CN110079471A - 一株具有促生作用的氢氧化细菌a06及其分离方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有促生作用的争论贪噬菌，其分类命名为争论贪噬菌A06(Variovorax paradoxus A06)，已于2018年10月22日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2018696。本发明以豆科根际土壤为研究对象，利用持续通氢装置对氢氧化细菌进行分离培养；通过对氢氧化细菌的形态观察、生理生化及16SrDNA鉴定确定其分类地位，利用气相色谱检测菌株氧化氢能力。本发明菌株对小麦和玉米具有促生作用，该生物制剂用于农业生产可以促进植物生长，提高产量、肥效和植物的抗逆能力。

Description

一株具有促生作用的氢氧化细菌A06及其分离方法和应用
技术领域
本发明涉及一株从不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出的氢氧化细菌争论贪噬菌属(Variovorax paradoxus) A06及其微生物菌剂。该氢氧化细菌A06菌株于2018年10月22号保藏于武汉大学中国典型培养物中心，保藏编号为CCTCC M 2018696。该菌能够促进植物生长，属于微生物技术领域。
背景技术
城市化的发展，经济的快速增长，人口的急剧膨胀和耕地面积的迅速减少，使得农业生产面临着巨大的压力。为了维持农业产量的增长，化肥被大量地方应用，以此来取得短期的效益。然而大量化肥的长期使用造成了土地的板结、退化，水系的污染，使得农业面临的困境进一步恶化。而传统的增产方式侧重于化肥的利用，这样不仅会造成土壤严重板结，而且容易对环境造成污染，所以这种传统的农业增产方式已经很难满足现代农业发展的需要和人类的要求。现代化的高产出农业急需一种不需大量化肥，能改善土壤肥力并能支持可持续发展的技术。如果把根瘤菌固氮时释放出来的H2用以提高作物产量的这种技术成功运用到农田中，就可以实现应用价格便宜的绿肥生产提高土壤肥力又提高作物单产的理想，有利于农民生活的改善和地区经济的提高并能大幅度地减少污染，节约用于生产化肥的能源。
豆科植物根际氢氧化细菌的分离培养和对其种群及其生理活性的研究是豆科作物轮作、间作效益的重要课题。但是，我们对土壤微生物群落和它与植物根系的关系所知甚少。缺乏这方面信息的几个重要原因是：土壤中的微生物群落极其复杂，可能有上百万种；95∽99%的土壤微生物种类还从未被研究过，在技术上研究根系比研究植物的其他器官要困难许多，特别是对于生长在大田中的植物。新世纪微生物学者的一项重要任务就是未培养微生物的分离培养。由于氢氧化细菌的独特特征和大多数土壤细菌的不可培养性，土壤氢氧化细菌的分离极其困难，至今没有太多结果。这使得对其种群结构的分析研究进展缓慢，对其促进植物生长机理只能处在猜想阶段。有关氢氧化细菌的分离、培养及分类鉴定以及与植物生长作用相关性的研究只在世界上少数几个实验室进行，国内这方面的研究还是空白。
本发明从传统的微生物学入手，以豆科作物大豆的根际土壤为研究材料，对土壤中的氢氧化细菌进行分离培养，开发豆科植物根际吸氢细菌的分离、培养技术；确定豆科植物根际氢氧化细菌的分类地位；了解氢氧化细菌生理生态特性、自然生态条件，探索Hup¯根瘤固氮作用中放氢效应促进植物生长机理。为土壤改良、生物固氮资源的合理开发提供科学依据。
发明内容
本发明的目的之一提供取自陕西关中地区的Hup-大豆植株根际土壤分离培养出一株争论贪噬菌A06，并提供其分离培养方法。
本发明的目的之二是提供该菌株在促进小麦和玉米生长方面的应用。
本发明的实现过程如下：
一种具有促生作用的争论贪噬菌，其分类命名为争论贪噬菌A06 (Variovorax paradoxus A06)，已于2018年10月22日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo：M 2018696。
该菌株的生理生化特征显示在表1中。
附注:“+”，表示阳性，“-”表示阴性。
1：淀粉水解；2：甲基红；3：V-P测定；4；纤维素分解；5：硝酸盐还原；6：亚硝酸还原；7：硫化氢试验；8：葡萄糖氧化发酵；9：产氨试验；10：氧化酶；11：过氧化氢酶；12：吲哚；13：明胶液化；14：柠檬酸盐。
