CN105985916A - 一种复合微生物制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。由以下重量份的原料组成：粪肠球菌菌粉0.1~15份、酿酒酵母菌粉0.1~15份、枯草芽孢杆菌菌粉0.1~10份、酵母多糖0.1份、玉米淀粉59.9~74.9份。相对于现有技术，本发明将粪肠球菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌进行有机组合，充分发挥各菌种的优势，能够适应不同宿主和多种条件，具有部分甚至完全替代抗生素、调整胃肠道生态平衡、促进生长、提高饲料转化率及增强免疫力等多种功能，可改善动物肠道微生物环境，抑制有害菌生长，促进有益菌增殖；提高动物免疫力，增强抗病能力；为动物提供营养物质，提高饲料利用率，促进动物生长。
Description
技术领域
本发明属于微生物饲料技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其制备方法。
背景技术
抗生素作为药物或饲料添加剂，大大推动了畜牧业的发展，但抗生素大规模使用于畜牧业，特别是作为饲料添加剂，其种种弊端越来越明显，具有药物残留、出现耐药菌株、破坏动物肠道正常菌群等缺点。为克服抗生素的弊端，世界各国加强了新型绿色饲料添加剂的研究和应用，特别是微生物饲料添加剂受到了人们的重视，快速发展起来。
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是革兰氏阳性菌，1994年出版的《伯杰氏细菌鉴定手册》将该菌列为肠球菌属。粪肠球菌存在于人和大多数动物的肠道内，是人体肠道内的重要菌群，能耐受胃酸和胆汁酸。粪肠球菌作为微生物制剂，可以对宿主胃肠道进行微生态调节，增强动物免疫力。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）属于真菌，兼性厌氧的一类微生物。酵母菌在人或动物胃肠道中所占比例较小，但其有丰富的营养物质。酵母菌菌体蛋白占干物质的32%~75%，酵母细胞中含有20多种氨基酸，4.5%~8.5%的核糖核酸，和多种维生素，其中B族维生素含量极其丰富。酵母细胞壁主要成分有甘露寡糖(6.6%)、β-葡聚糖(57%)、糖蛋白22%，还有少量的其他蛋白质、几丁质、脂类和灰分等。酵母菌细胞内还有丰富的酶类，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、植酸酶、葡聚糖酶、几丁质酶等。酿酒酵母作为微生物制剂，可以为宿主提供营养物质，促进有益菌的增殖，调节肠道微生态平衡，提供动物消化能力，促进动物的生长。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）属于芽孢杆菌类有益菌，具有其它益生菌没有的特点，（1）当芽孢杆菌以芽孢的形式存在时，进入人或动物胃肠道时可以耐受胃酸和胆盐，且保持高活性；（2）由于芽孢的存在可以耐受100 ℃的高温，在生产制剂制粒的过程中损失率比较小，活性高，保存时间长；（3）芽孢杆菌类可以产生活性很强的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等多种酶类物质，还可以产生某些小环肽类细菌素或者一些多肽类物质，其对肠道中的致病菌均有拮抗作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是抗生素作为药物或饲料添加剂，具有药物残留、出现耐药菌株、破坏动物肠道正常菌群等缺点，为解决上述问题，本发明提供一种复合微生物制剂及其制备方法。
本发明的目的是以下述方式实现的：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
由以下重量份的原料组成：粪肠球菌菌粉0.1~15份、酿酒酵母菌粉0.1~15份、枯草芽孢杆菌菌粉0.1~10份、酵母多糖0.1份、玉米淀粉59.9~74.9份。
具体步骤如下：
（1）粪肠球菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37℃下培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2.0
g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2
g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠2.0
g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.1±0.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37℃下静置培养18-20 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30~34 g/L，酵母粉9.0~11 g/L，葡萄糖26~30
g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸钙10 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.1±0.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为液体发酵培养基；
e. 液体发酵：按照2.5~5.0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为34~37
℃，振荡速度为120~150 r/min的条件下发酵12~14 h，即得到粪肠球菌发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20~40的比例混合，得到粪肠球菌菌粉，其活菌数在2.0×1010
cfu/g以上；
（2）酿酒酵母菌种培养：
a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0±0.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养22~24 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110~120 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨28~32 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO4
1.0 g/L、K2HPO4 10 g/L、MgSO4 1.0 g/L、NaCl
1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0±0.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培养基；
e. 液体发酵：按照5.0%~10%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为27~30
℃，振荡速度为180~200 r/min下发酵16~18 h，即得到酿酒酵母发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5~10的比例混合，得到酿酒酵母菌粉，其活菌数在1.0×1010
cfu/g以上；
（3）枯草芽孢杆菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 ℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.0±0.2，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养18~24 h，即得一级种子液；
d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80.5~85.5份，玉米粉10~15份，葡萄糖0.5份，蛋白胨2份，NaCl 0.5份，硫酸锰0.5份，硫酸镁0.5份，碳酸钙0.5份，料水比1:0.8，121 ℃灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养；
e. 发酵：以2.5%~5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封口，35~38℃下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次；
f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2.0×1010 cfu/g，芽孢数达1.4×1010 cfu/g；
（4）将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
相对于现有技术，本发明将粪肠球菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌进行有机组合，充分发挥各菌种的优势，能够适应不同宿主和多种条件，具有部分甚至完全替代抗生素、调整胃肠道生态平衡、促进生长、提高饲料转化率及增强免疫力等多种功能，可改善动物肠道微生物环境，抑制有害菌生长，促进有益菌增殖；提高动物免疫力，增强抗病能力；为动物提供营养物质，提高饲料利用率，促进动物生长。
本发明所使用的菌种粪肠球菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌均为从健康猪肠道中自主分离、筛选，具有优良益生特性和发酵特性，功能明确，功效明显，稳定性好。所用菌种均为农业部《饲料添加剂品种目录》所列菌种，可安全用于畜禽、水产动物。
具体实施方式
实施例1：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
由以下重量份的原料组成：粪肠球菌菌粉0.1~15份、酿酒酵母菌粉0.1~15份、枯草芽孢杆菌菌粉0.1~10份、酵母多糖0.1份、玉米淀粉59.9~74.9份。
具体步骤如下：
