CN114107432B - 枯草芽孢杆菌活菌计数培养基、稀释液及活菌计数方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物菌种技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌活菌计数培养基、灭菌稀释液及活菌计数方法。其中，固体培养基配方：去皮豆粕粉（粉碎过100目）4‑6g，玉米粉（粉碎过100目）3‑5g，氯化钠5‑10g，黄原胶3‑5g，琼脂11‑13g，蒸馏水1000mL，pH值为7.3±0.2；灭菌稀释液：氯化钠8‑9g，磷酸二氢钾1‑2g，无水葡萄糖0.3‑0.5g，蛋白胨0.3‑0.5g，消泡剂0.1‑0.2g，蒸馏水1000mL；而且采用先适温后降温的培养方式，降低了菌细胞抑菌物质的分泌，降低了菌落扩张的速度，减少菌细胞生长的竞争抑制。本发明的枯草芽孢杆菌活菌计数方法提高了稀释的准确率，降低了振荡稀释过程中菌细胞的死亡率，减少菌体细胞的聚集，控制菌落的蔓延，降低菌落的大小，提高了枯草芽孢杆菌活菌的计数准确性与重复性。

Description

枯草芽孢杆菌活菌计数培养基、稀释液及活菌计数方法

技术领域

本发明属于微生物菌种技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌活菌计数固体培养基、灭菌稀释液及活菌计数方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。

枯草芽孢杆菌在畜禽上的应用主要通过液体扩培后制作成添加剂使用，而活菌数又是衡量枯草芽孢杆菌活菌制剂的质量的一项重要指标，只有知道准确的活菌数才能更好调整其最适的添加量，保证其在畜禽上应用的益生保健效果。

活菌计数法又称间接计数法，直接计数法测定到的是死细胞、活细胞总数，而间接计数法测得的仅是活菌数，该方法所得的数值往往比直接计数法测得的数值小。活菌计数法一般有平板菌落计数、液体稀择最大或然数法（MPN）测数、薄膜过滤计数法等，其中平板菌落计数法是最为常用的计数方法。平板菌落计数是基于每一个分散的活细胞在适宜的培养基中具有生长繁殖并能形成一个菌落的能力，因此，菌落数就是待测样品所含的活菌数。将单细胞微生物待测液经10倍系列稀释后，将一定浓度的稀释液定量地接种到琼脂平板培养基上培养，长出的菌落数就是稀释液中含有的活细胞数，可以计算出供测样品中的活细胞数。但应注意，由于各种菌种特性、稀释操作、固体培养基或培养方式等原因，平板上的单个菌落可能并不是由一个菌体细胞形成的，有可能是由几个菌体细胞形成的，所以通过菌落计出来的活菌量都是比实际活菌量低的，因此在表达单位样品含菌数时，可用单位样品中形成菌落单位来表示，即CFU/mL或CFU/g。

目前，关于枯草芽孢杆菌活菌计数有两种方式，分别是活菌总数计数及芽孢个体计数，活菌总数包括营养体与芽孢体，芽孢个体计数需要对样品进行高温水浴处理，杀死不耐热的营养体，保留耐热的芽孢体。

由于相同的菌株在营养不同的培养基上会对应生成不同的菌落，菌落的大小、形状都会发生改变。因此，目前枯草芽孢杆菌在平板活菌计数方面存在诸多问题，如枯草芽孢菌液体扩培的发酵液黏性比较大，经常由于振荡稀释不充分，导致相邻梯度菌落个数严重偏离10倍关系，造成计数误差大；枯草芽孢杆菌不仅容易形成多个菌体细胞聚集的菌落，而且实际菌落比较大，单个平板能够容纳的菌落数也比较有限，也容易造成较大的误差；其次，枯草芽孢杆菌菌液或者菌粉在长时间剧烈振荡稀释过程中操作的手法差异也会造成不同程度死亡，这也势必影响检测的准确性。

现有常用于枯草芽孢杆菌计数的培养基，如NA培养基与LB培养基，适合大多数菌的培养，但针对性不强；也存在一些微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测（GB/T26428-2010）规定使用营养琼脂（NA）培养基（蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂16g，蒸馏水1000mL，pH 7.3±0.2），稀释液为0.85%的生理盐水，培养条件为37℃±1℃培养箱中培养48±2h。然其中采用了蛋白胨、牛肉膏等物质，容易造成枯草芽孢杆菌营养过剩，最终出现菌落大且易蔓延的问题。