上述的争论贪噬菌 A06的分离纯化步骤如下：
1)样品采集：按常规方法采集陕西关中地区三原县的Hup-大豆植株根际土壤；
2)富集培养：将采集的土壤样品置于持续通H2的培养装置，富集土壤中的争论贪噬菌；
3）菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；
4）菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选争论贪噬菌。
上述步骤(3)所述的矿质盐培养基组成为：NaNO3 2.0g，KH2PO4 0.14g，K2HPO41.2g，酵母膏 0.02g ，MgSO4 0.5g，Fe2(SO4)3·3H2O 0.01g，KCl 0.5g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min。
上述步骤(4)所述的气相色谱条件为：内装5A分子筛的1m×2mm的色谱柱，载气为高纯度N2，流速20 mL/min,进样口温度：150℃，检测器温度：160℃，检测温度：40℃。
对争论贪噬菌菌株的16Sr DNA扩增以及序列测定。
1.使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DVSOSA)切胶回收目的片段，取1µL进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。
2.对上述回收产物进行DNA测序，序列长度为1454bp，结果如下：
ATTGACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCGCGGGAGCAATCCTGGCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCAATCGTGGGGGATAACGCAGCGAAAGCTGTGCTAATACCGCATACGATCTACGGATGAAAGCAGGGGATCGCAAGACCITGCGCGAATGGAGCGGCCGATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGCCTTCGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTGCTTTTGTACGGAACGAAACGGCCZTITCTAATAAAGAGGGCTAATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTAATGTAAGACAGTTGTGAAATCCCCGGGCTCAACCfGGGAACTGCATCTGTGACTGCATTGCTGGAGTACGGCAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAATCCCCTGGGCCTGTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGGTCTTCACTGACTCAGTAACGAAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGrrrAATTCGATGCAACGCGAAAAACcrrACCCACCTTTGACATGTACGGAATTCGCCAGAGATGGCTTAGTGCTCGAAAGAGAACCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACATTTAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCTTATAGGTGGGGCTACACACGTCATACAATGGCTGGTACAAAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCATAAAACCAGTCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTTCTGCCAGAAGTAGTTAGCTTAACCGCAAGGAGGGCGATTACCACGGCAGGGTTCGTGACTGGGG