（1）粪肠球菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37℃下培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2.0
g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2
g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠2.0
g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.1±0.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37℃下静置培养18-20 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30~34 g/L，酵母粉9.0~11 g/L，葡萄糖26~30
g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸钙10 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.1±0.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为液体发酵培养基；
e. 液体发酵：按照2.5~5.0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为34~37
℃，振荡速度为120~150 r/min的条件下发酵12~14 h，即得到粪肠球菌发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20~40的比例混合，得到粪肠球菌菌粉，其活菌数在2.0×1010
cfu/g以上；
（2）酿酒酵母菌种培养：
a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0±0.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养22~24 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110~120 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨28~32 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO4
1.0 g/L、K2HPO4 10 g/L、MgSO4 1.0 g/L、NaCl
1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0±0.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培养基；
e. 液体发酵：按照5.0%~10%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为27~30
℃，振荡速度为180~200 r/min下发酵16~18 h，即得到酿酒酵母发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5~10的比例混合，得到酿酒酵母菌粉，其活菌数在1.0×1010
cfu/g以上；
（3）枯草芽孢杆菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 ℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.0±0.2，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养18~24 h，即得一级种子液；
d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80.5~85.5份，玉米粉10~15份，葡萄糖0.5份，蛋白胨2份，NaCl 0.5份，硫酸锰0.5份，硫酸镁0.5份，碳酸钙0.5份，料水比1:0.8，121 ℃灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养；
e. 发酵：以2.5%~5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封口，35~38℃下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次；
f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2.0×1010 cfu/g，芽孢数达1.4×1010 cfu/g；
（4）将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
实施例2：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
具体步骤如下：
（1）粪肠球菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37℃下培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2.0
g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2
g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠2.0
g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.0，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37℃下静置培养18 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30 g/L，酵母粉9.0 g/L，葡萄糖26 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0
g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05
g/L，碳酸钙10 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.0，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为液体发酵培养基；
e. 液体发酵：按照2.5%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为34 ℃，振荡速度为120 r/min的条件下发酵12 h，即得到粪肠球菌发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20的比例混合，得到粪肠球菌菌粉，其活菌数在2.0×1010
cfu/g以上；
（2）酿酒酵母菌种培养：
a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至5.9，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养22 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨28 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO4
1.0 g/L、K2HPO4 10 g/L、MgSO4 1.0 g/L、NaCl 1.0
g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至5.9，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培养基；
e. 液体发酵：按照5.0%~10%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为27 ℃，振荡速度为180 r/min下发酵16 h，即得到酿酒酵母发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5的比例混合，得到酿酒酵母菌粉，其活菌数在1.0×1010
cfu/g以上；
（3）将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉0.1kg、酿酒酵母菌粉0.1 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉59.9 kg。
实施例3：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
具体步骤如下：
（1）粪肠球菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37℃下培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2.0
g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2
g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠2.0
g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37℃下静置培养19 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨32 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖28 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0
g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05
g/L，碳酸钙10 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为液体发酵培养基；