刘宝生等（2011）对菌落高度黏连枯草芽孢杆菌进行活菌计数试验研究，对生理盐水、灭菌水、各种PBS空白培养基等不同稀释液进行比较研究，结果表明生理盐水、灭菌水、各种PBS均无法将菌团分散，难以形成有效的活菌计数梯度，只有以该菌株的空白培养基作为稀释液时才能使菌体分散均匀稀释梯度明显，使得计数结果准确，重复性好。王梅等（2020）研究通过对枯草芽孢杆菌活菌计数培养基进行优化，将牛肉粉改成牛肉膏，将琼脂粉由原来的1.5%调整为3.0%，使得计数菌落生长不蔓延、不黏连、生长独立，提高了计数的准确性及重复性。

然而，上述方法虽然能解决部分菌细胞集聚、计数菌落蔓延的问题，但均无法解决振荡稀释过程中泡沫多、菌细胞死亡率高及计数平板菌落过大等问题。基于以上问题，本发明开发了一种枯草芽孢杆菌活菌计数培养基、灭菌稀释液及活菌计数方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌活菌计数固体培养基、灭菌稀释液及活菌计数方法。本发明提供的枯草芽孢杆菌活菌计数方法不仅提高了稀释的准确率，降低了稀释过程中菌细胞的死亡率，同时还减少了菌体细胞的聚集，有效地控制了菌落的蔓延，降低了菌落的大小，而且还提高了枯草芽孢杆菌计数的准确性与重复性。

本发明的技术方案是：

一种枯草芽孢杆菌的计数方法，包括以下操作步骤：

S1：制备初始悬液：

以无菌操作称取试样25g(mL)，加入225mL灭菌稀释液，加入灭菌玻璃珠50粒，振荡30min，制成1:10的初始悬浮液；

S2：梯度稀释：

取9mL灭菌稀释液及10粒灭菌玻璃珠放入15mL容量的西林瓶中，并吸取步骤S1所得的初始悬浮液1mL于西林瓶中，经涡旋振荡器振荡20-30s，制成1:100的稀释液I，并根据样品的活菌数再进行十倍系列递增稀释至合适的稀释梯度10ⁿ，得稀释液；所述“n”为稀释次数，具体稀释次数根据活菌量而定。

S3：涂布平板培养：

将步骤S2所得的稀释度为10^n-2，10^n-1，10ⁿ的稀释液在80℃±1℃温度下进行水浴10 min，再使用无菌枪头吸取100 uL涂布于固体培养基，使用无菌涂布棒进行涂布，每个梯度涂布3个；

培养条件：先在36-40℃温度下培养6h，再将培养温度降低到28-32℃继续培养24h即可；

S4：计数：

培养后选取菌落数在30~300个之间的平板计数，若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。

进一步地，本发明还提供了一种如上述步骤S2中的灭菌稀释液，具体为氯化钠8-9g，磷酸二氢钾1-2g，无水葡萄糖0.3-0.5g，蛋白胨0.3-0.5g，消泡剂0.1-0.2g，蒸馏水1000mL。

更进一步地，所述步骤S2中的灭菌稀释液为氯化钠9g，磷酸二氢钾2g，无水葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，消泡剂0.2g，蒸馏水1000mL。

进一步地，所述灭菌稀释液中消泡剂为聚醚类消泡剂。

更进一步地，所述灭菌稀释液中聚醚类消泡剂优选为聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚。聚醚类消泡剂具有抑泡时间长、效果好、消泡速度快、热稳定性好等特点，其中抑泡是这类消泡剂最大的优点，在本发明中能很好抑制振荡过程中泡沫的产生。

进一步地，本发明还提供了一种如上述步骤S3中固体培养基配方，具体为去皮豆粕粉4-6g，玉米粉3-5g，氯化钠5-10g，黄原胶3-5g，琼脂11-13g，蒸馏水1000mL。

