CN114231445A - 一种复合益生菌的混合发酵培养基及其应用 - Google Patents

一种复合益生菌的混合发酵培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于益生菌发酵领域，公开了一种复合益生菌的混合发酵培养基及其应用。本用于制备复合益生菌菌剂的微生物组合物，由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)J13、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)R12和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y11组成。发明减少了配置各种菌株不同配方培养基的繁琐过程，并显著提高了各菌株的活菌数，降低了生产成本，具有较高的商业价值。混合益生菌菌剂用于饲料固态发酵，显著提高了饲料的粗蛋白、小肽及有机酸含量，并改善了饲料的口感，提升了饲料品质。

Description

一种复合益生菌的混合发酵培养基及其应用
技术领域
本发明涉及到工农业及食品健康领域，具体为一种适合复合益生菌共培养的混菌发酵培养基及其应用。
背景技术
益生菌(Probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物，是定殖于人体或动物肠道、生殖***内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥对肠道有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：益生芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。本专利主要以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为出发菌株，开发出一种复合益生菌的混合发酵培养基。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，可形成内生芽孢。繁殖速度较快，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成褶皱，是一种需氧菌。可产多种水解酶如纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。在水产养殖、动物饲料生产、植物抗病、医药领域及水质净化具有重要应用。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是一种兼性厌氧型革兰氏阳性乳酸菌，菌体形态为球状或链状，无荚膜，无芽孢，对环境适应力和抵抗力强，可耐受四环素、卡那霉素、庆大霉素等多种抗生素。在饲料发酵中具有重要作用，可改善肠道内微生态平衡，抑制病原菌和解除抗营养因子。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是与人类关系最为密切的一种酵母，用于制作食品，酿酒及发酵饲料。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养以及含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分等优点，在食品、医药及发酵领域应用广泛。
近两年由于无抗养殖概念的提出，益生菌在动物生产中应用的报道也很多，主要包括猪、禽及反刍动物等。从国内外的研究开发及使用情况分析，益生菌的利用方向由单一菌种的利用趋向于复合益生菌制剂的应用效果研究。但芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌在工业化培养过程中，因其对营养的特殊需求，导致了它们培养基配方的不同，所以常用乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌单独培养，这将提升发酵的工段同时也大大增加了生产成本。不同属菌种共同培养中因其特殊的生物机制可能存在拮抗作用，如干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)和植物乳杆菌(Lactobacillus csei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)等同属乳酸菌在一起培养时存在生物拮抗作用。乳酸菌和酵母菌之间共生作用较强，通常可以混合培养，但芽孢杆菌和酵母菌互相产生抗菌物质，所以混菌发酵往往难以成功。因此在生产过程中廉价而经济型的混合培养基就显得格外重要。
发明内容
本发明的目的是针对益生菌的混菌培养问题，提供一种适合混菌发酵的培养基和培养条件，并用于饲料固态发酵应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