e. 液体发酵：按照4.0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为36 ℃，振荡速度为135 r/min的条件下发酵13 h，即得到粪肠球菌发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:30的比例混合，得到粪肠球菌菌粉，其活菌数在2.0×1010
cfu/g以上；
（2）酿酒酵母菌种培养：
a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养23 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖115 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨30 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO4
1.0 g/L、K2HPO4 10 g/L、MgSO4 1.0 g/L、NaCl
1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培养基；
e. 液体发酵：按照7.5%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为28℃，振荡速度为190 r/min下发酵16 h，即得到酿酒酵母发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:7.5的比例混合，得到酿酒酵母菌粉，其活菌数在1.0×1010
cfu/g以上；
（3）将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉3kg、酿酒酵母菌粉3 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉63 kg。
实施例4：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
具体步骤如下：
（1）粪肠球菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37℃下培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2.0
g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2
g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠2.0
g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.2，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37℃下静置培养20 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨34 g/L，酵母粉11 g/L，葡萄糖30 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0
g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05
g/L，碳酸钙10 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.2，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为液体发酵培养基；
e. 液体发酵：按照5.0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为37 ℃，振荡速度为150 r/min的条件下发酵14 h，即得到粪肠球菌发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:40的比例混合，得到粪肠球菌菌粉，其活菌数在2.0×1010
cfu/g以上；
（2）酿酒酵母菌种培养：
a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养24 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖120 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨32 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO4
1.0 g/L、K2HPO4 10 g/L、MgSO4 1.0 g/L、NaCl
1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培养基；
e. 液体发酵：按照10%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为30 ℃，振荡速度为200 r/min下发酵18 h，即得到酿酒酵母发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:10的比例混合，得到酿酒酵母菌粉，其活菌数在1.0×1010
cfu/g以上；
（3）将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉6kg、酿酒酵母菌粉6 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉66 kg。
实施例5：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉9kg、酿酒酵母菌粉9 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉69 kg。
其他同实施例2。
实施例6：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉12kg、酿酒酵母菌粉12 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉72 kg。
其他同实施例2。
实施例7：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉15kg、酿酒酵母菌粉15kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉74.9 kg。
其他同实施例2。
实施例8：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
具体步骤如下：
（1）粪肠球菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37℃下培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2.0
g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2
g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠2.0
g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.0，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37℃下静置培养18 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30 g/L，酵母粉9.0g/L，葡萄糖26 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0
g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05
g/L，碳酸钙10 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.0，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为液体发酵培养基；
e. 液体发酵：按照2.5%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为34 ℃，振荡速度为120 r/min的条件下发酵12 h，即得到粪肠球菌发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20的比例混合，得到粪肠球菌菌粉，其活菌数在2.0×1010
cfu/g以上；
（2）枯草芽孢杆菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 ℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.8，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养18 h，即得一级种子液；
d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80.5kg，玉米粉10 kg，葡萄糖0.5 kg，蛋白胨2 kg，NaCl 0.5 kg，硫酸锰0.5 kg，硫酸镁0.5 kg，碳酸钙0.5 kg，料水比1:0.8，121 ℃灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养；
e. 发酵：以2.5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封口，35℃下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次；
f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2.0×1010 cfu/g，芽孢数达1.4×1010 cfu/g；
（3）将粪肠球菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉0.1
