGCTGGCCAAA
和EGFR突变型PNA探针：TTTGGGCGGGCCAAA。
将这两种PNA探针按照野生型PNA探针：突变型PNA探针浓度为1：100混合，然后稀释到50nmol/ml。
B. 将PNA探针连接羧基磁珠，得到捕获磁珠。由于合成的PNA探针的一头带有一个伯氨基，使用EDC将磁珠上的羧基活化之后使之与PNA一端的伯氨基偶联（按照购自厦门普睿迈格生物科技有限公司的羧基磁珠偶联用缓冲液套装的步骤操作），操作步骤如下：
（1）涡旋振荡重悬羧基磁珠，取100ul于1.5ml离心管中，磁分离，弃上清；
（2）加200ul偶联缓冲液，剧烈震荡20秒，磁分离，弃上清；
（3）重复步骤（2）两次；
（4）加入80ul偶联缓冲液，加入20ulPNA缓冲液（50nmol/ml）；
（5）在室温下震荡孵育30分钟；
（6）用偶联缓冲液配置EDC（50mg/ml）；
（7）将20ul新配制的EDC加入磁珠中，涡旋混匀，室温震荡孵育2小时；
（8）磁分离，弃上清；
（9）向羧基磁珠离心管内加500ul淬灭缓冲液，涡旋20秒，磁分离，弃上清；
（10） 加入500ul淬灭缓冲液，室温震荡孵育40分钟，磁分离，弃上清；
（11） 向羧基磁珠离心管内加500ul淬灭缓冲液，涡旋20秒，磁分离，弃上清，再重复本步骤两次；
（12） 加入100ul储存缓冲液，4℃保存备用。
C. 将所述捕获磁珠与样品混合，使其捕获样品中的特异序列的cfDNA，具体包括以下步骤：
（1）取肺癌患者临床血清或者血浆样品1ml，加入等体积的2*SSC溶液；
（2）加入20-50ul偶联了PNA的磁珠；
（3）95℃处理5min，使样品中的双链DNA全部解离成单链；
（4）50-80℃复性2-5分钟，使样品中的单链DNA特异性的与磁珠上的PNA互补结合，处理完成后，在保持处理温度不变的条件下，磁吸附收集磁珠，弃去上清。
D. 将DNA与捕获载体解离，收集DNA，具体步骤如下：
加入20-50ulTE buffer或者去离子水溶解磁珠。95℃处理3分钟，在保持95℃的条件下磁吸附收集磁珠。吸取上清液即为提取产物。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰同样落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种核酸提取方法，所述方法包括：
a. 根据核酸上的目的核酸序列设计探针；
b.将所述探针与固相载体连接，得到捕获载体；
c.将所述捕获载体与样品混合，通过温度变化，使所述捕获载体与样品中的靶核酸结合；
d.将捕获载体从样品中分离，通过温度变化将核酸与捕获载体解离，收集核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸为cfDNA、基因组DNA或RNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针包括DNA探针和/或PNA探针。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA探针包括突变型DNA探针和野生型DNA探针；所述PNA探针包括突变型PNA探针和野生型PNA探针。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述突变型DNA探针的浓度高于野生型DNA探针；所述突变型PNA探针的浓度高于野生型PNA探针。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述DNA探针还包括公共序列DNA探针；所述PNA探针还包括公共序列PNA探针。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体选自磁珠、磁性颗粒、微球、玻璃片、硅片或聚合物基片，所述固相载体表面标记有羧基或醛基。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法在产前诊断、肿瘤筛查或免疫性疾病筛查过程中提取核酸的应用。
9.一种用于实施权利要求1-7任一项所述方法的核酸提取试剂盒，包括捕获载体和洗脱液，所述捕获载体由探针与固相载体连接得到，所述探针根据核酸上的目的核酸序列设计得到，所述洗脱液选自去离子水或TE缓冲液。
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CN113528317A (zh) * 2020-04-15 2021-10-22 拓原合壹(宁波)生物技术有限公司 核酸提取方法

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