CN114107097B - 一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺 - Google Patents
一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114107097B CN114107097B CN202111326362.6A CN202111326362A CN114107097B CN 114107097 B CN114107097 B CN 114107097B CN 202111326362 A CN202111326362 A CN 202111326362A CN 114107097 B CN114107097 B CN 114107097B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- solid
- culture medium
- solid fermentation
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000007787 solid Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 70
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 title claims abstract description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 56
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 claims abstract description 21
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 18
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 18
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 14
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 14
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 11
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 11
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 6
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 6
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 5
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000013329 compounding Methods 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 description 11
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N3/00—Spore forming or isolating processes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，包括如下步骤：步骤1、阿佛曼链霉菌的菌种制备：将冷冻保藏的阿佛曼链霉菌菌种接种于茄子瓶斜面培养基上，于28‑30摄氏度培养7天，备用；步骤2、固体发酵培养：步骤2‑1、配制固体发酵培养基，并灭菌；步骤2‑2、取步骤1制备的茄子瓶斜面菌种，用无菌水制成菌种悬浮液；步骤2‑3、将菌种悬浮液均匀接种于步骤2‑1制备的固体发酵培养基中；步骤2‑4、在卧式固态生物反应器进行固体发酵培养，时间9‑11天，至每克物料中活孢子数量大于等于50亿个后，停止发酵。本发明能够产出大量的阿佛曼链霉菌活性孢子，为阿佛曼链霉菌活性孢子的产业化发展奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于发酵生产技术领域，具体涉及一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺。
背景技术
生物农药是指利用生物活体(真菌，细菌，昆虫病毒，转基因生物，天敌等)或其代谢产物(信息素，生长素，萘乙酸，2，4-D等)针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。
而阿维菌素(Avermectins，AVM)，又称阿佛曼菌素，是由阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)发酵产生的一组大环内酯类抗生素。其作为一种光谱杀虫的绿色生物农药，自诞生以来深受人类青睐，得到了广泛的应用。但是在阿维菌素产业发展中，抗药性逐年递增、液态发酵下所产生的废渣、废水以及制造过程中大量有机溶剂的使用，对动植物、土壤、生态环境，带来较大危害等瓶颈问题，成为制约生物农药产业健康发展的一个重要问题。
而以活体微生物、活性代谢产物为有效成分创制安全高效的生物农药新品种，由于其具有绿色高效、低成本、低污染制造工艺等优势，逐渐成为未来生物农药发展研究方向，因此，平衡阿维菌素产业的发展，开发一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，以解决阿维菌素产业中带来的一些列问题，显得至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的的缺陷，提供了一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，其绿色高效、制造成本低，制造工艺污染低。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，包括如下步骤：
步骤1、阿佛曼链霉菌的菌种制备：