kg、枯草芽孢杆菌菌粉0.1 kg、酵母多糖0.1
kg、玉米淀粉59.9 kg。
实施例9：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
具体步骤如下：
（1）粪肠球菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37℃下培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2.0
g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2
g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠2.0
g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37℃下静置培养19 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨32 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖28 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0
g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05
g/L，碳酸钙10 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为液体发酵培养基；
e. 液体发酵：按照4%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为35 ℃，振荡速度为135 r/min的条件下发酵13 h，即得到粪肠球菌发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:30的比例混合，得到粪肠球菌菌粉，其活菌数在2.0×1010
cfu/g以上；
（2）枯草芽孢杆菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 ℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.0，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养21 h，即得一级种子液；
d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮83kg，玉米粉12 kg，葡萄糖0.5 kg，蛋白胨2 kg，NaCl 0.5 kg，硫酸锰0.5 kg，硫酸镁0.5 kg，碳酸钙0.5 kg，料水比1:0.8，121 ℃灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养；
e. 发酵：以4%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封口，36℃下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次；
f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2.0×1010 cfu/g，芽孢数达1.4×1010 cfu/g；
（3）将粪肠球菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉3 kg、枯草芽孢杆菌菌粉2 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉63 kg。
实施例10：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
具体步骤如下：
（1）粪肠球菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37℃下培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2.0
g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2
g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠2.0
g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.2，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37℃下静置培养20 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨34 g/L，酵母粉11 g/L，葡萄糖30 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0
g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05
g/L，碳酸钙10 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.2，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为液体发酵培养基；
e. 液体发酵：按照5.0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为37 ℃，振荡速度为150 r/min的条件下发酵14 h，即得到粪肠球菌发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:40的比例混合，得到粪肠球菌菌粉，其活菌数在2.0×1010
cfu/g以上；
（2）枯草芽孢杆菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 ℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.2，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养24 h，即得一级种子液；
d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮85.5 kg，玉米粉15 kg，葡萄糖0.5 kg，蛋白胨2 kg，NaCl 0.5 kg，硫酸锰0.5 kg，硫酸镁0.5 kg，碳酸钙0.5 kg，料水比1:0.8，121 ℃灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养；
e. 发酵：以5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封口，38℃下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次；
f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2.0×1010 cfu/g，芽孢数达1.4×1010 cfu/g；
（3）将粪肠球菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉6 kg、枯草芽孢杆菌菌粉4kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉66 kg。
实施例11：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉9 kg、枯草芽孢杆菌菌粉6kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉69 kg。
其他同实施例8。
实施例12：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉12 kg、枯草芽孢杆菌菌粉8kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉72 kg。
其他同实施例8。
实施例13：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（3）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉15 kg、枯草芽孢杆菌菌粉10kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉74.9 kg。
其他同实施例8。
实施例14：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
具体步骤如下：
（1）酿酒酵母菌种培养：
a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至5.9，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养22 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨28 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO4
1.0 g/L、K2HPO4 10 g/L、MgSO4 1.0 g/L、NaCl
1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至5.9，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培养基；
e. 液体发酵：按照5.0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为27 ℃，振荡速度为180 r/min下发酵16 h，即得到酿酒酵母发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5的比例混合，得到酿酒酵母菌粉，其活菌数在1.0×1010
cfu/g以上；