更进一步地，所述步骤S3中固体培养基配方为去皮豆粕粉4g，玉米粉3g，氯化钠5g，黄原胶3g，琼脂13g，蒸馏水1000mL。

进一步地，所述步骤S3中固体培养基的pH值为7.3±0.2。

进一步地，所述步骤S3中的培养条件为先在40℃温度下培养6h，再将培养温度降低到32℃继续培养24h。

现有技术中，通常采用生理盐水作为枯草芽孢杆菌活菌计数的灭菌稀释液，但在剧烈振荡稀释过程中枯草芽孢杆菌的死亡率较高，且菌细胞容易聚集，不易稀释打散，对于后续的培养计数造成很大的干扰。本发明所提供的灭菌稀释液中补充了微量的无水葡萄糖（碳源）与蛋白胨（氮源）两种营养物质，发现二者共同作用能够提高菌细胞抵抗剧烈振荡稀释应激的能力，降低菌细胞在剧烈振荡稀释过程中的死亡率；另外，经试验验证发现在灭菌稀释液中添加微量的无水葡萄糖与蛋白胨能够使得菌细胞均匀分散。但由于蛋白胨、葡萄糖等有机物的添加，使得体系在振荡过程中更容易形成泡沫，影响梯度稀释的准确性，而聚醚类消泡剂，尤其是聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚可以很好地抑制在菌细胞稀释振荡过程中形成大量的泡沫，从而保证稀释效果，提高计数准确率。此外，灭菌稀释液中补充氯化钠、磷酸二氢钾可以有效调节渗透压平衡，能有效降低菌细胞死亡率；而且磷酸二氢钾溶液呈弱酸性，其能酸化碱性的枯草芽孢杆菌样品，降低其黏稠性，使得菌细胞更容易分散，进一步提高了稀释的准确性。

微生物培养基是供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。虽然现有技术中已知去皮豆粕粉、玉米粉可以作为微生物生长的培养基原料，但是在活菌计数培养基上一直都是选择蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖等可溶性及枯草芽孢杆菌容易利用的精细原料作为营养成分，这类培养基营养丰富，适合大多数细菌的培养，然而枯草芽孢杆菌本身对营养需求并不高，而现有的枯草芽孢杆菌计数培养基会使枯草芽孢杆菌生长旺盛，菌落偏大且易蔓延，影响活菌计数结果，因此现有的枯草芽孢杆菌计数培养基并不具备针对性。而且，经试验研究发现，将去皮豆粕粉和玉米粉作为活菌计数培养基的原料时，其生物利用率较低，且易出现团聚、分层现象，从而不作为活菌计数培养基的原料组分。而本发明选择特定比例的黄原胶、去皮豆粕粉和玉米粉合理搭配解决了上述难题，组合出了符合枯草芽孢杆菌营养特性的固体培养基。

经试验验证发现，对于枯草芽孢杆菌产生的许多酶类，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶等都不能使黄原胶降解，因此特定比例的黄原胶的使用可以有效地抑制枯草芽孢杆菌菌落的蔓延，大幅提高计数的准确性。而且，发明人在研发过程中意外发现，一定浓度下的黄原胶溶胶分子能形成超结合带状的螺旋共聚体，构成脆弱的类似胶的网状结构，可以有效维持去皮豆粕粉、玉米粉固体颗粒的形态，显示出很强的乳化稳定作用和高悬浮能力，防止培养基配制过程中不溶颗粒豆粕粉、玉米粉的沉淀分层。此外，黄原胶与琼脂联用有协同作用，可以增加胶体的黏性与硬度，合理控制菌体对固体培养基中营养物质的利用。

而且，在培养方法上，本发明改变以往恒温的培养方式，选择先适温培养（指适宜生长温度，即36-40°），再降温培养（即28-32°），进一步解决了枯草芽孢杆菌计数上存在的缺陷。前期适温培养可以使振荡应激下的菌细胞顺利复苏，而后期降温培养可以有效地降低菌落扩张的速度，适当降低菌细胞的活性，减少抑菌物质的分泌，从而避免了活性高的菌细胞抑制活性低的菌细胞生长，从而提高了枯草芽孢杆菌活菌计数的准确性。

与现有技术相比，本发明提供的一种枯草芽孢杆菌的计数方法，具有以下优势：

（1）本发明使用去皮豆粕粉、玉米粉替代枯草芽孢杆菌NA计数培养基中的蛋白胨、牛肉粉（膏），营养需求上更具针对性，解决了NA培养基计数菌落大的问题，提高了计数准确性；使用黄原胶不仅能够协同琼脂增加胶体的黏性与硬度，而且还能合理控制菌体对固体培养基中营养物质的利用，抑制菌落的蔓延，从而提高计数的准确性。