将冷冻保藏的阿佛曼链霉菌菌种接种于茄子瓶斜面培养基上，于28-30摄氏度培养7天，备用；
步骤2、固体发酵培养：
步骤2-1、配制固体发酵培养基，并灭菌；
步骤2-2、取步骤1制备的茄子瓶斜面菌种，用无菌水制成菌种悬浮液；
步骤2-3、将菌种悬浮液均匀接种于步骤2-1制备的固体发酵培养基中；
步骤2-4、在卧式固态生物反应器进行固体发酵培养，时间9-11天，至每克物料中活孢子数量大于等于50亿个后，停止发酵；固体发酵培养的培养条件为：无菌空气通气量1：0.2-0.5v/v/min(无菌空气通气量指的是培养基与每分钟内通入的无菌空气的体积比)；反应器压力：0.005-0.01MPa，培养温度28-30摄氏度，培养湿度50-60％。
进一步的，所述阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，还包括步骤3、活孢子粉的制备：
将步骤2发酵结束的固体培养物移入双锥旋转鼓风式干燥机中干燥，至物料含水量小于等于10％后，粉碎成60-80目的粉末，即得阿佛曼活孢子粉。
进一步的，所述茄子瓶斜面培养基，包括如下质量百分比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.03％，琼脂1.8-2.2％，水100mL，pH6.5-7.0。
进一步的，所述茄子瓶斜面培养基在接种前还需要灭菌，所述茄子瓶斜面培养基的灭菌条件为：于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热消毒灭菌30min。
进一步的，所述固体发酵培养基：先按包括如下质量百分比的各原料复配：谷糠60-70％，麸皮12-15％，豆饼3-5％，花生饼粉3-5％，玉米粉8-10％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.5％，血胨0.1-0.2％，pH自然，保证各原料的百分总量为100％；然后加入水调整湿度为50-60％。
进一步的，所述固体发酵培养基在接种前还需要灭菌，所述固体发酵培养基的灭菌条件为：于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热灭菌30min。
进一步的，所述活孢子的计数检测方法为：采用双层平板培养计数检验法，进行4个重复，取平均值。
更进一步的，所述双层平板培养计数检验法，具体包括：
1、培养基的准备：
固体培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2.0-2.2％，水100mL，pH6.5-7.0；
半固体培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂0.8-1.2％，水100mL；将固体培养基和半固体培养基分别装入250mL三角瓶中，每瓶100mL，于0.11-0.12MPa压力下115-120摄氏度灭菌30min，备用；
2、检验：
1)、取1g待检样品，用无菌水进行梯度稀释后，取1mL梯度稀释后的菌悬液加入到半固体培养基中，制得含菌半固体培养基；
2)、将固体培养基加热至熔化后，倒入培养皿中，待固体培养基冷却凝固后，向其中倒入含菌半固体培养基，放平静置，待凝固后，于28-30摄氏度恒温箱中培养，然后记录每个培养皿中单个活孢子菌落的个数；
每个孢子粉中活孢子个数＝单个活孢子菌落数*稀释倍数。
更进一步的，所述梯度稀释，采用4级梯度稀释，每级稀释100倍；具体操作如下：将1g待检样品加入100mL无菌水中，得到10-2数量级的菌悬液，然后，取1mL10-2数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10-4数量级的菌悬液，然后取1mL10-4数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10-6数量级的菌悬液；1mL10-6数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10-8数量级的菌悬液，即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明以固态培养基发酵的方式制备阿佛曼链霉菌活性孢子，其制备方法绿色高效，成本低，制备过程中，不会用到有机溶剂等高污染试剂，安全环保，且无废液排放问题，避免了阿维菌素产业中对环境造成的一些列危害。
本发明在固体发酵过程中，加入大豆饼粉、花生饼粉、玉米粉、血胨作为碳源和氮源，并辅以硫酸铵作为快速碳源，并加入谷糠和麸皮进行含水量的调节，此外，培养基中血胨的加入还为阿佛曼链霉菌生长繁殖提供了一些微量元素，各培养基组分合理搭配，共同作用，促进了阿佛曼链霉菌生长繁殖以及活孢子的产生。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一、培养基配方：
茄子瓶斜面培养基，包括如下百分质量比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.03％，琼脂2.0％，水100mL，pH6.8；于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热消毒灭菌30min；
固体发酵培养基：先按如下百分质量比复配各原料：谷糠68.8％，麸皮13％，豆饼4％，花生饼粉4％，玉米粉9％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.5％，血胨0.2％，pH自然，然后加入水调整湿度为55％；于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热灭菌30min；
二、发酵工艺：
一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，包括如下步骤：
步骤1、阿佛曼链霉菌的菌种制备：
将冷冻保藏的阿佛曼链霉菌菌种接种于茄子瓶斜面培养基上，于28-30摄氏度培养7天，备用；所述阿佛曼链霉菌菌种保藏于中国农业大学菌种保藏中心，地址：中国北京；菌种保藏编号为M2021-001。
步骤2、固体发酵培养：
步骤2-1、配制固体发酵培养基，并灭菌；
步骤2-2、取步骤1制备的茄子瓶斜面菌种，用无菌水制成菌种悬浮液；