（2）枯草芽孢杆菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 ℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.8，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养18 h，即得一级种子液；
d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80.5kg，玉米粉10 kg，葡萄糖0.5 kg，蛋白胨2份，NaCl 0.5 kg，硫酸锰0.5 kg，硫酸镁0.5 kg，碳酸钙0.5 kg，料水比1:0.8，121 ℃灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养；
e. 发酵：以2.5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封口，35℃下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次；
f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2.0×1010 cfu/g，芽孢数达1.4×1010 cfu/g；
（3）将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
步骤（3）中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉0.1
kg、枯草芽孢杆菌菌粉0.1 kg、酵母多糖0.1
kg、玉米淀粉59.9 kg。
实施例15：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
具体步骤如下：
（1）酿酒酵母菌种培养：
a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养23 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖115 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨30 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO4
1.0 g/L、K2HPO4 10 g/L、MgSO4 1.0 g/L、NaCl
1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培养基；
e. 液体发酵：按照7.5%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为28 ℃，振荡速度为190 r/min下发酵17 h，即得到酿酒酵母发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:7.5的比例混合，得到酿酒酵母菌粉，其活菌数在1.0×1010
cfu/g以上；
（2）枯草芽孢杆菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 ℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.0，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养21 h，即得一级种子液；
d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮83kg，玉米粉12 kg，葡萄糖0.5 kg，蛋白胨2 kg，NaCl 0.5 kg，硫酸锰0.5 kg，硫酸镁0.5 kg，碳酸钙0.5 kg，料水比1:0.8，121 ℃灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养；
e. 发酵：以4%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封口，37℃下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次；
f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2.0×1010 cfu/g，芽孢数达1.4×1010 cfu/g；
（3）将酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
步骤（3）中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉3kg、枯草芽孢杆菌菌粉2 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉63 kg。
实施例16：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
具体步骤如下：
（1）酿酒酵母菌种培养：
a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养24 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖120 g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨32 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO4
1.0 g/L、K2HPO4 10 g/L、MgSO4 1.0 g/L、NaCl
1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培养基；
e. 液体发酵：按照10%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为30 ℃，振荡速度为200 r/min下发酵18 h，即得到酿酒酵母发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:10的比例混合，得到酿酒酵母菌粉，其活菌数在1.0×1010
cfu/g以上；
（2）枯草芽孢杆菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 ℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.2，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养24 h，即得一级种子液；
d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮85.5 kg，玉米粉15 kg，葡萄糖0.5 kg，蛋白胨2 kg，NaCl 0.5 kg，硫酸锰0.5 kg，硫酸镁0.5 kg，碳酸钙0.5 kg，料水比1:0.8，121 ℃灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养；
e. 发酵：以5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封口，38℃下静置发酵48 h，每12 h翻匀一次；
f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2.0×1010 cfu/g，芽孢数达1.4×1010 cfu/g；
（3）将酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
步骤（3）中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉6 kg、枯草芽孢杆菌菌粉4 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉66 kg。
实施例17：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（3）中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉9 kg、枯草芽孢杆菌菌粉6 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉69 kg。
其他同实施例14。
实施例18：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（3）中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉12 kg、枯草芽孢杆菌菌粉8 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉72 kg。
其他同实施例14。
实施例19：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（3）中各组分的重量份数为：酿酒酵母菌粉15 kg、枯草芽孢杆菌菌粉10 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉74.9 kg。
其他同实施例14。
实施例20：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（4）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉0.1
kg、酿酒酵母菌粉0.1 kg、枯草芽孢杆菌菌粉0.1
kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉59.9
kg。
其他同实施例1。
实施例21：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（4）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉3 kg、酿酒酵母菌粉3 kg、枯草芽孢杆菌菌粉2 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉63 kg。