将该序列提交GenBank，经BLAST同源性检索，结果显示菌株A06与多个Variovoraxparadoxu 菌株的序列相似程度达100%，据此可以确定菌株A06在分子***发育分类学上属于Variovorax paradoxus。
如图2所示，所述A06菌株呈短杆状，G-在固体培养基上菌落呈淡黄色圆形，边缘整齐；其最适的生长温度30℃，最适的pH值为7.0~7.2；其吸氢能力为1.25×10-4∽1.66×10- 4mol/L。
所述的固体培养基组分为：葡萄糖10g/L，NaNO3 2g/L，K2HPO4 1.2g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 0.14g/L，酵母膏0.02g/L，Fe2(SO4)3·3H2O 0.0lg/L，琼脂15∽20g/L。
本发明在具体使用时，是将其制成微生物菌剂。
氢氧化细菌制剂的制备：
(1)菌株：分离纯化出的较强氧化能力H2的氢氧化细菌争论贪噬菌A06；
(2)发酵培养：接种新鲜的争论贪噬菌A06到三角瓶，放入摇床，转速180r/min,280C摇瓶培养36h；
(3)菌剂制备：以草炭、泥炭土、米糠、菜园土、锯木屑、蒙脱土等为吸附剂制成固体菌剂；
(4)田间试验：在西北大学试验田进行。设争论贪噬菌A06、营养液、空白对照3个处理，每个处理用土埂隔开。每隔5天调查促生效果。
使用本发明的争论贪噬菌A06具有如下优点：
(1)当使用含有该菌株的微生物制剂作为农作物的接种物时，由于本发明的争论贪噬菌A06可提供生物活性物质如某些酶供给并促进植物生长，因此尽管使用少量的化肥，也能促进农作物产量；
(2)本发明的争论贪噬菌A06是化肥的替代品，对农作物有广泛的使用范围，如可用于小麦、冬小麦、玉米、番茄和黄瓜；
(3)当本发明的争论贪噬菌A06接种到农作物中时，该菌株可以通过抑制土壤中的植物病原微生物来帮助农作物生长免受病原体的危害；
(4)本发明的争论贪噬菌A06通过定植于农作物根系内部可在被接种的农作物大量表达；
(5)由于本发明的争论贪噬菌A06不可能污染环境，所以可以保护水质和土壤环境，并改善土壤生态***的健康。
本发明还提供了含有氢氧化细菌A06或其产生的次级代谢产物的微生物制剂。
可以使用本领域熟知的方法将本发明的氢氧化细菌制剂配制成植物生长促进剂或植物病原生长抑制剂，但本发明并不局限于此。为替代化肥，本发明的氢氧化细菌制剂优选配制成用于促进植物生长的有机肥料。
根据本发明的环境亲和性微生物制剂通过含有争论贪噬菌A06而能够减少化肥的用量、稳定农作物产量、保护水质和土壤环境并改善土壤生态***的健康。
在农作物的种植过程中，争论贪噬菌A06可产生成合适的微生物制剂，该制剂可接种到农作物如小麦、玉米、番茄和黄瓜中。该菌株通过定植于植物根系内外，通过氧化土壤中的H2并同化CO2而生长，或由其产生的次级代谢物而能够减少化肥的使用量、抑制植物病原菌生长、保护土壤环境并改善植物根际微生态来促进植物生长。
附图说明
图1为菌株A0616S rDNA基因电泳图（M: DNA Marker DL2, 000; 1:CTB309-1 PCR产物）；
图2为A06菌株的电镜图片；
图3为菌株A06通H2和不通H2培养时的生长曲线；
图4为不同pH下菌株对小麦初生苗根长的影响；
图5为不同温度下菌株对小麦初生苗的影响；
图6为菌株A06的生长曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体的说明。
实施例1
本发明的菌株氢氧化细菌A06的分离培养步骤如下：
（1）样品采集：按常规方法采集陕西关中地区三原县的Hup-大豆植株根际土壤。
（2）富集培养：取富集后的混合土壤1克，放入盛100 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振摇20min，使土样与水充分混合，将细胞打散，梯度稀释10-6∽10-12涂MSA平板。然后在MSA上洒上灭菌土壤(0.05留平板)，以增加氢氧化细菌的生长附着面积，利于氢氧化细菌的生长。将平板放入密闭容器中，通入流速为280 mL·min-1，含H2量为1.25×10-4mol·L-1的混合气体，倒置培养2∽4周，直至长出明显菌落。