步骤2-3、将菌种悬浮液均匀接种于步骤2-1制备的固体发酵培养基中；
步骤2-4、在卧式固态生物反应器进行固体发酵培养，时间9-11天，至每克物料中活孢子数量大于等于50亿个后，停止发酵；固体发酵培养的培养条件为：无菌空气通气量1：0.35v/v/min；反应器压力：0.008MPa，培养温度28-30摄氏度，培养湿度50-60％。
步骤3、活孢子粉的制备：
将步骤2发酵结束的固体培养物移入双锥旋转鼓风式干燥机中干燥，至物料含水量小于等于10％后，粉碎成70目的粉末，即得阿佛曼活孢子粉。
其中，步骤2-4中对活孢子数量进行计数所采用的方法为双层平板培养计数检验法，计数时，进行4个重复，取平均值。
所述双层平板培养计数检验法包括如下步骤：
1、培养基的准备：
固体培养基，包括如下百分质量比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2.1％，水100mL，pH6.5-7.0；
半固体培养基，包括如下百分质量比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂1.0％，水100mL；
将固体培养基和半固体培养基分别装入250mL三角瓶中，每瓶100mL，于0.11-0.12MPa压力下115-120摄氏度灭菌30min，备用；
2、检验：
1)、取1g待检样品，加入100mL无菌水中，得到10-2数量级的菌悬液，然后，取1mL10-2数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10-4数量级的菌悬液，然后取1mL10-4数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10-6数量级的菌悬液；1mL10-6数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10-8数量级的菌悬液；取1mL10-8数量级的菌悬液加入到半固体培养基中，制得含菌半固体培养基；
2)、将固体培养基加热至熔化后，倒入培养皿中，待固体培养基冷却凝固后，向其中倒入含菌半固体培养基，放平静置，待凝固后，于28-30摄氏度恒温箱中培养，然后记录每个培养皿中单个活孢子菌落的个数；
每个孢子粉中活孢子个数＝单个活孢子菌落数*稀释倍数。
本实施例中，稀释倍数为108倍。
实施例2：
一、培养基配方：
茄子瓶斜面培养基，包括如下百分质量比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.03％，琼脂1.8％，水100mL，pH6.5；于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热消毒灭菌30min；
固体发酵培养基：先按如下百分质量比复配各原料：谷糠68.9％，麸皮12％，豆饼5％，花生饼粉3％，玉米粉10％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.5％，血胨0.1％，pH自然，然后加入水调整湿度为52％；于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热灭菌30min；
二、发酵工艺：
一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，包括如下步骤：
步骤1、阿佛曼链霉菌的菌种制备：
将冷冻保藏的阿佛曼链霉菌菌种接种于茄子瓶斜面培养基上，于28-30摄氏度培养7天，备用；
步骤2、固体发酵培养：
步骤2-1、配制固体发酵培养基，并灭菌；
步骤2-2、取步骤1制备的茄子瓶斜面菌种，用无菌水制成菌种悬浮液；
步骤2-3、将菌种悬浮液均匀接种于步骤2-1制备的固体发酵培养基中；
步骤2-4、在卧式固态生物反应器进行固体发酵培养，时间9天，至每克物料中活孢子数量大于等于50亿个后，停止发酵；固体发酵培养的培养条件为：无菌空气通气量1：0.2v/v/min；反应器压力：0.005MPa，培养温度28-30摄氏度，培养湿度50-60％。
步骤3、活孢子粉的制备：
将步骤2发酵结束的固体培养物移入双锥旋转鼓风式干燥机中干燥，至物料含水量小于等于10％后，粉碎成80目的粉末，即得阿佛曼活孢子粉。
其中，步骤2-4中对活孢子数量进行计数所采用的方法为双层平板培养计数检验法，计数时，进行4个重复，取平均值。
所述双层平板培养计数检验法包括如下步骤：同实施例1。
实施例3
一、培养基配方：
茄子瓶斜面培养基，包括如下百分质量比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.03％，琼脂2.2％，水100mL，pH7.0；于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热消毒灭菌30min；
固体发酵培养基：先按如下百分质量比复配各原料：谷糠65.8％，麸皮15％，豆饼3％，花生饼粉5％，玉米粉10％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.5％，血胨0.2％，pH自然，然后加入水调整湿度为60％；于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热灭菌30min；
二、发酵工艺：
一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，包括如下步骤：
步骤1、阿佛曼链霉菌的菌种制备：
将冷冻保藏的阿佛曼链霉菌菌种接种于茄子瓶斜面培养基上，于28-30摄氏度培养7天，备用；
步骤2、固体发酵培养：
步骤2-1、配制固体发酵培养基，并灭菌；
步骤2-2、取步骤1制备的茄子瓶斜面菌种，用无菌水制成菌种悬浮液；
步骤2-3、将菌种悬浮液均匀接种于步骤2-1制备的固体发酵培养基中；
步骤2-4、在卧式固态生物反应器进行固体发酵培养，时间11天，至每克物料中活孢子数量大于等于50亿个后，停止发酵；固体发酵培养的培养条件为：无菌空气通气量1：0.5v/v/min；反应器压力：0.01MPa，培养温度28-30摄氏度，培养湿度50-60％。
步骤3、活孢子粉的制备：
将步骤2发酵结束的固体培养物移入双锥旋转鼓风式干燥机中干燥，至物料含水量小于等于10％后，粉碎成60目的粉末，即得阿佛曼活孢子粉。