其他同实施例1。
实施例22：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（4）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉6 kg、酿酒酵母菌粉6 kg、枯草芽孢杆菌菌粉4 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉66 kg。
其他同实施例1。
实施例23：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（4）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉9 kg、酿酒酵母菌粉9 kg、枯草芽孢杆菌菌粉6 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉69 kg。
其他同实施例1。
实施例24：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（4）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉12 kg、酿酒酵母菌粉12 kg、枯草芽孢杆菌菌粉8 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉72 kg。
其他同实施例1。
实施例25：
一种复合微生物制剂，包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
步骤（4）中各组分的重量份数为：粪肠球菌菌粉15 kg、酿酒酵母菌粉15 kg、枯草芽孢杆菌菌粉10 kg、酵母多糖0.1 kg、玉米淀粉74.9 kg。
其他同实施例1。
临床试验
试验例1：复合微生物制剂在肉鸡中的应用
本次试验的复合微生物制剂为实施例7制备的产品，选用1日龄健康肉鸡雏3000只，随机分为3组，每组1000只。对照组为日粮中不添加任何添加剂；试验组为全程日粮中添加0.1%微生物制剂，饲用管理和饲料变更均相同。于28日龄时，每组随机抽取体重相近的鸡8只（每组重复4只），空腹称个体体重后屠宰，摘取胸腺、脾脏和法氏囊，剔除脂肪后称鲜重。计算胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数，免疫器官指数以免疫器官鲜重(g)占每l kg体重的此例表示，即：免疫器官指数=免疫器官质量÷体重×100%。于42日龄称重、结料，计算日采食量、日增重和饲料转化率；记录全期试验鸡只死亡情况。
如表1和表2所示，试验结果表明，试验组肉鸡的日增重和日采食量高于对照组肉鸡，而料肉比较低；试验组的肉鸡死亡率也低于对照组肉鸡；在免疫器官指数方面，对照组肉鸡的脾脏指数、法氏囊指数和胸腺指数均高于对照组肉鸡。说明复合微生物制剂可改善肉鸡肠道微生态平衡，促进有益菌的增殖，增强了肉鸡的抗病能力，提高饲料利用率，降低料肉比。
表1 复合微生物制剂对肉鸡生长性能的影响
表2 复合微生物制剂对肉鸡免疫器官指数的影响
试验例2：复合微生物制剂在猪中的应用
本次试验的复合微生物制剂为实施例25制备的产品，选用50日龄体重相近、健康的杜-长-大三元杂种猪100头，随机分为2组，每组50头。对照组为日粮中不添加任何添加剂；试验组为日粮中添加0.1%的复合微生物制剂。分别在65、80、95日龄时采血，测定血清中的IgA、IgG和外周淋巴细胞变化情况。
如表3所示，试验表明，试验组猪血清中IgA、IgG及T淋巴细胞OD值均均高于对照组，说明复合微生物制剂可以提高猪的免疫力，原因在于复合微生物制剂中的益生菌在猪肠道内增殖并产生细菌素等有益物质，改善肠道内微生态平衡，抑制了病原菌的生长，从而增强猪的免疫能力。
表3 复合微生物制剂对猪免疫性能的影响
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种复合微生物制剂，其特征在于：包括以下活性组分：粪肠球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的至少两种，以及酵母多糖和玉米淀粉。
2.根据权利要求1所述的一种复合微生物制剂，其特征在于：由以下重量份的原料组成：粪肠球菌菌粉0.1~15份、酿酒酵母菌粉0.1~15份、枯草芽孢杆菌菌粉0.1~10份、酵母多糖0.1份、玉米淀粉59.9~74.9份。
3.根据权利要求1或2所述的一种复合微生物制剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）粪肠球菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，37℃下培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：蛋白胨20 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，乙酸钠2.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调pH至7.1±0.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，37℃下静置培养18-20 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：蛋白胨30~34
g/L，酵母粉9.0~11 g/L，葡萄糖26~30 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，柠檬酸三铵2.0
g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸钙10 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.1±0.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为液体发酵培养基；
e. 液体发酵：按照2.5~5.0%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为34~37 ℃，振荡速度为120~150 r/min的条件下发酵12~14 h，即得到粪肠球菌发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:20~40的比例混合，得到粪肠球菌菌粉，其活菌数在2.0×1010 cfu/g以上；
（2）酿酒酵母菌种培养：
a. 将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，30℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0±0.1，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为30℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养22~24 h，即得一级种子液；
d. 制备液体发酵培养基：培养基的组分包括：葡萄糖110~120
g/L、红砂糖20 g/L、蛋白胨28~32 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、K2HPO4 10 g/L、MgSO4
1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L，用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至6.0±0.1，121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，即为发酵培养基；
e. 液体发酵：按照5.0%~10%的接种量，将一级种子液接种至液体发酵培养基中，在温度为27~30 ℃，振荡速度为180~200 r/min下发酵16~18 h，即得到酿酒酵母发酵液；
f. 将发酵液离心，弃上清液，将沉淀与玉米淀粉按1:5~10的比例混合，得到酿酒酵母菌粉，其活菌数在1.0×1010 cfu/g以上；
（3）枯草芽孢杆菌菌种培养：
a. 菌种活化：将甘油冷冻保存的菌种在斜面培养基上活化，34 ℃培养24 h；
b. 制备种子培养基：培养基的组分包括：葡萄糖10
g/L，蛋白胨1.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L；用氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至7.0±0.2，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却后，即可作为一级种子培养基；
c. 制备一级种子液：用接种环挑取活化的菌种接种于种子培养基中，在温度为35℃，振荡速度为150 r/min的条件下培养18~24 h，即得一级种子液；
d. 制备固体发酵培养基：培养基的组分包括：麸皮80.5~85.5份，玉米粉10~15份，葡萄糖0.5份，蛋白胨2份，NaCl 0.5份，硫酸锰0.5份，硫酸镁0.5份，碳酸钙0.5份，料水比1:0.8，121 ℃灭菌25 min，待培养基冷却后，即可作为固体发酵培养；
e. 发酵：以2.5%~5%的接种量，将一级种子液接种至固体培养基中，搅拌均匀，用8层纱布封口，35~38℃下静置发酵48
h，每12 h翻匀一次；
f. 将固体发酵物经烘干干燥，粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉，其活菌数达2.0×1010 cfu/g，芽孢数达1.4×1010 cfu/g；
（4）将粪肠球菌菌粉、酿酒酵母菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酵母多糖和玉米淀粉混合均匀，即为复合微生物制剂。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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