（3）菌种分离纯化：将菌落进一步纯化富集培养，直至固体培养基上的菌落和光学显微镜下观察的菌体细胞形态一致为止。将纯菌落试管放入密闭干燥器中，通入流速为280mL·min-1，含H2量为1.25×10-4mol·L-1的混合气体培养，两周后长出明显菌苔。在纯化富集培养过程中，因干燥器中空气湿度较大，一周左右密闭容器底部和壁及培养皿外壁会有水珠凝集，需定期清除。试管一周左右需从密闭容器中取出室温下放置干燥处，使棉塞自然干燥防止霉菌滋生，再放回继续培养。
（4）A06氧化氢能力的测定：将长有明显菌苔的40支试管斜面改用无菌橡皮塞密闭后，用100µL进样器注入100µL纯H2，使混合气体的H2浓度为1.66×10-4mol左右，充分混合后用气相色谱检测密闭试管中的初始H2含量，一只无细菌的试管作为阴性控制。再将密闭试管在室温下水平放置于旋转摇床上培养3天，试管中的气体用100µL进样器抽出并用气相色谱检测H2含量。气相色谱分析条件：H2含量分析采用安捷伦气相色谱GC6890，lm×2mm的色谱柱内装5A分子筛，高纯N2作载气，流速20 mL·min-1；进样口温度：150℃；检测器度：160℃；检测温度：40℃，分析时间为3min。采用静态配气法用针筒抽取空气和H2各一定量，注入抽成真空的配气袋内，配成不同气相组分的标准样。用100µL进样器抽取标准样进行分析检测。
（5）氢氧化细菌自养生长试验
采用平板培养和摇瓶培养两种方法进行试验。
方法一：取吸氢值大于1.25×10-4mo1·L-1的细菌菌株，分别稀释10-4∽10-6涂MSA平板(培养基中不添加酵母膏)，同时作对照组。将平板放入上述密闭干燥器中，通入流速为280mL·min-1，含H2量为1.25×10-4mo1·L-1的混合气体，倒置室温培养4周，直至长出明显菌落。将对照组平板不通H2混合气体，室温倒置培养2∽4周。观察两组细菌菌落的生长情况。检测细菌是否具有以H2为能源，CO2为主要碳源的无机盐培养基上的自养生长能力。
方法二：将菌株接种在100 mLMSA液体培养基中(培养基中不添加酵母)
分两组实验。一组锥形瓶接种后用灭菌橡皮塞密闭，橡皮塞上有进气孔和出气孔。进气孔和出气孔均打开后通入流速为280mL·min-1，含H2量为1.25×10-4mo1·L-1H2混合气体10min置换瓶中气体，密闭两孔后在37℃，转速120r/min摇床培养;间隔培养8h后再同法置换瓶中气体，培养时间32h。另一组不通氢气好氧培养，37℃摇床，转速120r/min。每隔4h对两组菌悬液取样，721分光光度计在560nm波长下测量菌悬液OD值，绘制生长曲线，检测不含碳源条件下，通H2与否对菌株生长状况的影响。
试验结果为：在通H2的MSA固体培养基上，2-4周内20株菌先后都长出明显菌落；在不通H2的固体MSA培养基上，4周内均无明显菌落生长。采用摇瓶培养方法培养时，通氢气的一组细菌生长都较快，像A06菌株在第12h时就进入了对数生长期，20h时进入了稳定期(图3)；而不通氢气的一组细菌的OD值基本没有变化，即细菌没有生长。两种试验方法的结果基本一致，表明这20株细菌在液体和固体培养基中均能利用H2为能源，以CO2为主要碳源进行无机化能自养生长。
结合气相色谱分析结果和自养生长试验结果，初步判断上述实施方法分离培养出来的20株氢氧化细菌，其吸氢值均大于1.25×10-4mol/L株氢氧化细菌，有较强的氧化氢能力。
所述培养基组分为：葡萄糖10g/L，NaNO3 2g/L，K2HPO4 1.2g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl0.5g/L，KH2PO4 0.14g/L，酵母膏0.02g/L，Fe2(SO4)3·3H2O 0.0lg/L，琼脂15-20g/L。回归方程:y=192.72x-1896.3。
上述分离得到的菌株A06的性质如下：
1）形态特征
本菌株在固体培养基上菌落呈淡黄色圆形，边缘整齐，革兰氏阴性。
2）培养特征
最适生长条件为：最适的生长温度30℃，最适的pH值为7.0。
3）功能特性
吸氢能力：1.25×10-4-1.66×10-4mol/L。
实施例2氢氧化细菌A06对不同碳源的利用
由于氢气培养装置培养氢氧化细菌仍存在容器体积有限，培养数量不宜过多的条件限制，并且筛选的氢氧化细菌均具有生长在有机碳源培养基中。为了更方便进一步研究促进小麦根生长的氢氧化细菌菌株的其他生理特性及促进小麦根生长的可能作用机理，在MSA筛选培养基中添加不同碳源，考察氢氧化细菌在不同碳源条件下的生长情况。