用于制备复合益生菌菌剂的微生物组合物，由酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)J13、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)R12和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Y11组成；其中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)J13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCC NO： M 20211145；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)R12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCCNO：M 20211146；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 20211147。
所述的微生物组合物在制备复合益生菌菌剂中的应用。
所述的复合益生菌菌剂在饲料固态发酵中的应用。
一种混合益生菌菌剂，将本发明所述的三种微生物种子液接种到混菌培养基 YP中混合培养至稳定期得所述的混合益生菌菌剂；所述的混菌培养基YP由每1000ml水中添加如下重量体积百分比组分：糖蜜1-2％、蛋白胨1.5-2％、七水合硫酸镁0.02-0.025％、磷酸氢二钾0.1-0.5％、无水乙酸钠0.1-0.6％、一水合硫酸锰0.005-0.01％，最后调节pH至6.0-6.5即得。
作为本发明的一种优选，所述的混菌培养基YP由每1000ml水中添加如下重量体积百分比组分：糖蜜2％、蛋白胨1.5％、七水合硫酸镁0.025％、磷酸氢二钾0.2％、无水乙酸钠0.6％、一水合硫酸锰0.005％，，最后调节pH至6.0-6.5 即得。
作为本发明的一种优选，复合益生菌菌剂中枯草芽孢杆菌Y11、粪肠球菌 R12和酿酒酵母J13活菌数均达到1亿CFU/ml以上。
一种混合益生菌菌剂的制备方法，将本发明所述的三种微生物种子液接种到混菌培养基YP中混合培养至稳定期即得所述的混合益生菌菌剂；培养条件为pH 为6.0-6.5、最适温度为35-37℃、最适转速为180-220r/min。
本发明所述的复合益生菌菌剂在饲料固态发酵中的应用。
本发明所述的益生菌菌剂用于饲料固态发酵方法，复合益生菌剂最佳接种量为10％，最佳发酵温度为36℃、最佳料水比为60％(固体原料重量∶加水体积)，发酵时间3天。
本发明所述的混合益生菌菌剂在提高饲料粗蛋白、小肽及有机酸含量的应用。
本发明所述的混合益生菌菌剂在改善饲料口感、提升饲料品质中的应用。
与现有技术相比有如下优点：本发明简单易行，经济实惠，解决了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)因对营养的特殊需求培养基不能通用问题。
本发明所述的复合益生菌菌剂用于饲料固态发酵，显著提高了饲料的粗蛋白、小肽及有机酸含量，并改善了饲料的口感，提升了饲料品质。
生物材料保藏信息
Saccharomyces cerevisiae J13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021 年9月6日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 20211145，保藏地址为中国武汉武汉大学。
Enterococcus faecalis R12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9 月6日，菌种保藏号为CCTCCNO：M 20211146，保藏地址为中国武汉武汉大学。
Bacillus subtilis Y11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月 6日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 20211147，保藏地址为中国武汉武汉大学。
具体实施方式
为了让本发明实验技术手段更易理解，下面结合具体实施方式继续阐明本实验方案，任何人在本发明权利要求保护范围内的修改，仍在本发明权利要求保护范围内。
实施例1混菌培养基单因子优化
以活菌数作为指标对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y11、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)R12和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)J13初始培养基(LB、MRS、YPD)分别进行单因素实验确定最适碳源、氮源。