（2）本发明的稀释液中添加了微量的碳源与氮源、磷酸二氢钾、消泡剂等，有效地降低了菌细胞在剧烈振荡稀释过程中的死亡率，减少了稀释振荡过程中泡沫的形成，提高了振荡的效果，从而提高了稀释效率及准确性。

（3）本发明选择先适温后降温的培养方式，降低了菌细胞抑菌物质的分泌，降低了菌落扩张的速度，减少菌细胞生长的竞争抑制，进一步解决了枯草芽孢杆菌计数培养上的缺陷，从而提高活菌计数的准确性。

附图说明

图1为实施例3的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸；

图2为实施例5的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸；

图3为对比例1的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸；

图4为对比例2的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸；

图5为对比例3的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸；

图6为对比例4的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸；

图7为对比例5的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸；

图8为对比例6的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸；

图9为对比例7的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸；

图10为对比例8的活菌计数菌落图，其中稀释梯度为1×10⁸。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。

其中，本发明所用枯草芽孢杆菌样品，够买自山东蔚蓝生物科技有限公司，商品名为源康宝500亿，产品代号为YKB-500，活菌数约为5.0×10¹⁰ CFU/g；其余试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。

实施例1、本发明枯草芽孢杆菌活菌计数固体培养基

本发明固体培养基（配方1）：去皮豆粕粉（粉碎过100目）4g，玉米粉（粉碎过100目）3g，氯化钠5g，黄原胶3g，琼脂13g，蒸馏水1000mL，pH值为7.3。

本发明固体培养基（配方2）：去皮豆粕粉（粉碎过100目）6g，玉米粉（粉碎过100目）5g，氯化钠10g，黄原胶5g，琼脂11g，蒸馏水1000mL，pH值为7.5。

实施例2、本发明枯草芽孢杆菌活菌计数灭菌稀释液

本发明灭菌稀释液（配方1）：氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，无水葡萄糖0.3g，蛋白胨0.3g，聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚消泡剂0.1g，蒸馏水1000mL。

本发明灭菌稀释液（配方2）：氯化钠9g，磷酸二氢钾2g，无水葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚消泡剂0.2g，蒸馏水1000mL。

实施例3、本发明枯草芽孢杆菌活菌计数方法

样品：枯草芽孢杆菌样品，活菌数约为5.0×10¹⁰ CFU/g。

S1：制备初始悬液：

以无菌操作称取试样25g，加入225mL灭菌稀释液，加入灭菌玻璃珠50粒，振荡30min，制成1:10的初始悬浮液。

S2：十倍梯度稀释：

准备15mL容量的西林瓶，往里面添加9mL灭菌稀释液及10粒灭菌玻璃珠，吸取步骤S1所得的初始悬浮液1mL于西林瓶中，经涡旋振荡器振荡20-30s，制成1:100的稀释液I，并将所得稀释液I再进行十倍系列递增稀释，分别梯度稀释至稀释度为10⁷，10⁸，10⁹；

S3：涂布平板培养：

将步骤S2所得的稀释度为10⁷，10⁸，10⁹的稀释液在80℃温度下进行水浴10 min，再使用无菌枪头吸取100 uL涂布于固体培养基，使用无菌涂布棒进行涂布，每个梯度涂布3个。

其中培养条件：先在36℃温度下培养6h，再将培养温度降低到28℃继续培养24h即可。

S4：计数：

培养后选取菌落数在30~300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。

所述固体培养基配方采用实施例1的配方一：去皮豆粕粉（粉碎过100目）4g，玉米粉（粉碎过100目）3g，氯化钠5g，黄原胶3g，琼脂13g，蒸馏水1000mL，pH值为7.3。

所述灭菌稀释液采用实施例2的配方一：氯化钠8g，磷酸二氢钾2g，无水葡萄糖0.3g，蛋白胨0.3g，聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚消泡剂0.1g，蒸馏水1000mL。

实施例4、本发明枯草芽孢杆菌活菌计数方法

所述实施例4的计数方法与实施例3类似，不同之处在于固体培养基配方，实施例4的固体培养基配方采用实施例1的配方二：去皮豆粕粉（粉碎过100目）6g，玉米粉（粉碎过100目）5g，氯化钠10g，黄原胶5g，琼脂11g，蒸馏水1000mL，pH值为7.5。