在MSA液体培养基中添加葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、木糖、果糖、蔗糖6种常用的碳源，接种细菌后，37℃摇床，转速120r/min培养，以不添加碳源的MSA液体培养基中该菌株生长情况为对照。培养28h后在560nm波长下，比浊法检测菌体浓度，判断菌株对该碳源的利用能力。表2是菌株A06在不同碳源中的生长情况。
注：++生长旺盛grow better；+生长grow；一不生长cannot
实施例3具有ACC脱氨酶的氢氧化细菌的检测
1.具有ACC脱氨酶的氢氧化细菌的检测
取小麦平板试验中能够促进小麦根显著生长的氢氧化菌株，做ACC脱氨酶活性检测。实验步骤如下：
(1)检测条件确定 ACC为一种非蛋白氨基酸，所以采用氨基酸层析方法检测。配置不同比例的正丁醇、乙酸、水的混合溶液作为展层剂，硅胶板为支持物，显色剂为0.5%的茚三酮溶液，检测最佳展层剂的配比。
(2)ACC液体培养基 将MSA培养基作了简单的改变，培养基中除去琼脂，即改固体MSA培养基为液体MSA培养基。同时在液体MSA培养基中加入了可溶性淀粉作为碳源，使培养条件不再受通氢气混合气体的限制，方便试验的操作。50 mL锥形瓶中加入9 mL液体MSA培养基，灭菌。称取20mgACC药品，溶解在20 mL蒸馏水中，配成l mg/mL的ACC溶液，用灭过菌的微孔滤膜过滤器过滤ACC溶液，制成无菌ACC溶液。取1 mL无菌ACC溶液加入到上述灭菌的液体MSA培养基锥形瓶中，使瓶中的ACC溶液浓度为0.1mg/mL。
(3)接种 取一环氢氧化细菌斜面菌苔，接种到ACC培养基中。同时接种氢氧化细菌到无ACC溶液的液体MSA培养基中作为对照组。以无菌ACC液体培养基和无菌不含ACC的液体培养基为空白对照。将锥形瓶放入摇床，转速120r/min, 370C摇瓶培养72h。
(4)检测 取摇床培养72h的菌悬液作硅胶板薄层层析脸测菌株是否能够利用ACC这种氮源。
2. A06菌株对ACC的消耗能力检测
ACC消耗能力的检测方法基本与上述具有ACC脱氨酶的氢氧化细菌的检测方法一致。所不同的是培养液中的ACC溶液浓度为l mg/mL。每隔6h取样一次，对不同时间段的菌悬液做薄层层析。在560nm波长下，比浊法检测不同培养阶段菌体浓度，做出菌株生长曲线。考察具有ACC脱氨酶菌株生长阶段对ACC的消耗情况。
ACC检测结果
(1)展层条件的确定
采用正丁醇、乙酸、蒸馏水为展层剂，不同配比展层剂的层析效果有所不同(表)。经过反复硅胶板薄层层析试验，确定检测ACC条件为:展层剂为正丁醇:乙酸:水=75:15:10，显色剂为0.5%的茚三酮溶液。展层时间为1.5小时，显色温度为100℃，显色时间5min。称取一定量ACC溶于蒸馏水中，配置l0 mg/mL∽10-4mg/mL的ACC梯度溶液，做硅胶板薄层层析，确定ACC薄层层析能够检测的最小浓度为10-2mg/mL。
（2）氢氧化细菌消耗ACC检测结果
对有显著促进小麦和玉米生根作用的9株菌株进行了检测，结果表明，仅有菌株A06的菌悬液在培养48h后，没有检测到ACC这种非蛋白氨基酸的存在。其它菌株的菌悬液中的ACC显色反应，培养前与培养48h后的颜色没有太大变化。结果说明只有菌株A06拥有ACC脱氨酶，能够利用ACC这种非蛋白氨基酸为氮源；其它菌株不具有利用ACC的能力。
(3) A06菌株的生长曲线
A06菌株的生长曲线见图6。经过延滞期后，在生长20h后进入到生长稳定期。但是细菌的稳定期时间比较短，在第26h后细菌进入了死亡期，原因是培养基内的有机物完全被消耗了，缺少必要的碳氮源。
(4) A06菌株对ACC的消耗
对菌株A06不同生长时间的培养液，薄层层析检测ACC的消耗情况，不同时间段取样检测的结果表明，随细菌培养时间的增加，菌悬液中ACC的含量呈现明显下降趋势，在培养至24h时已经无斑点，表明菌悬液中的ACC含量非常低或者已经完全被消耗了。
实施例4氢氧化细菌对小麦和玉米的促生作用测定
将选定的20株氢氧化细菌在接种于加入可溶性淀粉的MSA液体培养基中，37℃摇床，转速120r/min培养28h。室温下将小麦种子在蒸馏水中浸泡7∽10小时，待小麦种子萌芽，挑取无虫害完整的萌芽小麦种子，放入到平皿中，每平皿十粒小麦种子，倒入菌悬液10 mL，每处理5个重复。作大肠杆菌菌悬液小麦平板和小麦无菌生长平板作为对照。放入恒温光照培养箱中，温度26℃培养3∽5天，观察平板小麦生长情况，测量并记录结果。
方法基本同小麦促生试验。室温下将玉米种子在蒸馏水中浸泡7－10小时，待玉米种子萌芽，挑取完整的萌芽种子，放入到平皿中，每平皿4粒，倒入配置好的菌悬液10 mL，每处理5个重复。作大肠杆菌菌悬液玉米平板和玉米无菌生长平板作为对照。放入恒温光照培养箱中，温度26℃培养3∽5天，观察平板上的玉米种子生长情况，测量并记录结果。
实施例5环境胁迫下A06菌株对小麦初生苗的影响
(1) pH对小麦初生苗的影响
操作步骤同小麦促生试验所述，但分别置于4.5，5.5，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0七个pH梯度下，放置于28℃恒温光照培养箱中，4d后测根长。
试验结果：pH值变化范围在4.5-9.0之间，考察了不同pH值下菌株A06对小麦促生的效果。pH在6.5-7.5之间时，菌株对小麦根有不同程度的促进作用，但是pH大于8.5和小于5.5时，菌株A06对小麦的促生效果不明显（图4）。
(2)温度对小麦初生苗的影响
操作步骤基本同小麦促生试验所述，但所有处理pH值均为7.0，分别置于4℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃五个温度条件下培养，4d后测根长。
试验结果：温度范围在4℃-35℃之间，考察菌株在不同温度下对小麦促生的效果。在25℃、30℃处理的样品，菌株A06促生效果显著，但是在温度低于15℃的两个处理样品，小麦苗受到温度的影响较大，菌株没有表现出缓解作用，35℃处理的样品，菌株A06的促生效果不显著（图5和图6）。

Claims (8)

1.一种具有促生作用的争论贪噬菌，其分类命名为争论贪噬菌A06 (Variovorax paradoxus A06)，已于2018年10月22日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo：M 2018696。
2.根据权利要求1所述的争论贪噬菌 A06，其特征在于：所述A06菌株呈短杆状，G-在固体培养基上菌落呈淡黄色圆形，边缘整齐；其最适的生长温度30℃，最适的pH值为7.0~7.2；其吸氢能力为1.25×10-4∽1.66×10-4mol/L。
3.权利要求1所述的争论贪噬菌 A06的分离纯化步骤如下：
（1）样品采集：按常规方法采集陕西关中地区三原县的Hup-大豆植株根际土壤；
（2）富集培养：将采集的土壤样品置于持续通H2的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；
（3）菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；
（4）菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。
4.根据权利要求3所述的争论贪噬菌 A06的分离纯化步骤，其特征在于，其中步骤(3)所述的矿质盐培养基组成为：NaNO3 2.0g，KH2PO4 0.14g，K2HPO4 1.2g，酵母膏 0.02g ，MgSO4 0.5g，Fe2(SO4)3·3H2O 0.01g，KCl 0.5g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min。
5.根据权利要求3所述的争论贪噬菌 A06的分离纯化步骤，其特征在于，其中步骤(4)所述的气相色谱条件为：内装5A分子筛的1m×2mm的色谱柱，载气为高纯度N2，流速20 mL/min,进样口温度：150℃，检测器温度：160℃，检测温度：40℃。
6.权利要求1所述的争论贪噬菌A06对小麦与玉米的促生作用。
7.含有权利要求1所述争论贪噬菌A06的固体菌剂。
8.权利要求7所述的争论贪噬菌A06固体菌剂的制备方法，其特征在于：将新鲜的争论贪噬菌A06发酵液以草炭、泥炭土、米糠、菜园土、锯木屑或蒙脱土为吸附剂制成固体菌剂。
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