三种初始培养基分别为LB培养基(蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、蒸馏水定容至1000mL、pH 7.0)、MRS培养基(蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸二铵2g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.25g、硫酸锰0.05g、氯化钙3g、pH 6.8，水1000mL)、YPD培养基(葡糖20g、蛋白胨20g、酵母膏10g、蒸馏水1000mL、pH 6.2～6.5)、改良后的 MRS培养基(蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、蒸馏水定容至1000mL、pH 7.0)。
碳源的筛选：将三株菌的种子液按1％接种量(V:V)接种到碳源分别为乳糖、糖蜜、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉的改良MRS培养基中，碳源占比为2％ (重量∶体积)，用稀盐酸或0.1％NaOH溶液将培养基初始pH调节至7.0，在 30℃、180r/min条件下振荡培养24h，梯度稀释，活菌计数。
氮源的筛选：确定最佳碳源后，将三株菌的种子液按1％接种量(V:V)接种到氮源分别为胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、大豆蛋白胨与酵母膏混合(混合比例为1：1)的改良MRS培养基中，氮源占比为2％(重量∶体积)，用稀盐酸或0.1％NaOH溶液将培养基初始pH调节至7.0，在30℃、180r/min条件下振荡培养24h，梯度稀释，活菌计数。
根据表1可知，适合三株菌的碳氮源分别为糖蜜、蛋白胨。
表1不同碳氮源条件下的活菌数
Figure BDA0003384724440000051
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)R12初始培养基(MRS)成分复杂，因此通过Plackett-Burman试验设计确定其培养基关键成分，按各因子效应及显著性排名依次为蛋白胨1％、七水硫酸镁0.025％、一水合硫酸锰0.005％、无水乙酸钠0.5％和牛肉膏1％(重量∶体积)。确定最终无机盐为无水乙酸钠、七水硫酸镁和一水合硫酸锰。
表2Plackett-Burman试验设计各因子效应及显著性
Figure BDA0003384724440000061
由此，混合发酵培养基成分确定：糖蜜、蛋白胨、七水合硫酸镁、磷酸氢二钾、无水乙酸钠、一水合硫酸锰和水。
实施例2混菌培养基配方优化
根据Design-Expert的响应面中心组合试验设计原理，在单因素试验中筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐及其浓度范围的基础上，固定初始pH为7.0，接种量1％，发酵温度30℃，摇床转速180r/min培养至稳定期，梯度稀释，活菌计数，利用响应面分析法对糖蜜(A、B、C按浓度梯度依次为1.5％、1.75％、2％) (重量∶体积)、蛋白胨(A、B、C按浓度梯度依次为1.25％、1.5％、1.75％)(重量∶体积)、无水乙酸钠(A、B、C按浓度梯度依次为5％、6％、7％)(重量∶体积)具体添加量进行优化。由表3可知混菌培养基(YP)最佳配方为：糖蜜1.5％、蛋白胨1.5％、七水合硫酸镁0.025％、磷酸氢二钾0.2％、无水乙酸钠0.6％、一水合硫酸锰0.005％、水1000ml。
表3Box-Behnken试验结果
Figure BDA0003384724440000062
Figure BDA0003384724440000071
实施例3混菌培养条件优化
以实施例2的混菌培养基为基础，选取26℃、28℃、31℃、34℃、37℃和 40℃6个温度作为发酵温度，测定不同温度下混合菌的细胞数量；选取5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0作为初始pH，测定不同初始pH下混合菌的细胞数量；选取120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min和220r/min作为摇床转速，测定不同转速下混合菌发酵后的细胞数量。确定最适pH为6.0-6.5、最适温度为37℃、最适转速为200r/min。
表3不同温度、初始pH及转速条件下的活菌数
Figure BDA0003384724440000072
Figure BDA0003384724440000081
实施例4复合益生菌剂的制备