其中，步骤2-4中对活孢子数量进行计数所采用的方法为双层平板培养计数检验法，计数时，进行4个重复，取平均值。
所述双层平板培养计数检验法包括如下步骤：同实施例1。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (2)
1.一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、阿佛曼链霉菌的菌种制备：
将冷冻保藏的阿佛曼链霉菌菌种接种于茄子瓶斜面培养基上，于28-30摄氏度培养7天，备用；
步骤2、固体发酵培养：
步骤2-1、配制固体发酵培养基，并灭菌；
步骤2-2、取步骤1制备的茄子瓶斜面菌种，用无菌水制成菌种悬浮液；
步骤2-3、将菌种悬浮液均匀接种于步骤2-1制备的固体发酵培养基中；
步骤2-4、在卧式固态生物反应器进行固体发酵培养，时间9-11天，至每克物料中活孢子数量大于等于50亿个后，停止发酵；固体发酵培养的培养条件为：无菌空气通气量1：0.2-0.5v/v/min；反应器压力：0.005-0.01MPa，培养温度28-30摄氏度，培养湿度50-60％；
步骤3、活孢子粉的制备：
将步骤2发酵结束的固体培养物移入双锥旋转鼓风式干燥机中干燥，至物料含水量小于等于10％后，粉碎成60-80目的粉末，即得阿佛曼活孢子粉；
其中，所述茄子瓶斜面培养基包括如下质量百分比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.03％，琼脂1.8-2.2％，水100mL，pH6.5-7.0； 所述茄子瓶斜面培养基在接种前还需要灭菌，所述茄子瓶斜面培养基的灭菌条件为：于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热消毒灭菌30min；
所述固体发酵培养基按包括如下质量百分比的各原料复配：谷糠60-70％，麸皮12-15％，豆饼3-5％，花生饼粉3-5％，玉米粉8-10％，碳酸钙0.5％，硫酸铵0.5％，血胨0.1-0.2％，pH自然，保证各原料的百分总量为100％，然后加入水调整湿度为50-60％；所述固体发酵培养基在接种前还需要灭菌，所述固体发酵培养基的灭菌条件为：于0.11-0.12MPa压力下120摄氏度湿热灭菌30min；
所述步骤2-4中，活孢子的计数检测方法为双层平板培养计数检验法，检测进行4个重复，取平均值；双层平板培养计数检验法包括：
（1）培养基的准备：
固体培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2.0-2.2％，水100mL，pH6.5-7.0；
半固体培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂0.8-1.2％，水100mL；
将固体培养基和半固体培养基分别装入250mL三角瓶中，每瓶100mL，于0.11-0.12MPa压力下115-120摄氏度灭菌30min，备用；
（2）检验：
取1g待检样品，用无菌水进行梯度稀释后，取1mL梯度稀释后的菌悬液加入到半固体培养基中，制得含菌半固体培养基；
将固体培养基加热至熔化后，倒入培养皿中，待固体培养基冷却凝固后，向其中倒入含菌半固体培养基，放平静置，待凝固后，于28-30摄氏度恒温箱中培养，然后记录每个培养皿中单个活孢子菌落的个数；
每个孢子粉中活孢子个数＝单个活孢子菌落数×稀释倍数。
2.根据权利要求1所述固体发酵工艺，其特征在于，所述梯度稀释，采用4级梯度稀释，每级稀释100倍，具体操作如下：
将1g待检样品加入100mL无菌水中，得到10-2数量级的菌悬液，然后，取1mL10-2数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10-4数量级的菌悬液，然后取1mL10-4数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10-6数量级的菌悬液；1mL10-6数量级菌悬液加入到99mL无菌水中，得到10-8数量级的菌悬液，即可。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111326362.6A CN114107097B (zh) | 2021-11-10 | 2021-11-10 | 一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111326362.6A CN114107097B (zh) | 2021-11-10 | 2021-11-10 | 一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114107097A CN114107097A (zh) | 2022-03-01 |
| CN114107097B true CN114107097B (zh) | 2024-03-05 |
Family
ID=80378066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111326362.6A Active CN114107097B (zh) | 2021-11-10 | 2021-11-10 | 一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114107097B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468630A (zh) * | 2013-10-09 | 2013-12-25 | 长沙理工大学 | 一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法 |
| CN103642865A (zh) * | 2013-11-18 | 2014-03-19 | 宁夏泰瑞制药股份有限公司 | 一种阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基和发酵方法 |