实施例5、本发明枯草芽孢杆菌活菌计数方法

所述实施例5的计数方法与实施例3类似，不同之处在于灭菌稀释液，实施例5的灭菌稀释液采用实施例2的配方二：氯化钠9g，磷酸二氢钾2g，无水葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚消泡剂0.2g，蒸馏水1000mL。

实施例6、本发明枯草芽孢杆菌活菌计数方法

所述实施例6的计数方法与实施例3类似，不同之处在于培养条件，实施例6的培养条件：先在40℃温度下培养6h，再将培养温度降低到32℃继续培养24h即可。

对比例1 一种枯草芽孢杆菌的计数方法

所述对比例1的计数方法与实施例5类似，不同之处在于灭菌稀释液中不含蛋白胨与葡萄糖，具体的灭菌稀释液配方：氯化钠9g，磷酸二氢钾2g，聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚消泡剂0.2g，蒸馏水1000mL。

对比例2 一种枯草芽孢杆菌的计数方法

所述对比例2的计数方法与实施例5类似，不同之处在于灭菌稀释液为传统灭菌稀释液，具体的灭菌稀释液配方：氯化钠8.5g，蒸馏水1000mL。

对比例3 一种枯草芽孢杆菌的计数方法

所述对比例3的计数方法与实施例5类似，不同之处在于灭菌稀释液选择的消泡剂为有机硅消泡剂（厂家：广东巴沃夫环保科技有限公司，型号：BWF-WB880），具体的灭菌稀释液：氯化钠9g，磷酸二氢钾2g，无水葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，有机硅消泡剂0.2g，蒸馏水1000mL。

对比例4 一种枯草芽孢杆菌的计数方法

所述对比例4的计数方法与实施例5类似，不同之处在于选择常规枯草芽孢杆菌计数培养基（NA），具体为营养琼脂（NA）培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂16g，蒸馏水1000mL，pH值为7.3。

对比例5 一种枯草芽孢杆菌的计数方法

所述对比例5的计数方法与实施例5类似，不同之处在于固体培养基中不含黄原胶。

对比例6 一种枯草芽孢杆菌的计数方法

所述对比例6的计数方法与实施例5类似，不同之处在于固体培养基中不含玉米粉。

对比例7 一种枯草芽孢杆菌的计数方法

所述对比例7的计数方法与实施例5类似，不同之处在于培养条件：直接在37℃温度条件下培养32h。

对比例8 一种枯草芽孢杆菌的计数方法

所述对比例8的计数方法与实施例5类似，不同之处在于固体培养基中为：增加豆粕粉至10g，增加玉米粉至6g，降低黄原胶至2g。

试验例一、计数

1、试验对象：根据实施例3~6和对比例1~8的计数方法所得的枯草芽孢杆菌的计数结果。

2、试验结果：

试验结果如表1示。

表1 实施例3~6和对比例1~8所得的枯草芽孢杆菌计数结果

由表1可知：实施例3组，实施例4组、实施例5组和实施例6组计数的菌落比较小，单块平板可容纳的菌数比较多，菌落蔓延数量少，梯度之间菌落数也更接近10倍关系，涂布平板间的重复性好，准确性比较高。而对比例组与实施例组的试验结果表明，本发明提供的固体培养基、灭菌稀释液，组分缺一不可，极大程度上降低了枯草芽孢杆菌细胞在剧烈振荡稀释过程中的死亡率，从而提高了稀释效率及准确性。

如图3所示：对比例1组在灭菌稀释液中不含蛋白胨与葡萄糖的情况下，稀释应激导致菌细胞活力低，总体活菌数也比实际值低。

如图4所示：对比例2组采用传统的0.85%氯化钠容易对活菌进行稀释造成菌体的应激死亡，应激后的菌细胞活力低，导致总体活菌数较实际值偏低。

如图5所示：对比例3组灭菌稀释液中添加蛋白胨、葡萄糖，却不添加消泡剂的情况，造成泡沫较多，梯度之间偏离10倍关系较远，平行平板之间的菌落数量波动也比较大，误差也比较大，活菌数也严重偏低。

如图6所示：对比例4组选择常规枯草芽孢杆菌计数培养基（NA），菌落比较大，导致培养基平板所容纳的菌落数偏少；另外，较多菌落出现蔓延情况，影响单个菌落个体的判定，进而影响最终计数的准确性。

如图7所示：对比例5组固体培养基中不含黄原胶，培养基中的难溶的去皮豆粕粉、玉米粉沉在培养基底部，导致较多菌落出现蔓延情况，影响单个菌落个体的判定，最终影响计数的准确性。

如图8所示：对比例6组固体培养基中不含玉米粉，不仅造成菌落极小，而且导致菌落数量极低，导致计数结果严重偏低。

如图9所示：对比例7组采用直接在37℃温度条件下培养32h的方式，导致菌体之间的竞争持续存在。在不降温的情况下，部分活力比较高的菌细胞生长过旺抑制其他菌生长，也导致菌落数比实际数量偏低，同样证明了本申请实施例采用中途降温培养的方式能够提高活菌计数的准确性。

如图10所示：对比例8组的培养基中去皮豆粕粉、玉米粉和黄原胶的质量比为5：3：1，在黄原胶比重偏低的情况下，固体培养基营养分布不均，导致菌落大小不一，活菌计数结果偏低。

综上所述，本发明提供的灭菌稀释液中聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚可以很好地抑制在菌细胞稀释振荡过程中形成大量的泡沫，从而保证稀释效果，提高菌细胞存活率，提高计数准确率。而本发明提供的固体培养基使用去皮豆粕粉、玉米粉替代枯草芽孢杆菌现有计数培养基中的蛋白胨、牛肉粉（膏），再搭配特定量地黄原胶共同作用，使得培养基不仅能够满足枯草芽孢杆菌的营养需求，还解决了固体培养基计数菌落大且易蔓延的问题，提高了计数准确性；而且使用黄原胶与琼脂联用有协同作用，增加胶体的黏性与硬度，可以合理控制菌体对固体培养基中营养物质的利用。

同时，在培养方法上，本发明改变以往恒温的培养方式，选择先适温培养，再降温培养，进一步解决了枯草芽孢杆菌计数上存在的缺陷，提高了枯草芽孢杆菌活菌计数的准确性。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌活菌计数方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：制备初始悬液：

以无菌操作称取试样，加入稀释液，加入灭菌玻璃珠，振荡，制成1:10的初始悬浮液；

S2：梯度稀释：

取所述稀释液及灭菌玻璃珠放入西林瓶中，并吸取步骤S1所得的初始悬浮液于西林瓶中，经涡旋振荡器振荡，制成1:100的稀释液I，再根据样品的活菌数再进行十倍系列递增稀释，得稀释液Ⅱ；

S3：涂布平板培养：

将步骤S2所得的稀释液Ⅱ在80℃±1℃温度下进行水浴，再使用无菌枪头吸取并涂布于固体培养基，使用无菌涂布棒进行涂布，每个梯度涂布3个；

培养条件：先在36-40℃温度下培养6h，再将培养温度降低到28-32℃继续培养24h；

S4：计数：

培养后选取菌落数在30个~300个之间的平板计数，若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数；

所述固体培养基由去皮豆粕粉4-6g，玉米粉3-5g，氯化钠5-10g，黄原胶3-5g，琼脂11-13g和蒸馏水1000mL组成；

所述稀释液为灭菌稀释液，由氯化钠8-9g，磷酸二氢钾1-2g，无水葡萄糖0.3-0.5g，蛋白胨0.3-0.5g，消泡剂0.1-0.2g和蒸馏水1000mL组成；

所述灭菌稀释液中消泡剂为聚醚类消泡剂。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌活菌计数方法，其特征在于，所述灭菌稀释液为氯化钠9g，磷酸二氢钾2g，无水葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，消泡剂0.2g，蒸馏水1000mL。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌活菌计数方法，其特征在于，所述消泡剂为聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚。

4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌活菌计数方法，其特征在于，所述固体培养基配方为去皮豆粕粉4g，玉米粉3g，氯化钠5g，黄原胶3g，琼脂13g，蒸馏水1000mL。

5.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌活菌计数方法，其特征在于，所述固体培养基的pH值为7.3±0.2。

6.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌活菌计数方法，其特征在于，所述步骤S3中的培养条件为先在40℃温度下培养6h，再将培养温度降低到32℃继续培养24h。

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