根据实施例2获得的混菌培养基(YP：糖蜜1.5％、蛋白胨1.5％、七水合硫酸镁0.025％、磷酸氢二钾0.2％、无水乙酸钠0.6％、一水合硫酸锰0.005％、水 1000ml)配制培养基。将纯化后的过夜培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y11、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)R12和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)J13 种子液，均按照1％接菌量(V∶V)接入混菌培养基YP中(100mL锥形瓶)，根据实施例3获得的培养条件(pH6.0-6.5、37℃、200r/min)进行培养，每间隔2h取样，测定菌液起始和培养过程中OD600值。对照处理为分别对应接入菌株Y11、R12和J13的初始培养基LB、MRS和YPD，接种量为1％(V∶V)，培养条件和测定方法与混合培养一致。
结果表明，三株菌在2h即进入对数生长期，Enterococcus faecalis R12生长速率略高于Bacillus subtilis Y11和Saccharomyces cerevisiae J13，在20h时 Bacillussubtilis Y11和Enterococcus faecalis R12进入稳定期，而Saccharomyces cerevisiaeJ13仍还在继续生长并于36h开始进入稳定期。由表4可知，混菌培养基(YP)中36h时三株菌活菌数均显著高于初始培养基。
表4YP和各菌株初始培养基活菌数
Figure BDA0003384724440000091
参考GB4789.2-2016方法测定36h混菌发酵液中的活菌数。Bacillus subtilisY11由初始培养基的3.52×108CFU/ml提升为1.02×109CFU/ml，提升2.89倍； Enterococcusfaecalis R12由初始培养基的2.31×109CFU/ml提升为4.97×1010 CFU/ml，提升110倍；Saccharomyces cerevisiae J13由初始培养基的6.40×107 CFU/ml提升为1.11×1010CFU/ml，提升170倍，活菌数显著提高。
对YP培养基进行成本换算按工业级换算：糖蜜3.5元/千克、蛋白胨40元 /千克、七水硫酸镁10元/千克、无水乙酸钠4.36磷酸二氢钾、一水硫酸锰3.32 元/千克、磷酸二氢钾6元/千克。配置1吨YP培养基成本为688.9元。可见本发明培养基(YP)价格低廉，简单易行，适合工业化生产枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )，具有较高商业价值。
实施例5复合益生菌剂发酵饲料的条件确定
以迪兰牌单向呼吸阀饲料袋为容器，玉米胚芽粕为发酵原料，选取30℃、 32℃、34℃、36℃、38℃和40℃6个温度作为发酵温度，测定不同温度下固态饲料发酵后小肽含量；选取40％、50％、60％、70％、80％和90％作为料水比(固体原料重量∶水体积)，测定不同料水比下固态饲料发酵后小肽含量；选取2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％和15％作为接种量(体积∶重量)，测定不同接种量下的发酵饲料中小肽含量。由表5确定最佳发酵温度为36℃、最佳料水比为60％、复合益生菌剂最佳接种量为10％。
表5饲料固态发酵接种量、温度和料水比的优化
Figure BDA0003384724440000101
实施例6复合益生菌剂发酵饲料的粗蛋白、干物资和总酸含量测定
饲料中粗蛋白的测定采用GB/T 6432-1994凯氏定氮的方法。CK为空发酵(不接菌剂相同含水量处理)。表6结果表明，与对照相比，复合益生菌剂处理的玉米胚芽粕粗蛋白含量显著增加14.0％(P<0.05)
饲料中干物质的测定采用GB/T 6435-2014饲料中水分的测定方法稍加修改。表6结果表明，与对照相比，复合益生菌剂处理的玉米胚芽粕干物质含量增加 2.73％
饲料中总酸的测定在GB/T12456-2008的基础上加以改进，采用酸碱滴定的指示剂法对饲料中总酸进行测定。表6结果表明，与对照相比，复合益生菌剂处理的玉米胚芽粕总酸含量显著增加73.4％(P<0.05)
表6复合益生菌剂对饲料粗蛋白、干物质和总酸量的影响
Figure BDA0003384724440000102
Figure BDA0003384724440000111
实施例7复合益生菌剂发酵饲料的小肽和干物质回收率测定
小肽含量是衡量益生菌发酵饲料效果的一个重要指标，微生物发酵会将大分子蛋白分解成利于动物吸收的小分子蛋白也就是常说的小肽和游离氨基酸，因此小肽是评价微生物发酵的一个重要指标。这里将实施例4中的复合益生菌发酵液按10％的接种量(体积∶重量)接种到玉米胚芽粕中，并调节含水量至50％， 35℃静置发酵72小时。改进GB/T 6432-1994的方法，利用三氯乙酸作为蛋白质沉淀剂将发酵过程中的大分子蛋白和长链肽沉淀，并将其中的短链肽和游离氨基酸沉淀出来，经过滤离心，消化，蒸馏测定其蛋白质含量。表7结果表明，与对照相比，复合益生菌剂的玉米胚芽粕小肽含量显著增加49％(P<0.05)，复合益生菌剂产蛋白酶良好。
干物质回收率是评价饲料营养物资损失情乱的重要指标，一般干物质回收率越高表明饲料营养成分损失越少。将实施例4中的复合益生菌发酵液按10％的接种量接种到玉米胚芽粕中，并调节含水量至50％，35℃静至发酵72小时。干物质回收率/％＝发酵后饲料干物质/发酵前饲料干物质×100。与对照组相比干物质回收率提高6.52％，复合菌剂处理组干物质回收率大于98％，营养损失较少，符合饲料行业标准(干物质回收率：90％-100％)。
表7复合益生菌剂对饲料小肽含量的影响
Figure BDA0003384724440000112
实施例8复合益生菌剂发酵玉米胚芽粕的微生物含量测定
微生物含量测定参考GB/T13093-91方法进行测定，准确称取发酵饲料10g 于三角瓶中，倒入90mL无菌水，放于恒温摇床35℃，180r/min，摇动30min 后稀释适当质量浓度，分别吸取上清液100μl于灭菌的MRS、LB和麦芽汁琼脂培养基中涂布混匀。放于37℃恒温培养箱培养24h后，进行菌落计数。如表 8所示，经菌落计数，三株菌活菌数均达到1亿CFU/ml，其中Bacillus subtilis Y11和Saccharomyces cerevisiae J13活菌数较高分别为8.16×1010CFU/ml和 2.86×1010CFU/ml，粪肠球菌活菌数相对低点为2.77×109CFU/ml。复合菌群在饲料中能保持良好生长。
表8饲料中微生物含量测定
Figure BDA0003384724440000121
实施例9发酵饲料感官评定
饲料的感官评定结果直接影响到饲料发酵效果的好坏。试验的感官评定由7 个人合作完成，以确保试验结果的准确性。发酵感官评定参考DLG感官评定标准，CK为原料，处理组A为不接菌剂的空发酵，处理组B为接菌剂处理的发酵。结果见表9，不同处理之间具有不同的感官评定结果。未发酵饲料质地一般、颜色为淡黄色且无酸味，发酵后的饲料质地良好、颜色为金黄色且有酸味和酒香味。从感官评定结果来看，接菌剂处理发酵品质最好综合评分最高为17.85分，质地良好，颜色为金黄色，具有强酸味。肉眼观察到发酵后饲料袋膨胀，产生大量的气体，该气体应该是复合益生菌固体厌氧发酵过程中产生的气体。
表9饲料感官评定结果
Figure BDA0003384724440000122

Claims (10)

1.用于制备复合益生菌菌剂的微生物组合物，其特征在于由酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)J13、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)R12和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Y11组成；其中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)J13保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCC M 20211145；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)R12保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCC M20211146；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y11保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCC M 20211147。
2.权利要求1所述的微生物组合物在饲料固态发酵中的应用。
3.权利要求1所述的微生物组合物在制备混合益生菌菌剂中的应用。
4.一种混合益生菌菌剂，其特征在于将权利要求1所述的三种微生物种子液接种到混菌培养基YP中培养至稳定期得所述的混合益生菌菌剂；所述的混菌培养基YP由每1000ml水中添加如下重量体积百分比组分：糖蜜1-2％、蛋白胨1.5-2％、七水合硫酸镁0.02-0.025％、磷酸氢二钾0.1-0.5％、无水乙酸钠0.1-0.6％、一水合硫酸锰0.005-0.01％，最后调节pH至6.0-6.5即得。
5.根据权利要求4所述的混合益生菌菌剂，其特征在于混合益生菌菌剂中枯草芽孢杆菌Y11、粪肠球菌R12和酿酒酵母J13活菌数均达到1亿CFU/ml以上。
6.权利要求4-5中任一项所述的一种混合益生菌菌剂的制备方法，其特征在于将权利要求1所述的三种微生物种子液接种到混菌培养基YP中培养至稳定期即得所述的混合益生菌菌剂；培养条件为pH为6.0-6.5、最适温度为35-37℃、最适转速为180-220r/min。
7.权利要求4所述的复合益生菌菌剂在饲料固态发酵中的应用。
8.权利要求4所述的益生菌菌剂用于饲料固态发酵方法，其特征在于复合益生菌剂最佳接种量为10％，最佳发酵温度为36℃、最佳料水比为60％，发酵时间3天。
9.权利要求4所述的混合益生菌菌剂在提高饲料粗蛋白、小肽及有机酸含量的应用。
10.权利要求4所述的混合益生菌菌剂在改善饲料口感、提升饲料品质中的应用。
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