| CN106148229A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-11-23 | 金正大生态工程集团股份有限公司 | 一种弗氏链霉菌固体培养基、培养方法及农用微生物菌剂的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19638045A1 (de) * | 1996-09-18 | 1998-03-19 | Bayer Ag | Injektionsformulierungen von Avermectinen und Milbemycinen |
-
2021
- 2021-11-10 CN CN202111326362.6A patent/CN114107097B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468630A (zh) * | 2013-10-09 | 2013-12-25 | 长沙理工大学 | 一种固态发酵生产益生菌孢子粉的方法 |
| CN103642865A (zh) * | 2013-11-18 | 2014-03-19 | 宁夏泰瑞制药股份有限公司 | 一种阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基和发酵方法 |
| CN106148229A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-11-23 | 金正大生态工程集团股份有限公司 | 一种弗氏链霉菌固体培养基、培养方法及农用微生物菌剂的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 曹友声等.《现代工业微生物学》.湖南科学技术出版社,1998,第82-85页. * |
| 重离子辐照诱变阿佛曼链霉菌的实验观察;尚勇良;杨进才;卫广森;贾宁;;现代生物医学进展;9(15);第2844-2846页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114107097A (zh) | 2022-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104531533B (zh) | 一种防治植物重茬病害的复合菌剂及其制备方法、应用 | |
| US20110214463A1 (en) | Antagonistic bacteria for controlling the fusarium wilt of continuous cropping banana and their microbial organic fertilizer | |
| CN108277177B (zh) | 细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法、发酵产物、生防产品和应用 | |
| CN103570448B (zh) | 一种烟杆规模化、无害化处理技术 | |
| CN103159570A (zh) | 一种固体微生物菌肥及其制备方法 | |
| CN106011022A (zh) | 一种玫瑰黄链霉菌固体发酵培养基及其制备和发酵方法 | |
| CN111235039B (zh) | 一种用于培养高毒力金龟子绿僵菌的培养基及其制剂和应用 | |
| CN113755358A (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌zj1菌株和发酵液制备及使用方法 | |
| CN110438036B (zh) | 一株具有固氮作用的固氮菌n24及其应用 | |
| CN108865934B (zh) | 一种沙福芽孢杆菌hmd9204及其菌剂和应用 | |
| CN109234215A (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基及培养方法 | |
| CN104830696A (zh) | 一种高产安络小皮伞诱变菌株及培育方法 | |
| CN102598977B (zh) | 一种堆肥发酵液提高黑麦草抗Cr和Cd能力的方法 | |
| CN115747082B (zh) | 一种白僵菌固体培养基及其应用 | |
| CN114107097B (zh) | 一种阿佛曼链霉菌活性孢子的固体发酵工艺 | |
| CN105254424A (zh) | 一种由枯草芽孢杆菌制备的微生物肥料及其制备方法 | |
| CN115747130B (zh) | 一种促进莱氏绿僵菌Mr006产孢的培养基及其制剂和应用 | |
| CN109207393A (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治芹菜根腐病中的应用 | |
| CN108504596A (zh) | 一种调节草莓根际土壤微生态的生物菌肥发酵剂 | |
| CN108484238A (zh) | 一种使用农用废弃物制备肥料的方法及生物有机肥料 | |
| CN111117920B (zh) | 一种产蛋白酶、产铁载体的蕈状芽孢杆菌及其应用 | |
| CN103849592A (zh) | 一种链霉菌孢子的生产方法 | |
| CN114085746A (zh) | 木霉菌自动发酵*** | |
| CN105272406A (zh) | 一种由侧孢芽孢杆菌制备的微生物肥料及其制备方法 | |
| CN103564644B (zh) | 一种不适用烟叶无害化处理技术 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 051530 Hebei South Shijiazhuang City, Zhaoxian County South Park biological industrial park Applicant after: Hebei Xingbai Agricultural Technology Co.,Ltd. Address before: 051530 Hebei South Shijiazhuang City, Zhaoxian County South Park biological industrial park Applicant before: HEBEI XINGBAI AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |