CN101778935A - 用于进行间充质干细胞(msc)生长调节的低硬度凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有在0.1-2.5千帕(kPa)的范围内的硬度的凝胶以及基质，制造上述凝胶以及基质的方法，以及保存间充质干细胞种群或者研究间充质干细胞的方法，其中在所述的方法中包括上述的凝胶以及基质。

Description

用于进行间充质干细胞(MSC)生长调节的低硬度凝胶
发明领域
本发明提供了使用软凝胶调节干细胞发育的方法。具体的，所述的发明提供了用来对所述的干细胞的发育进行调节的方法、组合物以及装置，在所述的方法、组合物以及装置中使用到具有最优化的粘弹性特性的凝胶。
发明的背景技术
成人的间充质干细胞具有自我再生的能力并且分化成间充质组织的多种细胞谱系。因此，已经对这些细胞的临床应用进行了考虑，例如进行受损伤组织的替代或者作为抗癌症试剂的载体。成人间充质干细胞的应用目前仍然被限制在临床前阶段，这在部分上归因于这些细胞在体外发生的迅速老化，这种老化限制了它们的扩张以及工程化。为了克服由加速老化所带来的问题，已经报道了通过端粒酶的转导作用对间充质干细胞进行永生化处理。然而，一旦它们被植入到组织中时，它们不受限制的自我再生能力可能导致失控的生长。事实上，已经在体外装置中观察到了端粒酶转导的间充质干细胞的转化作用。
因此，对于成人间充质干细胞的生长的调节对于它们的临床应用而言是关键步骤之一。
发明概述
本发明提供了使用软凝胶调节干细胞发育的方法。具体的，所述的发明提供了用来对所述的干细胞的发育进行调节的方法、组合物以及装置，在所述的方法、组合物以及装置中使用到具有最优化的粘弹性特性的凝胶。
在另外一种实施方式中，所述的发明提供了一种制造纤维蛋白基质的方法，其中所述的纤维蛋白基质具有在0.1-2.5千帕(kPa)的范围内的硬度，所述的方法包括使一种组合物发生聚合的步骤，其中所述的组合物包括纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白，从而制造出一种柔软的纤维蛋白基质，其中存在于所述柔软的纤维蛋白基质中的所述纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白的浓度为1-20毫克/毫升，并且利用一种包括粘附蛋白的组合物对所述的柔软的纤维蛋白基质进行覆盖。
在另外一种实施方式中，所述的发明提供了一种保存间充质干细胞种群的方法，所述的方法包括在一种凝胶基质中对所述的间充质干细胞种群进行培养的步骤，其中所述的凝胶基质具有在0.1-2.5千帕(kPa)的范围内的硬度。
在另外一种实施方式中，所述的发明提供了一种用于调节间充质干细胞的生长的设备，所述的设备包括：一种具有在0.1-2.5千帕(kPa)的范围内的硬度的凝胶基质；以及一种脂肪细胞诱导培养基，其中所述的凝胶或者基质利用1型胶原质、纤维粘连蛋白或者它们的组合进行了覆盖。
在另外一种实施方式中，所述的发明提供了一种凝胶基质，所述的凝胶基质中包括胶凝剂以及丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物，其中所述的凝胶基质利用1型胶原质、纤维粘连蛋白或者它们的组合进行了覆盖并且具有在0.1-2.5千帕(kPa)的范围内的硬度。
在一种实施方式中，所述的发明提供了一种对间充质干细胞的发育进行调节的方法，所述的方法包括将所述的间充质干细胞悬浮在一种凝胶基质中的步骤，所述的凝胶基质中包括一种胶凝剂，其中所述的凝胶基质被1型胶原质、纤维粘连蛋白或者它们的组合进行了覆盖并且其中所述的凝胶基质被保持在一种预先确定的硬度下；以及将所述的凝胶基质暴露在一种生长调节因子之中。
在另外一种实施方式中，所述的发明提供了一种在体外诱导或者维持成体干细胞的静止状态并且保持成体干细胞的生物学活性的方法，包括：将所述的成体干细胞与一种凝胶基质进行接触，其中所述的凝胶基质中包括一种细胞外物质，能够与存在于所述的成体干细胞的膜上的整联蛋白发生结合，所述的凝胶基质所具有的弹性与同样类型的体内成体干细胞的主要体内生物学微环境所具有的弹性在本质上是类似的；并且向所述的成体干细胞提供营养物质，用以在体外维持所述成体干细胞的生物学活性。
附图的简要描述
附图1A表示的是聚丙烯酰胺底物的机械性质。对具有一定的丙烯酰胺(利用靠近数据线的百分数进行表示)与双丙烯酰胺(利用交联剂进行表示)的比例范围的聚丙烯酰胺凝胶的剪切模量进行了测量。所述的剪切模量(G’)用帕斯卡(Pascal)进行表示，在聚合物的质量恒定时，交联剂的增加产生增加的剪切模量。将所述的丙烯酰胺的浓度从3％增加至12％，同样生成了在10至50000Pa范围内的高硬度。所述的实线代表的是一种橡胶样的网状物的理论硬度，如果每个交联具有有效弹性的话。B表示的是存在于坚硬的基质或者柔软的基质之上的人类间充质干细胞(hMSC)的细胞形状以及丝状肌动蛋白(F-actin)结构。C表示的是存在于柔软的凝胶以及玻璃之上的人类间充质干细胞的细胞形状以及丝状肌动蛋白结构。
附图2表示的是在人类间充质干细胞内进行的5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的导入。
附图3表示的是基质的硬度对于脂肪细胞的分化所产生的影响。A表示的是阳性细胞百分含量的图表。在每个系列中的第一个柱：油红O染色。第二个柱：过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)染色。
附图4表示的是被接种于坚硬的凝胶或者柔软的凝胶之上的星形细胞的丝状肌动蛋白(F-actin)结构。
附图5表示的是对于Rho的活性从柔软的凝胶到坚硬的凝胶之上的增加的量化。将星形细胞接种在具有各种不同硬度的聚丙烯酰胺凝胶之上。对Rho的三磷酸鸟苷(GTP)装载水平进行量化。
附图6表示的是黑素瘤细胞在坚硬的基质上延展的更好。面积的图示。
附图7表示的是黑素瘤细胞以相同的效率附着于柔软的凝胶以及坚硬的凝胶之上。
附图8表示的是存在于坚硬的凝胶之上的更大的黑素瘤细胞种群。
附图9表示的是根据本发明中的各种不同的实施方式，存在于具有不同的弹性的几种底物之上的人类间充质干细胞的图像。
附图10表示的是根据本发明中的各种不同的实施方式，存在于具有不同的弹性的底物之上的人类间充质干细胞中吸收的5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的量。
附图11表示的是(A-D)根据本发明中的各种不同的实施方式，对一种类似于3D的环境对于干细胞的形状以及增殖所产生的影响所进行的描述。
附图12表示的是根据本发明中的各种不同的实施方式，人类间充质干细胞对于脂肪形成性诱导培养基的应答。
附图13表示的是根据本发明中的各种不同的实施方式，利用骨诱导培养基对人类间充质干细胞进行刺激之后，利用茜素红(Alizarin Red)S显现的钙沉积。
附图14表示的是根据本发明中的各种不同的实施方式，制备一种体系的流程图，其中所述的体系被用来在成人干细胞中诱导静止状态，分化，以及增殖。
附图15表示的是对本发明所述的体系的实施方式的示意性说明。
发明的详细描述
本发明提供了具有在0.01-50千帕(kPa)的范围内的硬度的凝胶以及基质，制造上述凝胶以及基质的方法，以及保存间充质干细胞种群或者研究间充质干细胞的方法，其中在所述的方法中包括上述的凝胶以及基质。
在另外一种实施方式中，本发明中提供了一种制造纤维蛋白基质的方法，其中所述的纤维蛋白基质具有在150-750帕(Pa)的范围内的硬度，所述的方法包括使一种组合物发生聚合的步骤，其中所述的组合物包括纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白，从而制造出一种柔软的纤维蛋白基质，其中存在于所述柔软的纤维蛋白基质中的所述纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白的浓度为3-10毫克/毫升，并且利用一种包括粘附蛋白的组合物对所述的柔软的纤维蛋白基质进行了覆盖，从而制造出一种具有在150-750帕(Pa)的范围内的硬度的纤维蛋白基质。
在另外一种实施方式中，本发明中提供了一种诱导转化细胞的静止状态的方法，包括在本发明所述的一种凝胶或者基质中培养所述的转化细胞的步骤，从而诱导所述转化细胞的静止状态。在另外一种实施方式中，所述的转化细胞是一种癌症细胞。在另外一种实施方式中，所述的转化细胞是一种肿瘤细胞。在另外一种实施方式中，所述的转化细胞是本领域中已知的任何其他类型的转化细胞。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在本发明所述的方法以及组合物的另外一种实施方式中，所述的间充质干细胞种群的端粒酶长度是保持不变的。在另外一种实施方式中，“保持不变”指的是在所述的长度上缺少本质上的变化。在另外一种实施方式中，所述的术语指的是在所述的长度上缺少可以测量的变化。在另外一种实施方式中，所述的术语指的是在所述的长度上缺少足够的变化，用以影响增殖能力。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在本发明所述的方法以及组合物的另外一种实施方式中，所述的间充质干细胞种群被保持在一种静止的状态。在另外一种实施方式中，“静止的”指的是缺少明显的复制。在另外一种实施方式中，所述的术语指的是一种被显著降低的水平的复制。在另外一种实施方式中，所述的术语指的是占很大比例的细胞被停止在所述的细胞周期中。在另外一种实施方式中，所述的细胞停止在所述的G1阶段。在另外一种实施方式中，所述的细胞停止在所述的G2阶段。在另外一种实施方式中，“静止的”指的是本领域能够接受的对上述术语的任何其他的定义。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在一种实施方式中，当所述的干细胞是一种来自于骨髓的人类间充质细胞的实施方式中，所述的细胞外物质(ECM)具有大约250帕(Pa)的弹性，并且包括胶原质以及纤维粘连蛋白的混合物。在另外一种实施方式中，所述的胶原质是鼠尾胶原质，并且所述的纤维粘连蛋白是人类纤维粘连蛋白。所述的胶原质与纤维粘连蛋白的比例可以存在变化，并且在一种实施方式中，所述的胶原质与纤维粘连蛋白的比例为大约5∶1。可以使用骨胶原与纤维粘连蛋白的其他比例。本领域普通技术人员将意识到，可以通过其他的来源获得所述的胶原质以及纤维粘连蛋白，并且可以使用除胶原质以及纤维粘连蛋白之外的物质，用来呈递弹性并且与存在于所述的细胞膜表面上的整联蛋白进行结合，从而诱导所述细胞的静止状态。
根据本发明中的实施方式，通过使用一种底物与细胞外物质(ECM)进行耦联，为所述的细胞外物质提供一种适宜的表观弹性，这样一来含有所述的细胞外物质的干细胞能够感知到所述底物的弹性。相对应的，所述的底物可以是一种这样的材料，当其与所述的细胞外物质发生耦联时，所述的底物的弹性能够被含有所述细胞外物质的干细胞进行感知。在一些实施方式中，所述的底物是玻璃。在另外的实施方式中，所述的底物是一种具有250帕(Pa)的弹性的凝胶，或者是一种具有7500帕(Pa)的弹性的凝胶。这些凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶，并且，正如本领域技术人员所已知的，可以通过例如改变存在于所述凝胶制剂中的所述丙烯酰胺以及双丙烯酰胺的浓度，对所述的聚丙烯酰胺凝胶的弹性进行改变。可以在本发明所述的方法中使用的所述具有不同弹性的凝胶的制造对于依照本说明书的本领域技术人员而言将是显而易见的。
可以通过下述方式对一个干细胞的体内生物学环境的弹性进行测定：分离一种生理学组织样本，并且之后测量这一组织样本的剪切模量，其中所述的生理学组织来自于紧邻所述干细胞的体内环境中。用于制备以及测量所述的大鼠组织以及牛组织的弹性的范例性的过程在本说明书中进行了描述。下面的表格1提供了各种不同类型的组织的弹性：
表格1
  物种   组织   弹性(帕)(平均值+/-标准偏差)
  牛   骨髓   220+/-50
  大鼠   皮下脂肪   160+/-70
  大鼠   内脏脂肪   130+/-70
  大鼠   肝脏   403+/-28
  大鼠   骨骼肌   2251+/-166
在一种实施方式中，存在于250帕的凝胶之上的人类间充质干细胞(MSC)处于一种静止状态，等待着进一步的信号从而决定它们的命运。在一种实施方式中，所述的人类间充质干细胞将经受脂肪形成性分化(是由化学因子诱导的)，或者在另外的实施方式中，返回至所述的细胞周期中(通过将所述的细胞耦联至一种坚硬的表面之上来进行诱导)，或者进行成骨性分化(这似乎同时需要化学诱导以及坚硬的底物)。在一种实施方式中，利用脂肪形成性分化因子对培养在柔软的凝胶之上的细胞进行刺激，将生成显著高数量的累积细胞的脂质液滴。在一种实施方式中，成骨细胞的分化作用需要进行化学诱导。在一种实施方式中，对于同步的机械性刺激以及化学刺激的需求解释了人类间充质干细胞是怎样被划分到顺应性组织中去并且仍然抵抗自发性的分化作用的，其中所述的顺应性组织是例如骨髓。
与基质的弹性相类似，在另外一种实施方式中对于所述的细胞外配体的选择对人类间充质干细胞的粘附以及分化产生了强烈的影响。在各种不同的组织中发现了1型胶原质，其中所述的组织包括骨头以及动物性脂肪，并且所述的1型胶原质通常被用来作为底物进行细胞粘附试验。在一种实施方式中，在250帕的凝胶上，单独使用胶原质不能确保大部分细胞发生有效的粘附。在一种实施方式中，1型胶原质与纤维粘连蛋白以10∶1的比例组成的混合物提供了所述的细胞与所述的250帕凝胶之间的最佳粘附，并且不会对分化能力产生影响。
人类间充质干细胞(MSC)具有重新改造它们的微环境的能力，其中所述的重新改造是通过改变所述的基质金属蛋白酶的表达来实现的，并且在一种实施方式中，当实现了初始的强力粘附之后，这种能力帮助促进了有效的分化。
在一种实施方式中，当人类间充质干细胞被培养在柔软的凝胶之上，发育成一种圆形的表现型的时候，发生在人类间充质干细胞中的DNA合成急剧减少。这与其他的增殖性细胞类型相反，其中所述的增殖性细胞类型是例如NIH 3T3成纤维细胞，牛大动脉内皮细胞，以及NRK(大鼠肾细胞)上皮细胞，当这些细胞被培养在柔软的凝胶之上时，它们全部继续进行分化。因此，干细胞在250帕的凝胶上的静止状态并不是一种一般形态诱导的胞质***的失效，而是这些细胞对于底物顺应性的特异性的敏感性。因此并且在一种实施方式中，本发明提供了一种将干细胞保持在一种静止状态下的方法，包括将所述的干细胞悬浮在一种纤维粘连蛋白/胶原质凝胶之中，其中所述的纤维粘连蛋白/胶原质凝胶具有250帕的剪切模量(G’)。
在一种实施方式中，当非增殖性人类间充质干细胞出现在一种覆盖有蛋白凝胶基质的玻璃底物之上时，所述的细胞会发育成一种纺锤形态并且重新进入所述的细胞周期。在另外一种实施方式中，一种坚硬底物的存在改写了来自于顺应性基质的生理线索。在一种实施方式中，在不存在任何的化学诱导的前提下，在柔软的250帕凝胶之上，不存在能够通过神经突样的突起物来表现出神经元表现型的显著的细胞种群。
在一种实施方式中，底物的弹性对具有特异性表现型的细胞的分化作用进行调节。在另外一种实施方式中，机械性质不能单独指导干细胞的分化作用。这是因为存在于所述机体之中的几种组织具有相似的弹性。例如，大脑、脂肪、以及骨髓组织均具有大约200帕的贮能模量，然而全部能够维持独特的细胞种群。在另外一种实施方式中，体内的人类间充质干细胞在个体的骨髓中存储几十年并且仍然保留了多潜能性。在一种实施方式中，将人类间充质干细胞体外培养于坚硬的组织培养塑料之上并且能够保持几个阶段(several passages)的多潜能性。在一种实施方式中，所述的细胞同时对机械性刺激以及化学刺激进行了整合，用以确定所述细胞的应答。在另外一种实施方式中，尽管化学刺激能够改写所述的底物机械学所带来的影响，在另外的实施方式中，一种不适当的机械环境能够阻止针对化学激动剂的正常的细胞应答。在一种实施方式中，仅仅当静止态的细胞的物理环境以及化学环境均发生改变，并且改变成能够刺激骨生成的环境时，作为其结果，静止态的细胞分化成为成骨细胞。因此并且在一种实施方式中，一种具有适宜弹性的基质具有维持一种静止态的多潜能性骨髓间充质干细胞种群的能力，其中所述的多潜能性骨髓间充质干细胞能够同时对驱动增殖以及分化的机械性刺激以及化学刺激产生应答。
附图14描述的是根据本发明中的各种不同的实施方式，制备一种体系的实施方式的流程图，其中所述的体系被用来在成人干细胞中诱导静止状态，分化作用，以及增殖作用。丙烯酰胺以及双丙烯酰胺的溶液是在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中制备得到的，制得的总体积为500微升。在一种实施方式中，对所述的丙烯酰胺以及双丙烯酰胺的浓度进行调整能够获得很宽范围的硬度。利用TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)以及过硫酸铵触发了聚合作用从而形成一种凝胶。在步骤601中，丙烯酰胺/双丙烯酰胺(聚丙烯酰胺)溶液(Acrylamide/bisacrylamide(polyacrylamide)solution)，将所述的聚合凝胶的一个液滴(例如，大约200微升)沉积在一个玻璃盖片之上，其中所述的玻璃盖片在此之前利用3-氨基丙基三甲氧基硅烷以及戊二醛进行了修饰。在步骤602中，利用存在于甲苯之中的N-羟基琥珀酰亚胺进行覆盖，向步骤601中所述的溶液中施加大约15微升存在于甲苯之中的2％的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，并且，在步骤603中，顶端盖片(TopCoverslip)，将一种经过氯硅烷化的盖片放置于所述液滴之上。在步骤604中，除去盖片(Remove coverslip)，当聚合作用完成之后将上述的顶端盖片除去并且，任选的，利用紫外光对所述的凝胶进行大约10-15分钟的照射(未示出)。在步骤605中，细胞外物质(ECM)配体(ECM ligand)，使存在于所述的凝胶之上的N-琥珀酰亚胺丙烯酸酯与一种细胞外物质配体进行反应，所述的细胞外物质配体在一种实施方式中为0.1毫克/毫升的1型胶原质与0.02毫克/毫升的纤维粘连蛋白的混合物。在一个进一步的步骤中(未描述)，利用磷酸盐缓冲溶液(PBS)对所述的凝胶进行3次洗涤并且将其保留在磷酸盐缓冲溶液中直至步骤606，存在于凝胶之上的细胞(Cells on gel)，当干细胞被接种在所述的凝胶之上时，当来自于骨髓的间充质干细胞被接种在这种材料之上时，细胞变为静止状态，即使在存在能够引起增殖作用或者分化作用的化学刺激的情况下。
因此并且在一种实施方式中，本发明提供了一种在体外诱导或者维持成体干细胞的静止状态并且保持成体干细胞的生物学活性的方法，包括：将所述的成体干细胞与一种凝胶基质进行接触，其中所述的凝胶基质中包括一种细胞外物质，能够与存在于所述的成体干细胞的膜上的整联蛋白发生结合；所述的凝胶基质所具有的弹性与同样类型的体内成体干细胞的主要体内生物学微环境所具有的弹性在本质上是类似的；并且向所述的成体干细胞提供营养物质，用以在体外维持所述成体干细胞的生物学活性。
在本发明所述的一种方法，可以通过各种不同的方式使干细胞与适宜的细胞外物质(ECM)进行接触。例如，正如本说明书中所描述的，所述的细胞外物质(ECM)可以形成一种层，与所述的底物进行耦联，并且所述的干细胞可以被放置于所述的细胞外物质之上。可以选择的，可以将所述的细胞放置于一种细胞外物质之上，其中所述的细胞外物质与所述的底物进行了耦联，并且另外使用被放置于所述的细胞之上的细胞外物质与所述的细胞进行接触，例如通过在所述的细胞之上放置一种与底物进行了结构耦联的细胞外物质的方式，从而向所述的干细胞呈递适宜的表观弹性。
在另外一种实施方式中，可以存在两种细胞外物质制剂：第一种制剂与所述的底物进行了耦联，其中所述的制剂中可以包括或者可以不包括营养物质；而第二种制剂中包括营养物质并且其不与所述的底物进行耦联。用于将干细胞与一种适宜的细胞外物质(包括底物以及，任选的，连接材料，用于将所述的底物与所述的细胞外物质进行连接)进行接触的结构以及构象在本说明书中进行了描述，包括例如附图6中的描述，并且根据本说明书，对于本领域技术人员而言是显而易见的。
在本发明所述的方法的实施方式中，根据本发明所述的方法，将不处于一种静止状态下的干细胞与细胞外物质进行接触，这样一来静止状态被导入到所述的细胞当中并且其从一种非静止状态转变到一种静止状态下。在其他的实施方式中，根据本发明所述的方法将一种静止态的干细胞与细胞外物质进行接触，这样一来静止状态被保持在所述的细胞当中并且其不会从一种静止状态中发生转变。
因此并且在一种实施方式中，本发明提供了一种对间充质干细胞的发育进行调节的方法，所述的方法包括将所述的间充质干细胞悬浮在一种凝胶基质中的步骤，所述的凝胶基质中包括一种胶凝剂，其中所述的凝胶基质被1型胶原质、纤维粘连蛋白或者它们的组合进行了覆盖并且其中所述的凝胶基质被保持在一种预先确定的硬度下；以及将所述的凝胶基质暴露在一种生长调节因子之中，其中暴露在所述的化学因子或者物理因子之中能够导致所述的凝胶基质的硬度的增加，所述的硬度能够被增加到与所述的细胞外物质的硬度相一致的程度，其中所述的细胞外物质存在于被认为间充质干细胞进行分化的微环境中。
在另外一种实施方式中，所述细胞中超过80％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少80％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过70％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少70％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过75％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少75％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过82％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少82％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过85％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少85％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过87％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少87％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过90％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少90％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过92％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少92％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过93％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少93％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过94％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少94％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过95％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少95％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过96％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少96％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过97％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少97％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过98％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少98％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中超过99％的细胞的细胞周期被停止。在另外一种实施方式中，所述细胞中至少99％的细胞的细胞周期被停止。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了50％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了60％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了65％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了70％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了75％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了80％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了85％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了90％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了95％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了97％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了超过97％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了超过98％。在另外一种实施方式中，相对于存在于组织培养皿中的复制而言，复制被减少了超过99％。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中的一种方法中进一步包括随后的(例如，在进行培养之后，其中在所述的培养中存在本发明所述的凝胶或者基质)将所述的间充质干细胞种群放置于(plating)一种组织培养仪器中的步骤。在另外一种实施方式中，所述的组织培养仪器中含有诱导培养基。在另外一种实施方式中，通过化学诱导来完成所述的随后的放置步骤。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明提供了一种研究间充质干细胞的增殖作用或者分化作用的方法，包括在一种凝胶或者基质中对所述的间充质干细胞进行培养的步骤，其中所述的凝胶或者基质具有的硬度在150-750帕的范围内，从而对间充质干细胞的增殖作用或者分化作用进行研究。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的脂肪细胞种群是一种包括脂肪细胞的种群。在另外一种实施方式中，所述的种群中富含脂肪细胞。在另外一种实施方式中，所述的种群是一种被部分纯化的脂肪细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的脂肪细胞是从一种生物学来源中分离出来的，并且随后进行了纯化步骤或者富集步骤。在另外一种实施方式中，从所述的生物学来源中进行分离之后进行培养。在另外一种实施方式中，从所述的生物学来源中进行分离之后，进行培养步骤以及纯化步骤或者富集步骤。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的所述细胞种群是在有本发明中所述的方法以及组合物中的凝胶或者基质的存在下进行培养的。在另外一种实施方式中，所述的细胞种群被培养在所述的凝胶或者基质之中。在另外一种实施方式中，所述的细胞种群被培养在所述的凝胶或者基质之上。在另外一种实施方式中，所述的细胞种群被培养在一种组织培养仪器中，所述的组织培养仪器中含有所述的凝胶或者基质。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，“间充质干细胞种群”指的是一个包括间充质干细胞(MSC)的种群。在另外一种实施方式中，所述的种群中富含间充质干细胞。在另外一种实施方式中，所述的种群是一种被部分纯化的间充质干细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的间充质干细胞是从一种生物学来源中分离出来的，并且随后进行了纯化步骤或者富集步骤。在另外一种实施方式中，从所述的生物学来源中进行分离之后进行培养。在另外一种实施方式中，从所述的生物学来源中进行分离之后，进行培养步骤以及纯化步骤或者富集步骤。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的“间充质”细胞是从骨髓中分离出来或者纯化出来的。在另外一种实施方式中，所述的细胞是来自于骨髓的间充质干细胞。在另外一种实施方式中，所述的细胞是从脂肪组织中被分离出来或者纯化出来的。在另外一种实施方式中，所述的细胞是从软骨中被分离出来或者纯化出来的。在另外一种实施方式中，所述的细胞是从本领域已知的任何其他组织中被分离出来或者纯化出来的。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的凝胶或者基质具有150-750帕斯卡(Pa)的硬度。在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的凝胶或者基质具有150-750帕的剪切模量。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的凝胶或者基质具有与一种生物学组织相当的硬度。在另外一种实施方式中，所述的生物学组织是骨髓。在另外一种实施方式中，所述的生物学组织是脂肪组织。在另外一种实施方式中，所述的生物学组织是本领域已知的任何其他生物学组织。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在一种实施方式中，本发明中所描述的所述凝胶基质能够形成各种不同强度的凝胶，这取决于它们的结构以及浓度，并且在另外一种实施方式中，取决于环境因素例如离子强度，pH以及温度。在一种实施方式中被称作“粘弹性”的组合的粘性以及胶凝行为是通过测定一种振荡力对所述的物质的运动所产生的作用来检查的。在另外一种实施方式中，弹性模量(G’)，粘性模量(G”)，以及复数粘度(η*)被认为是使用本发明中所描述的方法而被改变的参数，并且在另外一种实施方式中通过伴随时间对应力或者应变(strain)进行协调的改变，从而对这些参数进行分析(表格2)。这些参数来自于所述的复数模量(G*)以及相位角(δ)，其中所述的复数模量是最大应力与最大应变(strain)的比例，所述的相位角是脱离相位的所述应力以及应变(strain)的角度。
表格2.动力学模量，相位角(δ)，以及频率(ω)之间的关 系
  条目   象征符号   定义   所提供的信息
  复数模量   G*   [(G’)2+(G”)2]0.6   全部的粘弹性特征
  条目   象征符号   定义   所提供的信息
  弹性模量贮能模量   G’   G*cosδ   每个形变周期中所贮存的能量；固体样行为或者弹性行为
  粘性模量损失模量   G”   G*sinδ   每个形变周期中所消散的能量；流体样行为或者粘性行为
  复数粘度   η*   G*/ω   粘弹性流体
在一种实施方式中，在本发明所描述的凝胶基质中，由剪切应力所导致的某些形变是弹性的并且当所述的力量被去除时所述的形变将还原为零。其他的形变，例如在一种实施方式中，通过链(chains)在所述溶剂中的滑动易位所产生的形变将不会在所述的力量被去除时还原为零。在一种恒定的力量之下，所述的弹性易位在一种实施方式中保持恒定，而所述的滑动易位继续进行这样的增加。
在一种实施方式中，所述的术语“弹性的”或者“弹性”以及类似的术语指的是本发明中所描述的凝胶基质的一种物理性质，也就是所述的凝胶在机械力量之下的形变能力以及当所述的形变力量被去除时，所述的凝胶保持其原始形状的能力。在另外一种实施方式中，所述的术语“弹性模量”指的是杨氏模量(Young’s Modulus)并且是对于一种比例的测量，其中所述的比例是沿所述物质的一个轴上的单轴向应力与沿该轴的伴随而来的正应变(strain)所形成的比例。
所述的剪切模量(来自于改变的应变)指的是所述的剪切应力与所述的剪切应变所形成的比例。所述的剪切模量遵循下述来自于与上文内容相类似的复数关系的公式：
G*＝G’+iG”
其中G*是所述的复数剪切模量，G’是所述的相内(in-phase)贮能模量，i是一种物质相关性因子并且G”是脱离相位的导致相似性的损失模量；G*＝E(G’2+G”2)。这些参数发生交叉的频率与所述物质的特异性的松弛时间(τ)相符合。
在一种实施方式中，本发明中所描述的凝胶基质的线性粘弹性性质是通过在振荡式剪切流体中进行的测量来确定的，其中所述的振荡式剪切流体是小振幅的并且具有变化的角频率。所述G’的数值以及G”的数值在这里在很大程度上是由存在于所述的水溶液之中的纤维素衍生物的浓度以及所述的代表性粘度数值的量级来决定的。因此，在下文中，仅仅需要考虑具有增加的角频率ω的G’以及G”的相关过程(relative course)。在一种实施方式中，在浓度为1.5％至2％(重量/重量)的纤维素衍生物水溶液中并且在温度为大约20℃的条件下，所述的G’以及G”对于所述的纤维素衍生物的行为是这样的：在低角频率(ω)下时，所述的贮能模量G’小于所述的损失模量G”，但是随着角频率的增加，G’比G”增加的更多。在另外一种实施方式中，当超过了某个角频率时，G’最终变得高于G”，并且具有高数值的角频率的所述溶液因此主要产生弹性作用。使用本发明中所描述的调节方法能够对这种行为进行削弱或者改变。
在另外一种实施方式中，所述的术语“弹性”指的是一种物质的物理性质，其中所述的物理性质定义了所述物质受到应力导致形变的能力，无论所述的形变是否是可逆的。正如在本说明书中所使用的，弹性以及硬度是呈逆相相关的，并且一种物质的弹性(硬度)可以使用RFS III流体分光流变仪进行测量，所述的流体分光流变仪可以从Rheometrics，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西(NJ)处获得，在所述的测量中使用了2％的振荡剪切应变，频率为每秒10弧度(radian)。可以使用本领域技术人员已知的各种方法中的任何一种对细胞以及其他生理学组织的弹性以及其他10种流变学性质进行测量。作为例子，这样的方法可能涉及到流变仪或者原子力显微镜的使用(参见，例如，EnglerAJ，Rehfeldt F，Sen S，Discher DE于2007年在Methods Cell Biol.《分子生物学方法》83：521-45；15中发表的文章“Microtissueelasticity：measurements by atomic force microscopy and itsinfluence on cell differentiation《通过原子力显微镜测量得到的微组织弹性及其对细胞的分化作用所产生的影响》”；Yeung T，Georges PC，Flanagan LA，Marg B，Ortiz M，Funaki M，Zahir N，Ming W，Weaver V，Janmey PA于2005年1月在Cell MotilCytoskeleton《细胞运动性以及细胞骨架》60(1)：24-34中发表的文章“Effects of substrate stiffness on cell morphology，cytoskeletal structure，and adhesion《底物硬度对于细胞的形态学、细胞骨骼的结构、以及粘附作用所产生的影响》”)。
在一种实施方式中，所述的术语“本征粘度([η*])”指的是外推到零浓度的所述降低的粘度的极限。与所述降低的粘度相同，其具有的单位为浓度的倒数，例如，毫升 克-1。
在一种实施方式中，硬度或者坚硬度，指的是所观察到的或者所测量到的G’值。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的凝胶或者基质被一种包括粘附蛋白的溶液进行了覆盖。在另外一种实施方式中，所述的粘附蛋白是胶原质。在另外一种实施方式中，所述的粘附蛋白是1型胶原质。在另外一种实施方式中，所述的粘附蛋白是纤维粘连蛋白。在另外一种实施方式中，所述的粘附蛋白是本领域已知的任何其他的粘附蛋白。在另外一种实施方式中，所述的凝胶或者基质被一种包括了粘附蛋白的组合的溶液进行了覆盖。在另外一种实施方式中，所述的凝胶或者基质被一种包括了胶原质以及纤维粘连蛋白的溶液进行了覆盖。在另外一种实施方式中，所述的凝胶或者基质被一种包括了1型胶原质以及纤维粘连蛋白的溶液进行了覆盖。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的胶原质是一种重组胶原质。在另外一种实施方式中，所述的胶原质是从一种生物学来源中纯化出来的。在另外一种实施方式中，所述的胶原质是1型胶原质。在另外一种实施方式中，所述的胶原质是本领域已知的任何其他类型的胶原质。每一种可能性代表着本发明的一个单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的纤维粘连蛋白是一种重组纤维粘连蛋白。在另外一种实施方式中，所述的纤维粘连蛋白是从一种生物学来源中纯化出来的。在另外一种实施方式中，所述的纤维粘连蛋白是1型纤维粘连蛋白。在另外一种实施方式中，所述的纤维粘连蛋白是本领域已知的任何其他类型的纤维粘连蛋白。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的胶凝剂是丙烯酰胺。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是一种丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂中包括丙烯酰胺。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂中包括一种丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的丙烯酰胺凝胶中所具有的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺的比例在100∶1至30∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的丙烯酰胺凝胶是从一种溶液中制备得到的，所述的溶液中所具有的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺的比例在100∶1至30∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在100∶1至20∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺的比例在100∶1至40∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在100∶1至50∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在100∶1至60∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在100∶1至70∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在120∶1至30∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在120∶1至40∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在120∶1至50∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在120∶1至60∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在120∶1至70∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在90∶1至20∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在90∶1至30∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在90∶1至40∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在90∶1至50∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在90∶1至60∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在80∶1至20∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在80∶1至30∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在80∶1至40∶1之间。在另外一种实施方式中，所述的比例在80∶1至50∶1之间。
在另外一种实施方式中，所述的比例是30∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是20∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是25∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是35∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是40∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是45∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是50∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是55∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是60∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是65∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是70∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是75∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是80∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是85∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是90∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是95∶1。在另外一种实施方式中，所述的比例是100∶1。
每一个丙烯酰胺∶双丙烯酰胺的比例代表着本发明的一个单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的丙烯酰胺凝胶具有3-5％的总丙烯酰胺浓度。在另外一种实施方式中，所述的丙烯酰胺凝胶是从一种溶液中制备得到的，所述的溶液中具有3-5％的总丙烯酰胺浓度。在另外一种实施方式中，所述的总丙烯酰胺浓度为2％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2.5％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3.5％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为4％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为4.5％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为5％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为5.5％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为6％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-5％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2.5-5％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3.5-5％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-4％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-4.5％。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-5％。每一种可能性代表着本发明的一个单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的胶凝剂是一种纤维蛋白。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是一种纤维蛋白原蛋白。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白原的凝血因子被耗尽。每一种可能性代表着本发明的一个单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，存在于本发明中所述的方法以及组合物中的凝胶或者基质中的所述重组纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白的浓度为3-10毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3-12毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3-9毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3-8毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3-7毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3-6毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-12毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-10毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-9毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-8毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-7毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2-6毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为4-12毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为4-10毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为4-9毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为4-8毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为4-7毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为5-12毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为5-10毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为5-9毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为5-8毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为2.5毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为3.5毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为4毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为4.5毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为5毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为6毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为7毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为8毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为9毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为10毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为11毫克/毫升。在另外一种实施方式中，所述的浓度为12毫克/毫升。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白是一种异温动物的纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白是一种恒温动物的纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白或者纤维蛋白原来自于一种鱼。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白或者纤维蛋白原来自于一种鲑鱼。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白或者纤维蛋白原来自于本领域已知的任何其他鱼类。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白或者纤维蛋白原来自于本领域已知的任何其他异温动物。在另外一种实施方式中，所述的纤维或者纤维蛋白原来自于一种哺乳动物。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白或者纤维蛋白原是人类纤维蛋白或者纤维蛋白原。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白或者纤维蛋白原是牛纤维蛋白或者纤维蛋白原。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白或者纤维蛋白原来自于本领域已知的任何其他哺乳动物。在另外一种实施方式中，所述的纤维蛋白或者纤维蛋白原来自于本领域已知的任何其他恒温动物。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是琼脂糖。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是琼脂。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是粘多糖。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是胶原质。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是角叉菜。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是角叉菜胶。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是刺槐豆胶。在另外一种实施方式中，所述的胶凝剂是丙三醇。在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的胶凝剂是本领域已知的任何其他胶凝剂。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的凝胶或者基质是一种二维的凝胶或者基质。在另外一种实施方式中，所述的凝胶或者基质是一种三维的凝胶或者基质。在另外一种实施方式中，所述的凝胶或者基质是本领域已知的任何其他类型的凝胶或者基质。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的凝胶或者基质中进一步包括一种动物血清。在另外一种实施方式中，所述的动物血清是一种胎牛血清。在另外一种实施方式中，所述的动物血清是一种小牛血清。在另外一种实施方式中，所述的动物血清是一种马血清。在另外一种实施方式中，所述的动物血清是本领域已知的任何其他类型的含有生长因子的动物血清。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的凝胶或者基质中进一步包括一种蛋白酶抑制剂。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的蛋白酶抑制剂对一种肽酶的功能进行抑制。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶抑制剂是一种蛋白。在一些实施方式中，所述的蛋白酶抑制剂是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，胰蛋白酶抑制剂，苏氨酸蛋白酶抑制剂，天冬氨酸蛋白酶抑制剂，或者金属蛋白酶抑制剂。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶抑制剂是一种***性抑制剂，转化态抑制剂，或者是一种螯合剂。
在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶抑制剂是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF-HCl)。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是(ε)-氨基己酸。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是(α)1-抗胰糜蛋白酶。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是抗凝血酶III。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是(α)1-抗胰蛋白酶([α]1-蛋白酶抑制剂)。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是APMSF-HCl(4-脒基苯基-甲烷磺酰基-氟)。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是抑肽酶。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是盐酸苯甲脒。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是胰凝乳蛋白酶。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是DFP(二异丙基氟-磷酸盐)。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是亮抑酶肽。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是
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SC(4-(2-氨基乙基)-苯磺酰基氟盐酸盐)。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是PMSF(苯甲基磺酰基氟)。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是TLCK(1-氯-3-甲苯磺酰基氨-7-氨基-2-庚酮盐酸盐)。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是TPCK(1-氯-3-甲苯磺酰基氨-4-苯基-2-丁酮)。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是来自于卵白中的胰蛋白酶抑制剂(卵内粘蛋白)。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是来自于大豆的胰蛋白酶抑制剂。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是抑肽酶。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是喷他脒羟乙磺酸盐。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是抑肽素。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是一种锌螯合剂。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是碘乙酸。在另外一种实施方式中，所述的抑制剂是锌。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，在本发明中所述的方法以及组合物中所利用的蛋白酶抑制剂的剂量为0.1毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶抑制剂的剂量为0.2毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.3毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.4毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.6毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.8毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为1毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为1.5毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为2毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为2.5毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为3毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为5毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为7毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为10毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为12毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为15毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为20毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为30毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为50毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为70毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为100毫克/升。
在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶抑制剂的剂量为0.1-1毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶抑制剂的剂量为0.2-1毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.3-1毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.5-1毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.1-2毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.2-2毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.3-2毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为0.5-2毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为1-2毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为1-10毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为2-10毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为3-10毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为5-10毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为1-20毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为2-20毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为3-20毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为5-20毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为10-20毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为10-100毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为20-100毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为30-100毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为50-100毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为10-200毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为20-200毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为30-200毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为50-200毫克/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为100-200毫克/升。
在另外一种实施方式中，在本发明中所述的方法以及组合物中所利用到的蛋白酶抑制剂的剂量为1000k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为10k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为12k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为15k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为20k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为30k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为40k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为50k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为70k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为100k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为150k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为200k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为300k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为500k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为700k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为1500k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为3000k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为4000k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。在另外一种实施方式中，所述的剂量为5000k.i.u.(激肽释放酶抑制单位)/升。
蛋白酶抑制剂的每一种剂量代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，被本发明中所述的方法以及组合物中的蛋白酶抑制剂作用的所述蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶是胰蛋白酶。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶是胰凝乳蛋白酶。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶是羧基肽酶。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶是氨基肽酶。在另外一种实施方式中，所述的蛋白酶是能够在所述的十二指肠或者小肠中发挥作用的任何其他的蛋白酶。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的间充质干细胞种群是一种成人间充质干细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的间充质干细胞种群是一种青少年间充质干细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的间充质干细胞种群是一种婴幼儿间充质干细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的间充质干细胞种群是一种胎儿间充质干细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的间充质干细胞种群是一种人类间充质干细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的间充质干细胞种群来自于本领域已知的任何动物。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种造血干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种脂肪细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种内皮祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种神经干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种居住在成人组织中的祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种居住在成人组织中的胰腺祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种再生性天然β-细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种胃肠干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种肝胰腺上皮干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种表皮干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种肠内上皮干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种视网膜干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种神经元上皮干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种肌肉干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种内皮干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种外周血干细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是本领域已知的任何其他类型的干细胞。
在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种软骨形成性祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种脂肪形成性祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种骨髓基质祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种肌形成性祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种骨形成性祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种肌键祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是本领域已知的任何其他类型的祖细胞。
在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种后代细胞类型。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种软骨细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种基质细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种肌管细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种骨细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是一种肌键细胞。在另外一种实施方式中，所述的感兴趣的细胞类型是本领域已知的任何其他类型的后代细胞。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法中进一步包括在一种诱导培养基中对所述的间充质干细胞进行培育的步骤。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种成骨细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种造血干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种脂肪细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种内皮祖细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种神经干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种居住在成人组织中的祖细胞的诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种居住在成人组织中的胰腺祖细胞的诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种再生性β-细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种胃肠干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种肝胰腺上皮干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种表皮干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种肠内上皮干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种视网膜干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种神经元上皮干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种肌肉干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种内皮干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种外周血干细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是本领域已知的任何其他类型的诱导培养基。
在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种祖细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种软骨形成性祖细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种脂肪形成性祖细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种骨髓基质祖细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种肌形成性祖细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种骨形成性祖细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是一种肌键祖细胞诱导培养基。在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是本领域已知的任何其他类型的祖细胞诱导培养基。
在另外一种实施方式中，所述的诱导培养基是本领域已知的任何其他类型的诱导培养基。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的培养步骤进行至少5天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少4天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少6天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少7天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少8天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少10天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少12天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少15天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少20天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少25天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少30天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少35天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少40天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少50天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行至少60天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过4天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过6天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过7天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过8天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过10天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过12天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过15天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过20天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过25天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过30天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过35天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过40天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过50天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤至少进行超过60天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行4天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行6天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行7天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行8天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行10天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行12天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行15天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行20天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行25天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行30天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行35天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行40天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行50天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行60天的时间。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤进行超过60天的时间(at over 60 days)。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，在本发明中所述的凝胶或者基质之中对所述的间充质干细胞种群进行培养的步骤之前，进行下述步骤：在一种组织培养仪器中对所述的间充质干细胞进行培养。在另外一种实施方式中，所述的组织培养仪器是一种培养皿。在另外一种实施方式中，所述的组织培养仪器是一种培养板。在另外一种实施方式中，所述的组织培养仪器是一种长颈瓶。在另外一种实施方式中，所述的组织培养仪器是一种烧瓶。在另外一种实施方式中，所述的组织培养仪器是一种试管。在另外一种实施方式中，所述的组织培养仪器是本领域已知的任何其他类型的组织培养仪器。在另外一种实施方式中，在进行所述的培养步骤之前进行下述步骤：在一种组织培养介质中对所述的间充质干细胞进行培养，其中所述的组织培养介质中例如不存在本发明中所述的凝胶或者基质。在另外一种实施方式中，所述的在一种组织培养仪器或者在组织培养介质中对所述的细胞进行培养的步骤是在将所述的间充质干细胞种群从一种生物学样本中分离出来之后再进行的。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤是在将所述的间充质干细胞种群从一种生物学样本中纯化出来之后再进行的。在另外一种实施方式中，所述的培养步骤是在对存在于一种生物学样本中的所述间充质干细胞种群进行富集之后再进行的。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，在本发明中所述的凝胶或者基质之中对所述的间充质干细胞种群进行培养的步骤是在将所述的间充质干细胞种群从一种生物学样本中分离出来之后直接进行的。在另外一种实施方式中，所述的进行培养的步骤是在将所述的间充质干细胞种群从一种生物学样本中纯化出来之后直接进行的。在另外一种实施方式中，所述的进行培养的步骤是在对存在于一种生物学样本中的所述间充质干细胞种群进行富集之后直接进行的。在另外一种实施方式中，“直接”指的是不存在首先在一种组织培养仪器中进行培养的培养步骤。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的所述祖细胞种群是一种造血干细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的祖细胞种群是一种内皮细胞前体种群。在另外一种实施方式中，所述的祖细胞种群是一种卫星细胞种群(例如，肌细胞前体)。在另外一种实施方式中，所述的祖细胞种群是一种短暂增殖(transit-amplifying)神经祖细胞沿喙侧迁移流种群。在另外一种实施方式中，所述的祖细胞种群是一种骨髓基质细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的祖细胞种群是本领域已知的任何其他的祖细胞种群。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，“祖细胞种群”指的是一种包括祖细胞的种群。在另外一种实施方式中，所述的种群中富含祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的种群是一种经过部分纯化的祖细胞种群。在另外一种实施方式中，所述的祖细胞是从一种生物学来源中分离出来的，之后对其进行了纯化步骤或者富集步骤。在另外一种实施方式中，从所述的生物学来源中进行分离之后对其进行了培养。在另外一种实施方式中，从所述的生物学来源中进行分离之后对其进行了培养步骤以及纯化步骤或者富集步骤。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中提供了一种将转化细胞分化成为一种分化的细胞类型的方法，包括在本发明所述的一种凝胶或者基质中对所述的转化细胞进行培养的步骤，从而使所述的转化细胞分化成为一种分化的细胞类型。在另外一种实施方式中，所述的分化的细胞类型是一种祖细胞。在另外一种实施方式中，所述的分化的细胞类型是一种后代细胞类型。在另外一种实施方式中，所述的分化的细胞类型是一种组织细胞类型。在另外一种实施方式中，所述的分化的细胞类型是上述细胞类型中的一种。在另外一种实施方式中，所述的分化的细胞类型是本领域已知的任何其他类型的分化的细胞类型。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，通过本发明中所述的方法制备得到的细胞或者细胞种群被用来在宿主体内对损伤组织进行替代。在另外一种实施方式中，通过本发明中所述的方法制备得到的细胞或者细胞种群被用来作为载体，用于抗癌症试剂中(参见KassemM于2006年5月在Ann N Y Acad Sci.《纽约科学研究会年报》1067：436-42中发表的文章)。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
用于确定间充质干细胞的增殖能力以及分化潜能的方法是本领域熟知的，并且在例如下述文献中进行了描述：Baxter M等人(于2004年在Stem Cells《干细胞》22(5)：675-82中发表的文章Study of telomere length reveals rapid aging of human marrowstromal cells following in vitro expansion《对于端粒长度的研究揭示了人类骨髓基质细胞在经过体外膨胀之后的快速老化》)，Liu L等人(于2004年3月10日在Exp Cell Res.《实验细胞研究》294(1)：1-8中发表的文章Telomerase deficiency impairsdifferentiation of mesenchymal stem cells《端粒酶缺陷对于间充质干细胞的分化作用的削弱》)，以及Bonab MM等人(于2006年3月10日在BMC Cell Biol.《BMC细胞生物学》7：14中发表的文章Aging of mesenchymal stem cell in vitro《间充质干细胞的体外老化》)。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物的一项优点在于不存在所述的间充质干细胞的永生化作用。在另外一种实施方式中，所述的一项优点在于不存在来自于间充质干细胞种群的癌症细胞的进化。在另外一种实施方式中，所述的一项优点在于对于所述的目标细胞分化成多种细胞类型的能力的保持。在另外一种实施方式中，所述的一项优点在于对于所述细胞的增殖能力的保持。在另外一种实施方式中，所述的一项优点在于对于所述细胞支持造血细胞生长的能力的保持。在另外一种实施方式中，所述的一项优点在于所述的目标细胞不需要经过接触抑制作用而进行分化的能力。在另外一种实施方式中，所述的分化作用是对增殖作用的抑制作用的结果。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在一种实施方式中，本发明中提供了诱导一种静止态的成体干细胞的增殖作用的方法。已经发现，将一种干细胞与一种物质进行接触，能够有效的诱导所述干细胞的增殖作用，其中所述的物质所具有的弹性小于同样类型的所述干细胞所天然存在的体内微环境所具有的弹性。本发明中的实施方式因此包括：将所述的成体干细胞与一种物质进行接触，其中所述的物质包括与存在于所述的细胞膜表面上的整联蛋白发生连接的化合物，并且所述的物质对于所述干细胞所产生的表观弹性小于存在于体内成体干细胞的生物学微环境中的主要物质所具有的弹性，其中所述的体内成体干细胞与所述的成体干细胞具有相同的类型。例如，可以通过将静止态的干细胞放置于载玻片上，来诱导所述静止态干细胞的增殖作用，其中所述的载玻片具有高于1吉帕斯卡(gigaPascal)(大多数人类组织类型或者动物组织类型所具有的弹性的一个小的分数)的硬度并且所述的载玻片被一种物质进行了覆盖，其中所述的物质与存在于所述细胞之上的整联蛋白进行了接触。在其他的实施方式中，可以通过将所述的细胞与一种物质进行接触的方式对一种干细胞的增殖作用进行诱导，其中所述的物质对所述细胞所产生的表观弹性小于所述的干细胞的体内自然微环境所具有的弹性的0.1。在其他的实施方式中，可以通过将所述的干细胞与一种物质进行接触的方式对其增殖作用进行诱导，其中所述的物质对所述的干细胞所产生的表观弹性小于所述的干细胞的体内自然微环境所具有的弹性的大约0.5倍(例如，大约0.4倍至大约0.5倍)。
在实施方式中，同样可以向所述的细胞提供营养性的生长物质，例如，包括生长因子以及血清，用于对所述干细胞及其体外后代的增殖作用进行促进并且维持它们的生物学活性。对于特定的细胞类型而言，所述的营养性生长物质的配制对于本领域技术人员而言是已知的，并且不需要对针对特定类型的干细胞的已知的营养性生长物质进行改变，来实现本发明的这个方面。
与本发明中的其他方面相同，这种增殖作用诱导方面的实施方式可以利用干细胞进行实现，其中所述的干细胞包括间充质干细胞(MSC)。所述的间充质干细胞可以从存活的组织中收集得到，正如本说明书中所描述的，或者其来自于其他来源例如体外培养物以及低温冻干的干细胞。这样的细胞可以呈现一种天然存在的静止状态或者呈现一种人工诱导的静止状态，并且例如可以包括这样的细胞，在所述的细胞中，其静止态是通过使用本发明中所述的方法来进行诱导或者进行维持的。因此，依照本发明中所述的方法对其增殖作用进行诱导的细胞可以包括来自于骨髓的间充质干细胞(MSC)，肾脏干细胞，肝脏干细胞，来自于骨骼肌的干细胞，来自于骨头的干细胞，牙髓间充质干细胞，来自于心肌的间充质干细胞，来自于滑液的间充质干细胞，脐带间充质干细胞，以及本领域技术人员依照本说明书能够识别出来的其他类型的细胞。
根据本发明所述的干细胞的增殖作用是可逆的，从而使得能够在一种细胞中诱导静止态以及增殖作用的交替状态。例如，可以使用本发明中所述的方法在一个干细胞中诱导并且维持静止态，例如通过将所述的干细胞与一种物质进行接触的方式，其中所述的物质包括与存在于所述的细胞表面之上的整联蛋白发生结合的化合物，并且所述的物质对所述细胞所产生的表观弹性与所述细胞的体内微环境所具有的弹性大致相同。之后可以通过将所述的细胞与一种物质进行接触的方式在所述的细胞中诱导增殖作用，其中所述的物质包括与整联蛋白发生连接的化合物并且所述的物质对所述的细胞所产生的表观弹性在本质上小于所述细胞的体内微环境所具有的弹性。随后可以通过将上述得到的子细胞与一种物质进行接触的方式诱导并且维持静止态，其中所述的物质包括整联蛋白结合化合物并且所述的物质对所述的细胞所产生的表观弹性与所述细胞的体内微环境大致相同。
在另外一种实施方式中，依照本发明中所述的方法将增殖的干细胞诱导进入一种静止状态。按照上面的描述，随后可以诱导这些静止态的细胞进行增殖。
本发明中进一步提供了诱导一种成体干细胞的分化作用的方法，依照本发明中所述的方法，在所述的成体干细胞中保持了其生物学活性并且在所述的成体干细胞中对静止态进行了诱导或者维持。本发明中这一方面的实施方式中包括将这样的细胞与一种分化物质进行接触的步骤，其中所述的分化物质中包括化学刺激，所选择的化学刺激能够刺激所述细胞的分化作用，使其分化成为一种预先确定的细胞类型，并且向所述的细胞提供一种分化细胞营养物质，用以维持所述的分化作用刺激型细胞的生物学活性。在一些实施方式中，可以在所述的接触步骤之前进行一个包括例如在体外对所述的成体干细胞的增殖作用进行诱导(或者许可)的步骤，其中所述的诱导(或者许可)是通过将所述的干细胞与一种物质进行接触的方式来实现的，所述的物质所具有的弹性小于意在进行分化作用的所述目标细胞的天然微环境所具有的弹性。
依照本发明，使用已知的方法或者依照本说明书对于本领域技术人员而言显而易见的方法可以在静止态干细胞或者增殖性干细胞中诱导分化作用，其中所述的干细胞的生物学活性被得以保持。例如，如果所述的干细胞是一种来自于人类骨髓的间充质干细胞，可以按照本说明书中详细描述的方法，通过将所述的细胞与一种存在于底物之上的脂肪形成培养基(如实施例1中所讨论的)进行接触的方式，可以将所述的细胞分化成为脂肪细胞，其中所述的底物具有大约250帕(Pa)的弹性。利用能够从本说明书中获得的信息或者按照本发明中所描述的信息，其中所述的信息关系到各种不同组织类型的流变能力以及被用来对干细胞进行诱导使其分化成为各种不同类型的细胞的分化培养基，本领域技术人员将能够显而易见的知晓：本发明中所描述的方法可以被用来对一种来自于人类骨髓的间充质干细胞进行诱导，使其分化成为至少下述细胞类型中的一种或者多种：成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，脂肪细胞，β-胰岛细胞，以及神经元细胞。更为常见的，利用关于各种不同的组织类型的流变能力方面以及用于对各种不同的干细胞类型的分化作用进行诱导使其分化成为各种不同类型的细胞的分化介质方面的信息，在本说明书中所识别出的任何类型的干细胞中对分化作用进行诱导对于本领域技术人员而言将是容易的显而易见的，将所述的干细胞分化成为下述细胞中的一种或者多种：成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，脂肪细胞，β-胰岛细胞，神经元细胞，或者另外的细胞类型。
在本发明中这个方面的实施方式中，所述的分化细胞与一种培养基进行了接触，其中所述的培养基中包括能够维持所述细胞的生物学活性的营养物质。例如，如果使用本发明中所述的方法对一种来自于人类骨髓的间充质干细胞进行诱导使其分化成为脂肪细胞，则为了保持它们的生物学活性，可以将上述得到的脂肪细胞与一种营养物质培养基进行接触。所述的营养物质培养基中可以包括DMEM(低葡萄糖)，胎牛血清，以及胰岛素。依照本说明书，其他的营养物质介质以及将分化细胞与它们进行接触的方法，对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
本发明中进一步提供了一种人造***，用于诱导或者维持一种成体干细胞的静止态及其可持续的生物学活性。在实施方式中，所述的***中包括一种用于接触干细胞的细胞外物质(ECM)配体物质，一种与所述的细胞外物质配体物质进行连接的底物物质，以及一种用于向所述的干细胞提供营养物质并且保持其生物学活性的培养基。所述的细胞外物质配体物质，当其与所述的底物物质进行连接时，其所具有的弹性与存在于所述的同样类型的体内干细胞的生物学微环境中的主要体内物质所具有的弹性相类似。所述的***的实施方式可以适合于在任何的细胞类型中进行静止态的诱导，其中在所述的任何的细胞类型中，可以根据本说明书中所描述的发明的方法对其静止态进行诱导。例如，所述的***的实施方式可以适合于在下述细胞中对静止态进行诱导：成体干细胞或者胚胎干细胞，人类干细胞或者动物干细胞，间充质成体干细胞(MSC)，来自于骨髓的间充质成体干细胞，肾脏干细胞，来自于肝脏的干细胞，来自于骨骼肌的间充质成体干细胞，来自于骨头的间充质成体干细胞，牙髓间充质成体干细胞，来自于心肌的间充质成体干细胞，来自于滑液的间充质成体干细胞，或者脐带间充质成体干细胞。
在实施方式中，当所述的细胞外物质配体物质与所述的底物发生连接并且与一种干细胞进行接触时，正如本说明书中详细描述的，所述的细胞外物质(ECM)物质与存在于所述的干细胞表面之上的整联蛋白发生结合，其中所述的结合是以能够诱导所述的干细胞进入静止态的方式来实现的。
在本发明中这样的***的实施方式中，可以存在一种连接物质，其中所述的连接物质将所述的细胞外物质(ECM)配体物质与所述的底物物质进行了连接。例如，当所述的底物物质中包括一种聚丙烯酰胺凝胶并且所述的细胞外物质(ECM)中包括一种胶原质-纤维粘连蛋白混合物时，所述的连接物质可以是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，尤其包括N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯。依据所述的底物物质以及所述的细胞外物质所具有的性质，本领域技术人员能够容易的确定出连接物质，所述的连接物质也可以被定义为交联剂，其被用来在本发明中所述的***的各种实施方式中将所述的底物物质与所述的细胞外物质进行连接。
在本发明中的实施方式中，当所述的细胞外物质(ECM)配体层与所述的底物发生耦联时，所述的细胞外物质配体层对所述的干细胞所产生的表观弹性在本质上与存在于一种体内干细胞的生物学微环境之中的主要物质所具有的弹性是相类似的，其中所述的体内干细胞与所述的跟细胞外物质配体层发生接触的干细胞的类型相同。所述的细胞外物质配体层所具有的这种表观弹性可以不依赖于所述底物的弹性，基本不依赖于所述底物的弹性，或者取决于所述底物的弹性。在实施方式中，所述的底物所具有的弹性在本质上与存在于一种体内干细胞的生物学微环境之中的主要物质所具有的弹性是相类似的，其中所述的体内干细胞与所述的跟细胞外物质配体层发生接触的干细胞的类型相同，并且所述的细胞外物质配体层呈递于所述干细胞的弹性在本质上等于其所耦联的所述底物所具有的弹性。
可以使用各种不同的结构对本发明中所述的人造***进行实施。在实施方式中，所述的底物物质形成了一种基质，并且所述的细胞外物质(ECM)被分散在所述的基质之中。在实施方式中，为了使所述的底物基质物质与所述的细胞外物质发生连接，还可以将一种连接物质分散在所述的底物基质之中。例如，根据一种实施方式，将胶原质(0.5毫克/毫升)与纤维粘连蛋白(0.1毫克/毫升)的5∶1的混合液以及一种N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯(NHS)交联剂分散在一种聚丙烯酰胺凝胶之中，其中所述的胶原质来源于鼠尾，所述的纤维粘连蛋白来源于人类。对所述的凝胶进行配制，使所述结构所具有的弹性为大约250帕。当来自于骨髓的间充质干细胞与所述的聚丙烯酰胺-N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯-纤维粘连蛋白-胶原质结构进行接触时，它们被诱导进入静止态。当同样向与所述结构发生接触的间充质干细胞提供适合的营养物质时，它们在静止状态下的生物学活性被得以保持。
在实施方式中，所述的底物物质形成了一种层，并且所述的细胞外物质(ECM)形成了一种与所述的底物层进行直接或者间接连接的层。在其他的实施方式中，所述的连接物质形成了一种连接层，所述的连接层将所述的细胞外物质配体层与所述的底物层进行了连接。所述的连接层能够将所述底物所具有的弹性呈递到所述的细胞外物质配体层中，其中所述的呈递是以能够让所述的细胞外物质配体层将这种弹性呈递到所述的干细胞中的方式来进行的，在所述的干细胞中进行了静止态的诱导。在一种实施方式中，所述的连接层中包括了适宜的交联组合物以及能够提供这类功能的其他物质。例如，所述的耦联层中可以包括N-羟基琥珀酰亚胺，或者在具体的实施方式中，可以包括N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯。
在实施方式中，所述的底物物质是一种聚丙烯酰胺凝胶。正如本领域中所已知的，可以通过对存在于所述凝胶之中的丙烯酰胺以及双丙烯酰胺的浓度进行改变，从而对所述的聚丙烯酰胺的弹性进行调整。依照本说明书，怎样制备聚丙烯烯胺或者用在本发明中所述的***之中的其他凝胶或者底物物质对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
正如依照本说明书将进一步显而易见的，实施方式中可以利用其他的结构。例如，通过下述方式可以建立一种准3D结构：将干细胞接种在上文中所描述的一种细胞外物质层之上，通过将所述的***浸没于带有细胞的培养基之中的方式，使所述的细胞沉积在所述的细胞外物质层上，并且在所述的细胞之上放置另外一种细胞外物质层，其中所述的另外一种细胞外物质层具有适宜的表观弹性，正如实施例1中所进一步描述的。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物所具有的一项优点在于所述的基质或者凝胶对于蛋白水解性降解所产生的抗性。在另外一种实施方式中，所述的一项优点在于所述的细胞对于活性重建所产生的抗性。在另外一种实施方式中，所述的一项优点在于异温动物(例如，鲑鱼)的纤维蛋白对于蛋白酶所产生的抗性，其中所述的蛋白酶是由哺乳动物的神经元所分泌的，并且其中所述的抗性是相较于哺乳动物(例如，人类或者牛)的纤维蛋白而言的。在另外一种实施方式中，所述的一项优点在于在异温动物(例如，鲑鱼)的纤维蛋白中传染性疾病转移的低发生率，这种低发生率是相较于哺乳动物(例如，人类或者牛)的纤维蛋白而言的。每一种可能性代表着本发明中的另外一种实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的所述目标细胞是一种永生化间充质干细胞。
在另外一种实施方式中，本发明中提供了一种诱导永生化间充质干细胞的生长停止的方法，包括在本发明所述的一种凝胶或者基质中对所述的永生化间充质干细胞进行培养的步骤，从而诱导所述的永生化间充质干细胞的生长停止。在另外一种实施方式中，本发明中提供了一种抑制永生化间充质干细胞种群的生长的方法，包括在本发明所述的一种凝胶或者基质中对所述的永生化间充质干细胞进行培养的步骤，从而抑制所述的永生化间充质干细胞种群的生长。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的所述目标细胞是一种转化细胞。在另外一种实施方式中，所述的转化细胞是一种恶性黑素瘤细胞。在另外一种实施方式中，所述的转化细胞是本领域已知的任何其他类型的转化细胞。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
正如本发明中所提供的，M2细胞在较为坚硬的底物上呈现出更大的尺寸以及更大的细胞种群。在另外一种实施方式中，增加的细胞种群是所述的细胞在坚硬的底物之上的生长被增强而导致的。在另外一种实施方式中，增加的种群归因于所述的细胞在柔软的底物之上的死亡被增强。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中提供了一种诱导转化细胞的生长停止的方法，包括在本发明所述的一种凝胶或者基质中对所述的转化细胞进行培养的步骤，从而诱导所述的转化细胞的生长停止。在另外一种实施方式中，本发明中提供了一种抑制转化细胞种群的生长的方法，包括在本发明所述的一种凝胶或者基质中对所述的转化细胞进行培养的步骤，从而抑制所述的转化细胞种群的生长。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的柔软的底物导致了所述目标细胞中的以灭活的GDP-结合形式存在的三磷酸鸟苷(GTP)蛋白的增加。在另外一种实施方式中，所述的三磷酸鸟苷蛋白是Rho。在另外一种实施方式中，所述的三磷酸鸟苷蛋白是Rac。在另外一种实施方式中，所述的三磷酸鸟苷蛋白是Cdc42。在另外一种实施方式中，所述的三磷酸鸟苷蛋白是本领域已知的任何其他的三磷酸鸟苷蛋白。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，所述的Rho家族通过黏着斑的形成而发出信号。在另外一种实施方式中，Rho的活化作用抑制了p21WAF1/clp1的表达。在另外一种实施方式中，p21的抑制作用激活了周期素依赖性激酶(CDK)。在另外一种实施方式中，Rho的活化作用诱导了p27Klp1的去调节以及降解，其中所述的p27Klp1是另外一种周期素依赖性激酶抑制剂。在另外一种实施方式中，Rho的活化作用诱导了与Rho相关的卷曲蛋白激酶(ROCK)，导致了所述的Ras-Raf-MEK-ERK途径的活化。在另外一种实施方式中，这种途径诱导了由Ras介导的周期素-D1的转录。在另外一种实施方式中，这诱导了G1-阶段的进行。同时，Rho的活化作用已经表现出能够导致G1-阶段的进行。在另外一种实施方式中，Rac或者Cdc42的活化作用对周期素-E1以及周期素-D1进行了上调节，导致了G1-阶段的进行。在另外一种实施方式中，Rho家族的三磷酸鸟苷结合小蛋白的活化作用导致了信号转导，从而增强了细胞周期的进行。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的柔软的底物减小了所述目标细胞的肌动球蛋白***的收缩性，这诱导了目标细胞，使其终止增殖作用。在另外一种实施方式中，这诱导了目标细胞，使其有能力接受进一步的刺激，从而重新开始增殖作用。在另外一种实施方式中，这诱导了目标细胞，使其有能力接受进一步的刺激，从而进行终末分化作用。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的柔软的底物诱导了肌动球蛋白的活化作用。在另外一种实施方式中，所述的柔软的底物诱导的是由Rho调节的肌动球蛋白。在另外一种实施方式中，所述的柔软的底物诱导的是肌球蛋白II。在另外一种实施方式中，所述的柔软的底物诱导的是由Rho调节的肌球蛋白II。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，本发明中所述的方法以及组合物中的组合物进一步包括一种Rho家族成员的活化剂。在另外一种实施方式中，所述的组合物进一步包括一种Rho家族成员的抑制剂。在另外一种实施方式中，所述的Rho家族成员是Rho。在另外一种实施方式中，所述的Rho家族成员是Rac。在另外一种实施方式中，所述的Rho家族成员是Cdc42。在另外一种实施方式中，所述的Rho家族成员是本领域已知的任何其他的Rho家族成员。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。在另外一种实施方式中，所述的组合物中进一步包括一种肌动球蛋白的活化剂。在另外一种实施方式中，所述的组合物中进一步包括一种肌动球蛋白的抑制剂。在另外一种实施方式中，所述的组合物中进一步包括一种肌球蛋白II的活化剂。在另外一种实施方式中，所述的组合物中进一步包括一种肌球蛋白II的抑制剂。每一种可能性代表着本发明的一种单独的实施方式。
对丙烯酰胺凝胶进行聚合的方法是本领域熟知的。在另外一种实施方式中，向适宜剂量的水中加入1.5微升的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)(FisherBiotech CAS no.110189)以及5微升10％的过硫酸铵，从而达到1000微升的总体积，将所述溶液用移液管移液到一个盖片之上，并且在所述溶液的上方放置一个顶端的盖片，随后在10分钟之后剥离所述的顶端盖片。每一种方法代表着本发明的一种单独的实施方式。
在另外一种实施方式中，为了使粘附蛋白交联在所述的凝胶或者基质之上，使用到一种双异官能***联剂。在另外一种实施方式中，所述的双异官能***联剂是硫代-SANPAH(硫代琥珀酰亚胺6(4’-叠氮-2’-硝基苯基-氨基)己酸酯，Pierce no.22589)。在另外一种实施方式中，所述的双异官能***联剂是本领域已知的任何其他的双异官能***联剂。在另外一种实施方式中，硫代琥珀酰亚胺6(4’-叠氮-2’-硝基苯基-氨基)己酸酯(sulfo-SANPAH)是按照下述方式进行使用的。将1毫克/毫升的硫代琥珀酰亚胺6(4’-叠氮-2’-硝基苯基-氨基)己酸酯溶解于水中，并且将200微升这种溶液用移液管移液在所述的凝胶表面之上。之后将聚丙烯酰胺凝胶放置于距紫外灯下6英寸处并且照射10分钟。之后对其洗涤三次，每次使用3毫升200毫摩的pH为8.6的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。当最后的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液被吸出后，利用移液管将200微升0.14毫克/毫升的鱼纤维粘连蛋白溶液(Sea Run Holdings，South Freeport，ME)或者0.14毫克/毫升的I型胶原质移液到所述的聚丙烯酰胺凝胶之上。之后将容纳所述凝胶的多孔培养板在5℃下培养4小时。每一种方法代表着本发明的一种单独的实施方式。
在本发明中的另外一个方面，可以提供一种含有组分的试剂盒，用于按照上文中所述的方法装配一种***或者相反的，用于实现本发明中所述的方法。在一种实施方式中，这样的一种试剂盒中包括下述单独存在的组分：(1)一种底物，或者用于制造一种底物的材料；(2)任选的用于制造和/或施用一种耦联层的材料；以及(3)用于制造和/或施用细胞外物质配体物质的材料，从而形成一种细胞外物质配体层。所述的底物组分可以，例如，包括一种具有预先确定的弹性的聚丙烯酰胺凝胶，含有某种物质的聚丙烯烯胺凝胶，其中所述的物质能够将所述的凝胶的弹性调整至一种预先确定的弹性或者弹性范围内，或者所述的物质能够使得凝胶或者其他适合的底物具有所期望的弹性。在实施方式中，所述的试剂盒中包括一种装置，所述的装置用于镶嵌或者容纳所述的凝胶，其目的是为了方便所述的细胞外物质配体层的应用以及任选的一种耦联层的应用，其中所述的耦联层用于将所述的底物耦联至所述的细胞外物质配体层上。依照本说明书，正如对于本领域技术人员而言显而易见的，为了便于所述试剂盒的存储、装运以及装配，可以将本发明中所述的试剂盒中的各种不同的组分进行混合。
这样的试剂盒的实施方式中还可以包括用于制造和/或施用所述的细胞外物质配体层的材料。例如，所述的试剂盒中可以包括细胞外物质配体材料，用于直接施用在所述的底物上。在其他的实施方式中，所述的试剂盒中可以包括所述的细胞外物质配体层材料的各种组分或者成分，并配有用以说明制备其并且将其施用至所述试剂盒中的其他组分中的说明书。任选的，所述的试剂盒中可以包括用于装配以及施用一种耦联层的材料以及说明书，其中所述的耦联层用于将所述的底物耦联至所述的细胞外物质配体层之上。在一种具体的实施方式中，用于在一种来自于人类骨髓间充质干细胞中诱导静止态的本发明中所述的***的试剂盒中包括下述：
(a)一个玻璃皮氏培养皿(或者其他的仪器，用于支撑所述的底物并且容纳剩余的所述组分)；
(b)用于制备一种聚丙烯酰胺凝胶的材料，其中所述的聚丙烯酰胺凝胶具有大约250帕(Pa)的硬度，适合用来作为所述的底物，其中所述的材料包括适宜剂量的丙烯酰胺以及双丙烯酰胺；
(c)用于在所述的凝胶上进行施加的N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯(NHS)，其目的在于形成一种耦联层；以及
(d)用于制备一种细胞外物质配体层的材料，包括在实施例1中所定义的材料，用于制备一种1∶5的纤维粘连蛋白-胶原质细胞外物质。
在一种实施方式中，本发明中所述的试剂盒中包括一种聚丙烯酰胺凝胶，所述的聚丙烯酰胺凝胶被配制成具有一种能够在一种指定类型的干细胞中诱导静止态的弹性；一种包括交联组合物的溶液，用于在所述的凝胶上进行施用；配制好的细胞外物质，用来与一种指定类型的细胞表面上的整联蛋白进行结合；以及，任选的，适合的营养物质(所述的营养物质也可以由使用者来制备)，所述的营养物质是用于所述的被诱导进入静止态的细胞的。
在所述试剂盒的一些实施方式中，所述的试剂盒中包括一层材料，用来同时提供弹性以及细胞外物质配体。在另外一种实施方式中，所述的试剂盒中可以包括下述三层材料：
a)一种凝胶底物，用于向所述的***中提供弹性；
b)细胞外物质配体；以及
c)交联剂，用来将细胞外物质配体连接在所述的底物之上。
在本发明中所述的试剂盒的实施方式中，所述的试剂盒中的组分被放置在一种容器之中，其中所述的容器是例如含有磷酸盐缓冲溶液(PBS)的袋子或者塑料包装。在一些实施方式中，所述的容器中同样可以含有防腐剂例如叠氮化钠。存在于所述试剂盒中的所述组分可以是水合形式的，例如，在存储过程中。在一些实施方式中，所述的容器利用适宜的支架(scaffolds)进行了密封和/或保护，从而避免对所述的***产生的损坏。所述的试剂盒可以在低温下进行装运，其中所述的低温是例如大约2℃至大约8℃。
在本发明中所述的试剂盒的实施方式中，使用者可以打开所述的容器并且将所述试剂盒中的所述组分放置在一种适宜的物质之上，其中所述的适宜的物质是例如一种组织培养板。使用者同样可以除去所述组分之上的任何坚硬的物质，从而暴露出所述的细胞外物质配体并且利用一种缓冲液对所述的组分进行洗涤，其中所述的缓冲液是例如磷酸盐缓冲溶液(PBS)。之后使用者可以将细胞接种在所述的***之上，其中所述的接种是通过将一种细胞悬浮液放置于所述的***之上的方式来完成的，其中所述的细胞悬浮液中包括细胞，培养基，以及血清，如果需要的话。
本发明中所述的***以及方法可以在体内以及体外被实现。这样的***可以包括例如多孔结构，用以***到具体组织或者所述的循环***之中，从而在所述的机体内将一种干细胞维持在静止态。例如，干细胞，相应的细胞外物质以及任选的连接物质，可以被分散在一种聚合基质中，其中所述的聚合基质对所述的干细胞具有适宜的表观弹性，能够诱导或者维持静止态，并且其同样具有足够的多孔性，从而允许体内营养物质到达所述的细胞中并且允许由所述的细胞所表达的蛋白以及其他因子离开所述的基质。其他的实施方式中可以包括能够在干细胞中诱导或者维持静止态、并且能够被植入到一种宿主体内的盒子或者其他装置。
本发明中的一个进一步的方面包括一种体外静止态干细胞，所述的体外静止态干细胞具有持续的生物学活性。这样的干细胞的例子包括成体干细胞或者胚胎干细胞，人类干细胞或者动物干细胞，间充质干细胞(MSC)，来自于骨髓的间充质干细胞，肾脏干细胞，来自于肝脏的干细胞，来自于骨骼肌的间充质干细胞，来自于骨头的间充质干细胞，牙髓间充质干细胞，来自于心肌的间充质干细胞，来自于滑液的间充质干细胞或者脐带间充质干细胞。在实施方式中，本发明中所述的***以及方法被用来在一种干细胞中诱导或者维持静止状态，并且对这样的静止态的干细胞的所述生物学活性进行保持。
因此，在一种实施方式中，本发明中提供了一种对间充质干细胞的生长进行调节的仪器，所述的仪器中包括：一种凝胶基质，其具有在150-750帕的范围内的硬度；以及一种脂肪细胞诱导培养基，其中所述的凝胶或者基质被1型胶原质、纤维粘连蛋白、或者它们的组合进行了覆盖。
在其他的实施方式中，在上文中所描述的任意方法中的所述凝胶以及基质具有本发明中所述的组合物中的凝胶或者基质中的任何一种性质。每一种性质代表着本发明的一种单独的实施方式。
详细的试验部分
实施例1：对各种不同的组织所具有的硬度所进行的测量以及与 所述的组织具有类似硬度的聚丙烯酰胺凝胶的制备
材料以及试验方法
聚丙烯酰胺凝胶的制备
制备丙烯酰胺以及双丙烯酰胺(Fisher Biotech，Loughborough，Leicestershire，UK)溶液，使所述的溶液中含有7.5％的恒定不变的聚合物质量，以及0.01％、0.03％或者0.3％浓度的双丙烯酰胺，用以改***度。使存在于一种甲苯无水层之下的丙烯酰胺、双丙烯酰胺、过硫酸铵、以及N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)发生聚合作用，其中所述的甲苯中含有0.5％的N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯(Sigma，St.Louis，MS)，并且所述的聚合作用是发生在两层盖片之间的，其中所述的盖片是按照下述方式进行化学修饰的：将200微升0.1N的氢氧化钠用移液管进行移液，从而对一个25毫米直径的玻璃盖片(Fisherbrand，catalog no.12-545-102；Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)的表面进行5分钟的覆盖。将所述的氢氧化钠溶液吸出，并且施用200微升的3-APTMS(3-氨基丙基三甲氧基硅烷，Sigma no.28-1778，Sigma，St.Louis，MO)并保持3分钟。利用去离子水对所述的玻璃盖片进行彻底的漂洗，从而洗掉任何残留的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-APTMS)溶液，并且将200微升0.5％体积的戊二醛(Sigma no.G7651)的水溶液加入到所述的盖片之上并保持20分钟。利用水对所述的玻璃盖片进行漂洗，将一个18毫米直径的玻璃盖片放置于一片封口膜之上，其中所述的封口膜存在于一个组织培养皿之中，并且在接近所述盖片端的所述封口膜之上用移液管对几滴10％体积的Surfasil溶液(Pierce no.42800，Pierce，Rockford，IL)进行移液，其中所述的10％体积的Surfasil溶液是存在于氯仿之中的。将带有一个半闭合盖子的所述组织培养皿在一个真空干燥器内放置10分钟。
利用0.2毫克/毫升的层粘连蛋白(Collaborative Biomedical，Bedford，MA)与被导入到所述的凝胶表面之上的N-琥珀酰亚胺丙烯酸酯进行反应，从而生成一种粘着性配体的均一涂层。利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液进行洗涤从而除去痕量的未聚合溶剂之后，向含有所述的聚丙烯酰胺(PA)凝胶的孔中加入培养基并且使其在37℃下平衡过夜。
材料支架(material scaffolds)的粘弹性特征
在一种应变控制型流体分光流变仪III(Rheometrics，Piscataway，NJ)中对所述凝胶的动力学剪切模量进行测量。在两片钢板之间使500微升的样本发生聚合作用，并且通过相内(inphase)的剪切应力对于描述弹性抗性的剪切模量G’(ω)进行计算，其中所述的相内存在2％的振荡型(1弧度/秒)剪切应变。所述组织的动力学剪切模量通过类似的方法进行测量。使用不锈钢冲床对一个8毫米直径的样本进行切割并且将所述的样本放置于所述的板之间。通过在2％的应变下进行的振荡作用对短期剪切模量(ω)进行测量，并且通过施加10％的稳定应变并且允许所述样本松弛30秒的方式对所述的长期剪切模量G(t)进行测量。
结果
对聚丙烯酰胺凝胶进行制备并且利用0.14毫克/毫升的1型胶原质以及0.14毫克/毫升的鱼纤维粘连蛋白的混合物对其进行覆盖。通过调整所述的丙烯酰胺以及双丙烯酰胺的浓度，取得了在一个很宽范围内的硬度(附图1A)。所述的聚丙烯酰胺凝胶的硬度不会对所述的细胞外物质的剂量以及所述的细胞外物质在所述凝胶上的分布产生影响。体外流变仪同样被用来确定与间充质干细胞相关的所述组织的弹性性质(表格1)。制备弹性模量(G’)为200帕的聚丙烯酰胺凝胶(在本发明中被用来作为“柔软的凝胶”的一种实施例，并且被用来指代“柔软的凝胶”)或者弹性模量为7500帕的聚丙烯酰胺凝胶(在本发明中被用来作为“坚硬的凝胶”的一种实施例，并且被用来指代“坚硬的凝胶”)；所述的柔软的凝胶模拟的是所述的骨髓以及脂肪组织所具有的硬度。
表格1.组织的硬度。大鼠组织是从三只Sprague-Dawley大鼠中获得的
  组织   硬度(帕)
  牛骨髓   225+/-25
  大鼠皮下脂肪   157+/-36
  大鼠内脏脂肪   130+/-40
  大鼠肝脏   403+/-28
  大鼠骨骼肌   2251+/-166
因此，对聚丙烯酰胺凝胶进行制备，从而模拟所述的生物学组织所具有的硬度。
实施例2：存在于柔软的凝胶以及坚硬的凝胶之上的人类间 充质干细胞的细胞形状以及丝状肌动蛋白结构
材料以及试验方法
将人类间充质干细胞稀松的接种在坚硬的凝胶之上或者柔软的凝胶之上，其中所述的凝胶利用1型胶原质以及纤维粘连蛋白进行了覆盖。将细胞在DMEM+10％胎儿小牛血清中进行24小时的培育，固定，并且利用Alexa Fluor 488鬼笔环肽进行染色。
结果
对所述的细胞外物质所具有的硬度对hMSC(人类间充质干细胞)的形状以及丝状肌动蛋白结构所产生的影响进行了研究。将细胞在存在有血清的基质之上进行24小时的培育，从而允许其进行粘附以及延展，其中所述的基质具有各种不同的硬度。被接种在坚硬的凝胶或者玻璃之上的人类间充质干细胞表现出一种纺锤样的形状并且呈现出应力纤维以及皮质丝状肌动蛋白(由Alexa Fluor 488鬼笔环肽染色所显现出的)，而被接种在柔软的凝胶之上的细胞呈现出一种圆形的外观，缺少应力纤维，并且含有丝状肌动蛋白附聚物(附图1B-C)。
因此，人类间充质干细胞能够感知到所述的细胞外物质所具有的硬度，其中所述的硬度影响了它们的形状以及丝状肌动蛋白结构。
实施例3：存在于柔软的凝胶之上的人类间充质干细胞的增 殖作用的抑制
材料以及试验方法
在有血清的存在下，利用5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)(Invitrogen，Carlsbad，CA)对人类间充质干细胞进行培育。对所述的细胞进行固定并且针对5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)进行免疫染色。在随机选择的区域内对多于50个的细胞进行三次计数。
结果
作为一种细胞周期进行的标记物，对于在人类间充质干细胞中的5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶的导入进行测量(附图2)。将细胞接种在柔软的凝胶、坚硬的凝胶或者玻璃表面之上，上述所有的表面均利用1型胶原质以及纤维粘连蛋白进行了覆盖。作为对照，同样制备了存在于玻璃表面之上的密集的细胞。正如所预料到的，被稀松的接种在玻璃表面之上的人类间充质干细胞有效的进行了5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶的导入，这表明着高水平的增殖作用。当细胞密集在玻璃表面上时，由于接触抑制作用，非常少的人类间充质干细胞进行了5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶的导入。存在于坚硬的凝胶之上的42％的人类间充质干细胞进行了5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶的导入，这表面一个大的细胞种群进行了增殖，尽管其显著的小于被稀松的接种在一种玻璃表面之上的细胞的种群。在另外一方面，存在于柔软的凝胶之上的人类间充质干细胞没有进行5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶的导入，即使所述的细胞是可以存活的，其中所述的可以存活是通过缺乏台盼兰(Trypan Blue)染色来进行评价的。进一步的，对存在于基质上的稀松接种的人类间充质干细胞所进行的持续培育产生了一种不同的细胞密度，这取决于所述的基质所具有的硬度，在更为坚硬的基质上具有更高的密度。
因此，柔软的基质能够抑制人类间充质干细胞的增殖作用，即使是在有血清存在的情况下。
实施例4：存在于柔软的凝胶之上的人类间充质干细胞有能 力分化成为脂肪细胞
材料以及试验方法
脂肪细胞分化作用的研究
将来自于细胞悬浮液中的人类间充质干细胞以3.5×104个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板上，其中所述的96孔组织培养板利用1型胶原质加上纤维粘连蛋白进行了覆盖。在含有10％的胎儿小牛血清(FCS)的DMEM(生长培养基，“GM”)中对所述的细胞进行24小时的培养之后，通过在脂肪形成性诱导培养基(AIM)(生长培养基，1微摩***，200微摩茚甲新，10微克/毫升胰岛素，以及0.5毫摩甲基异丁基黄嘌呤)中进行3天(2个细胞周期)的培养并且之后将其保持在脂肪形成性保持培养基(生长培养基，10微克/毫升胰岛素)中的方式，对所述的细胞进行诱导，使其分化成为脂肪细胞。在将其转至脂肪形成性诱导培养基中的8天之后，可以通过油红O染色(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或者通过使用抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)抗体针对过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)进行的免疫染色的方式对脂肪细胞的分化作用进行评价。在随机选择的区域内对多于50个的细胞进行三次计数。抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)抗体是由宾夕法尼亚大学的Mitchell A.Lazar教授提供的。
结果
为了对存在于柔软的凝胶之上的人类间充质干细胞的存活能力进行证实，通过两种方式对所述的人类间充质干细胞分化成为脂肪细胞的能力进行测定；(a)过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)的免疫染色，其中所述的过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)是脂肪形成中的一种关键的转录因子，以及(b)油红O-染色，用来测量脂质体的积累。当使用一种存在于含有胎儿小牛血清的培养基中的***、茚甲新、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤以及胰岛素的混合物对存在于一种玻璃表面之上的密集的人类间充质干细胞进行诱导使其进行脂肪细胞的分化作用时，大约有40％的细胞表现出一种脂肪细胞表现型(附图3A)。与之形成对照，在柔软的凝胶上进行诱导作用，所述的分化率达到超过80％，显著的高于在玻璃上的分化率；当不进行诱导作用时，没有观察到脂肪细胞的分化作用。进一步的，被稀松的接种在玻璃之上的人类间充质干细胞表现出一种高水平的增殖作用(附图2)并且没有分化成为脂肪细胞(附图3B)。这些结果进一步的表明人类间充质干细胞可能需要离开所述的细胞周期，这是进行终末分化作用的一个先决条件。
因此，被稀松的接种在柔软的凝胶之上的人类间充质干细胞是完全可以存活的并且有能力进行脂肪细胞的分化作用。
实施例5：被接种在坚硬的凝胶或者柔软的凝胶之上的星形 细胞中的丝状肌动蛋白结构
为了对所述细胞对基质硬度所产生的应答进行进一步的定义以及量化，同样测试了所述的细胞外物质所具有的硬度对星形细胞中的丝状肌动蛋白结构所产生的影响。首先按照下述方法从Sprague-Dawley大鼠的晶胚中分离出星形细胞：通过剖腹产手术从一个定时怀孕(timed-pregnant)的Sprague-Dawley大鼠体内取出晶胚(E17-E19)并且除去所述的皮质。在胰蛋白酶/脱氧核糖核酸酶中于37℃下对组织进行消化，离心(1000gx5分钟)，并且过滤，从而得到一种细胞悬浮液。为了获得同时含有神经元以及神经胶质细胞的培养物，将所述的细胞直接放置于底物之上。首先将星形细胞培养物保持进行14天的培养，其中进行了一系列的胰蛋白酶化作用用以去除神经元。用在试验中的培养物具有大于98％的星形细胞，这是通过神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学试剂来确定的。细胞在一个培养器中于37℃下以及含有5％的二氧化碳的Dulbecco’s modified Eagle’smedium(Bio Whittaker，East Rutherford，NJ)中进行7天的生长，其中在所述的培养基中补充有Ham’s F12(Sigma)以及5％的胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，在此之后在Neurobasal(Gibco，Carlsbad，CA)中又进行了5天的培养，其中在所述的Neurobasal中同样补充有5％的胎牛血清，2毫摩的L-谷氨酸盐，50微克/毫升的链霉素，以及50单位/毫升的盘尼西林。
在有血清存在的条件下，在坚硬的聚丙烯酰胺凝胶(11千帕)或者柔软的聚丙烯酰胺凝胶(150帕)之上对所述的细胞进行48小时的培育，从而允许其进行粘附以及延展。对细胞进行固定，并且利用鬼笔环肽对丝状肌动蛋白的结构进行显现。正如附图4中所表示的，在被放置于坚硬的凝胶之上的星形细胞中观察到了应力纤维以及皮质丝状肌动蛋白。与之形成对照，在被放置于柔软的凝胶之上的星形细胞中，不存在应力纤维并且仅仅观察到皮质肌动蛋白壳。因此，存在于柔软的凝胶之上的星形细胞能够对所述基质的弹性进行感知并且因此不会呈现出应力纤维。
实施例6：存在于柔软的凝胶之上的星形细胞中的低水平的 RHO三磷酸鸟苷(GTP)-负载
材料以及试验方法
Rhotekin牵出试验(pulldown assay)
利用冰冷的Tris-缓冲盐水对细胞进行洗涤并且将所述的细胞裂解于RIPA缓冲液中(50毫摩的Tris，pH 7.2，1％的TritonX-100，0.5％的脱氧胆酸钠，0.1％的十二烷基磺酸钠，500毫摩的氯化钠，10毫摩的氯化镁，亮抑酶肽以及抑肽酶分别为10毫克/毫升，以及1毫摩的苯甲基磺酰氯)。通过在4℃下于13000xg离心10分钟，对所述的细胞裂解液进行澄清，并且将同样体积的裂解液于4℃下利用谷胱甘肽-S-转移酶-Rhotekin结合结构域(GST-RBD)(20毫克)珠进行45分钟的培育。利用缓冲液B(Tris缓冲液，其中含有1％的Triton X-100，150毫摩的氯化钠，10毫摩的氯化镁，亮抑酶肽以及抑肽酶分别为10毫克/毫升，以及0.1毫摩的苯甲基磺酰氯)对所述的珠进行4次洗涤。使用一种抗RhoA的单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)通过Western印迹对结合型Rho蛋白进行探测。使用AlphaImagerTM***(AlphaInnotech)进行密度计量学分析。为了对不同样本中的Rho活性(三磷酸鸟苷结合型Rho的水平)进行比较，所述的Rhotekin结合结构域(RBD)结合型Rho的剂量被归一化为存在于细胞裂解液中的所述Rho的总剂量。
结果
为了确定在星形细胞中由柔软的凝胶所诱导的应力纤维的缺失是否与Rho的灭活作用有关，将星形细胞接种在具有各种不同硬度的聚丙烯酰胺凝胶之上并且在有血清存在的条件下进行48小时的培育。制备细胞裂解液，并且使用纯化的谷胱甘肽-S-转移酶-Rhotekin以及Rhotekin牵出试验(pulldown assay)对Rho的三磷酸鸟苷(GTP)装载进行检测。对三磷酸鸟苷结合型Rho与全部Rho的比例进行计算。存在于柔软的凝胶之上的星形细胞表现出一种低水平的三磷酸鸟苷结合型Rho(附图5)，这表明存在于一种柔软的基质之上的星形细胞中的Rho活性的减弱能够导致所述细胞中的应力纤维的缺失。
实施例7：恶性黑素瘤细胞根据所述的细胞外物质所具有的 硬度来调节它们的延展
材料以及试验方法
将M2细胞稀松的接种在具有各种不同硬度的基质之上，其中所述的基质利用1型胶原质以及纤维粘连蛋白的混合物进行了覆盖。经过24小时的培育之后，通过追踪细胞的边界从而对细胞面积进行测量。在随机选择的区域内对多于30个的细胞进行三次计数。
结果
为了测试转化细胞是否是依据所述的细胞外物质所具有的硬度来调节它们的行为，在人类恶性黑素瘤细胞系中对所述的硬度对于细胞的延展所产生的作用进行测量，其中所述的人类恶性黑素瘤细胞系被称为M2细胞。正如附图6中所表示的，M2细胞在较为坚硬的底物之上呈现出了更大的尺寸。因此，转化的M2细胞具有依据所述基质所具有的机械性质来调节它们的行为(例如，细胞的延展)的能力。
实施例8：在柔软的凝胶之上的恶性黑素瘤细胞的剂量的减少
为了确定所述的基质硬度对于所述的M2细胞种群的大小所产生的作用，将M2细胞接种在柔软的凝胶之上或者坚硬的凝胶之上(在每种凝胶之上接种的数量相同)并且利用1型胶原质以及纤维粘连蛋白的混合物对其进行覆盖。在有血清存在的条件下经过24小时的培育之后，当存在于两种凝胶之上的M2细胞完全发生了粘附并且进行了延展时，对所述细胞对于每种底物的粘附效率进行评价。正如附图7中所表示的，在柔软的凝胶与坚硬的凝胶之间，在粘附细胞的数量上不存在显著的差异，这表明所述的基质硬度不能够对M2细胞的粘附性产生影响。在经过72小时的培育之后，尽管在每种底物上具有相同数量的细胞发生了粘附(附图7)，但是上述增加的48小时的培育在坚硬的凝胶之上产生了一个显著增大的细胞种群(附图8)。在经过72小时的培育之后，在柔软的凝胶与坚硬的凝胶之间，在漂浮在所述培养基中的所述细胞的数量上没有观察到显著的差异。
这些结果进一步对用于量化人类间充质干细胞对柔软的底物所产生的应答的方法进行了论证。
实施例9：在不减弱存活能力以及自我再生性的前提下，使 用柔软的凝胶对人类 间充质干细胞进行长期的保存
材料以及试验方法
按照实施例1中所描述的方法，在玻璃盖片上制备柔软的聚丙烯酰胺凝胶，其中所述的聚丙烯酰胺凝胶具有大约200帕的剪切模量(G’)，并且利用1型胶原质以及纤维粘连蛋白的混合物对其进行了覆盖。将聚丙烯酰胺凝胶放置于6孔培养板中，其中所述的6孔培养板利用1％的琼脂糖凝胶进行了覆盖，从而避免发生在聚丙烯酰胺凝胶或者玻璃盖片之外的细胞粘附作用。将5×104个处于2阶段(passage 2)的人类间充质干细胞接种在柔软的聚丙烯酰胺凝胶之上或者直接接种在6孔组织培养板中，其中所述的6孔组织培养板利用1型胶原质加上纤维粘连蛋白进行了覆盖，并且将上述的人类间充质干细胞在补充有10％的胎儿小牛血清(FCS)的DMEM中进行培育。将相同的人类间充质干细胞样本悬浮于DMEM中，并且依照传统的方案(参见Gordon SL等人于2001年9月在Cryobiology《低温生物学》43(2)：182-7中发表的文章)使其在液态氮蒸汽中保持冷冻，其中在所述的DMEM中含有10％的胎儿小牛血清以及10％的二甲基亚砜(DMSO)。在达到90％的密集程度之后，对那些被直接放置于组织培养板之上的细胞进行胰蛋白酶化并且以5×104个细胞/孔的密度将所述的细胞在新的6孔组织培养板中进行次级培养。将细胞保持在组织培养板之上直至它们到达10阶段(passage 10)。每7天使用新鲜的DMEM对存在于柔软的聚丙烯酰胺凝胶之上的细胞进行两次重新喂养，其中所述的新鲜的DMEM中补充有10％的胎儿小牛血清。当被保持在组织培养板中的人类间充质干细胞到达10阶段(passage 10)时，将存储在液态氮蒸汽中的人类间充质干细胞进行解冻，从而生成一种细胞悬浮液。
结果
为了对以静止的状态在柔软的凝胶中经过了长期保存的人类间充质干细胞的存活能力进行确定，将人类间充质干细胞存储于柔软的凝胶之中直至被保持在组织培养板上的人类间充质干细胞到达10阶段(passage 10)。将这些细胞的存活能力与存储在液态氮蒸汽中的细胞的存活能力进行比较。对粘附在柔软的凝胶之上或者组织培养板之上的细胞进行胰蛋白酶化，同时将存储在液态氮气中的细胞进行解冻，从而生成一种细胞悬浮液。通过对上述的细胞悬浮液进行台盼兰(Trypan Blue)染色来确定存活能力。因此，在柔软的凝胶中的存储是保持所述的人类间充质干细胞的存活能力的一种有效的方式。
为了对经过长期存储的、在柔软的凝胶上进行培育的人类间充质干细胞所具有的增殖潜能进行测定，制备被保持在柔软的凝胶之上的细胞、被保持在组织培养板之上的细胞、或者在液态氮蒸汽中保持冷冻的细胞，并且通过下述方式进行5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的导入检测：将来自于每一种来源的细胞重新放置于一种组织培养板上，并且在有血清以及5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)存在的条件下进行12小时的培育，其中所述的组织培养板上利用1型胶原质加上纤维粘连蛋白进行了覆盖。对细胞进行固定并且通过利用抗5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)抗体(Invitrogen)对细胞进行培育的方式进行针对5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的免疫染色。
实施例10：在不减弱分化作用的前提下，使用柔软的凝胶对 人类间充质干细胞进行长期的保存
材料以及试验方法
成骨细胞分化作用检测
将到达10阶段(passage 10)的人类间充质干细胞以103个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板上，其中所述的96孔组织培养板利用1型胶原质加上纤维粘连蛋白进行了覆盖。将所述的细胞在生长培养基(GM)中进行24小时的培育之后，通过将所述的培养基转换为骨形成性诱导培养基(OIM)(生长培养基，50微摩的抗坏血酸-2-磷酸盐，10毫摩的p-磷酸甘油，以及100纳摩的***)的方式对所述的细胞进行诱导，使其分化成为成骨细胞，每三天对所述的培养基进行一次转换，共持续3周。通过使用丙酮/柠檬酸盐对所述的细胞进行固定并且利用固蓝(Fast Blue)RR/萘酚(Sigma-Aldorich，Kit # 85)针对碱性磷酸酯酶的活性进行染色的方式，对成骨细胞分化作用进行评价。
结果
接下来，对以静止的状态在柔软的凝胶中经过了长期保存的人类间充质干细胞的分化潜能进行测定。对存储于柔软的凝胶之上或者组织培养板之上的人类间充质干细胞进行胰蛋白酶化，从而制备生成的(generated)悬浮液；与此并行的，通过对冷冻保存在液态氮气中的人类间充质干细胞进行解冻的方式，制备细胞悬浮液。按照实施例4中所描述的方法对脂肪细胞的分化作用进行评价。
在另外的研究中，在将人类间充质干细胞直接培育在所述的柔软的凝胶上之后，对脂肪细胞的生成量进行测量，其中不先将所述的细胞放置于组织培养皿中并且不进行胰蛋白酶化。
在另外的研究中，对存在于细胞悬浮液中的蚀骨细胞的生成量进行测量，其中所述的细胞悬浮液是通过柔软的凝胶、组织培养板、或者冷冻保存来制备的。
在另外的研究中，在将人类间充质干细胞直接培育在所述的柔软的凝胶上之后，对蚀骨细胞的生成量进行测量，其中不先将所述的细胞放置于组织培养皿中并且不进行胰蛋白酶化。
实施例11：在干细胞的生长调节中所涉及到的RHO-家族三 磷酸鸟苷(GTP)结合型小蛋白以及肌动球蛋白***，其中所述 的生长是通过基质的硬度来进行调节的
材料以及试验方法
Rho家族检测
在玻璃盖片上制备具有大约200帕的剪切模量(G’)的聚丙烯酰胺凝胶(柔软的凝胶)以及具有大约7500帕的剪切模量的聚丙烯酰胺凝胶(坚硬的凝胶)，并且利用1型胶原质以及纤维粘连蛋白的混合物对所述的凝胶以及盖片进行了覆盖。将聚丙烯酰胺凝胶或者玻璃盖片放置于6孔培养板中，其中所述的6孔培养板利用1％的琼脂糖凝胶进行了覆盖，从而避免发生在聚丙烯酰胺凝胶或者玻璃盖片之外的细胞粘附作用。将5×104个人类间充质干细胞接种在聚丙烯酰胺凝胶之上或者玻璃盖片之上，之后在有血清存在的条件下对其进行24小时的培育。使所述的细胞进行牵出试验(pull-down assay)，从而对Rho、Rac以及Cdc42的三磷酸鸟苷(GTP)装载水平进行调查，其中所述的调查是通过使用它们的活化作用检测试剂盒(Upstate Biotech，Charlottesville，VA)来进行的。
利用显性负性形式的Rho或者组成性激活形式的Rho进行的细胞转染
从一个大鼠肝脏cDNA文库中克隆用于所述的候选Rho三磷酸鸟苷酸酶(GTPase)的cDNA，并且引入一种突变，其中所述的突变能够生成显性负性(D/N)形式或者组成性激活(C/A)形式的Rho蛋白(参见Qui RG等人于1995年12月5日在ProcNatl Acad Sci USA《美国科学院院刊》92(25)：11781-5中发表的文章；Lu X等人于1996年12月1日在Curr Biol.《当代生物学》6(12)：1677-84中发表的文章)，并且在每一个cDNA中加入一个编码myc标签的序列。表达突变的Rho家族蛋白的重组腺病毒被得以建立并且所述的重组腺病毒被用来在人类间充质干细胞中对所述的突变蛋白进行过表达。
结果
为了进一步的研究所述的Rho-家族蛋白在对关于所述的细胞外物质的信息进行传递时所起到的作用，在间充质干细胞中对Rho-家族蛋白的活动性进行了检测，其中所述的间充质干细胞是生长在柔软的凝胶或者坚硬的凝胶中的。对在这些信号的传递过程中所涉及到的其他的Rho-家族蛋白进行了识别。
在另外的试验中，在人类间充质干细胞中，对所述的感兴趣的显性负性(D/N)形式或者组成性激活(C/A)形式的Rho-家族蛋白进行了过表达。将表达LacZ的重组腺病毒作为一种负性对照来进行使用。制备来自于柔软的凝胶、坚硬的凝胶、或者玻璃盖片上的人类间充质干细胞，进行24小时的培育，之后保持不对其进行感染，或者利用腺病毒对其进行感染，其中所述的腺病毒表达LacZ或者Rho-家族蛋白的突变形式。在经过36小时的培育之后，向所述的培养基中加入5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)，并且在含有血清的培养基中对所述的细胞再进行12小时的培育，之后进行固定并且使用抗-myc抗体(Cell SignalingTechnology，Danvers，MA)以及抗-5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)同时针对myc-标签以及5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)进行免疫染色。对未经感染的细胞以及利用LacZ腺病毒进行感染的细胞中对5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)染色呈阳性的所述细胞的数量进行比较，利用上述的比较来证实腺病毒感染本身不会对所述的人类间充质干细胞的生长产生影响。将对5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的导入呈阳性的所述细胞的数量与对myc-标签染色呈阳性的所述细胞的数量进行比较。组成性激活(C/A)形式以及显性负性(D/N)形式的Rho-家族蛋白分别对由柔软基质诱导的生长停止或者由刚硬基质诱导的生长促进所产生的去调节作用，证明了所述的过表达的Rho-家族蛋白参与了对人类间充质干细胞的生长调节，这种调节是通过基质硬度来实现的。
实施例12：确定肌动球蛋白在干细胞的生长调节中所起到的 作用，其中所述的调节是通过基质硬度来实现的
为了对肌动球蛋白在人类间充质干细胞的生长调节中所起到的作用进行研究，其中所述的人类间充质干细胞生长在柔软的凝胶之上，并且并未分化成为具体的细胞谱系，将所述的人类间充质干细胞接种在玻璃盖片上，所述的玻璃盖片利用1型胶原质以及纤维粘连蛋白的混合物进行了24小时的覆盖，之后，在存在或者不存在20毫摩2，3-丁二酮肟(BDM)、100微摩blebbistatin或者0.25微摩/毫升细胞松弛素D(CD)的条件下，利用5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)对所述的细胞再进行12小时的培育。在所述试验的全部过程中，细胞是在有血清存在的条件下进行培育的。在经过所述的培育之后，对细胞进行固定并且进行针对5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的免疫染色。对由丁二酮肟(BDM)或者blebbistatin对肌球蛋白II所形成的抑制作用对人类间充质干细胞的生长所产生的影响进行评价，或者对由细胞松弛素D(CD)对肌动蛋白纤维丝所形成的破坏作用对人类间充质干细胞的生长所产生的影响进行评价。
实施例13：人类间充质干细胞在柔软的三维纤维蛋白凝胶中 的生长以及分化作用
材料以及试验方法
纤维蛋白凝胶的制备以及接种
在水中使鲑鱼纤维蛋白原(Searun Holdings，Freeport，ME)进行重新水合并且在pH为7.4的50毫摩的Tris、150毫摩的氯化钠中将其稀释至3毫克/毫升(对于柔软的凝胶而言)或者18毫克/毫升(对于坚硬的凝胶而言)，在组织培养孔中，使用2单位/毫升的鱼凝血酶(Searun Holdings)对400微升(μl)等份的稀释液进行聚合。通过3毫克/毫升以及18毫克/毫升的纤维蛋白原所制备得到的所述的鲑鱼纤维蛋白凝胶所具有的硬度分别为250帕以及2150帕。在进行聚合之前，在含有10％的胎儿小牛血清(FCS)的DMEM中将104个人类间充质干细胞与纤维蛋白原溶液进行混合，所述的细胞在其中进行24小时的培育。
结果
在有血清以及5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)存在的条件下，对所述的细胞再进行12小时的培育，在此之后对其进行固定并且针对5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的导入进行免疫染色，通过上述方法对对于存在于柔软的以及坚硬的纤维蛋白凝胶之中的间充质干细胞的增殖作用所进行的分析来进行评价。
通过脂肪细胞分化作用的效率对存在于纤维蛋白凝胶之中的人类间充质干细胞的分化潜能进行评价，通过将所述的培养基转换为脂肪形成性诱导培养基(“AIM”DMEM+10％胎牛血清(FBS)，1毫摩(mcM)***，200毫摩茚甲新，10毫克(mcg)/毫升胰岛素，以及0.5毫摩甲基异丁基黄嘌呤)并保持3天的方式，对存在于纤维蛋白凝胶之中的间充质干细胞进行诱导，使其分化成为脂肪细胞，之后将所述的细胞保持在脂肪形成性保持培养基中(生长培养基，10毫克/毫升胰岛素)。在将其转至脂肪形成性诱导培养基中的8天之后，可以通过油红O染色或者通过使用抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)抗体免疫染色的方式对脂肪细胞的分化作用进行评价。对存在于柔软的纤维蛋白凝胶和存在于坚硬的纤维蛋白凝胶中的、对于油红O染色或者过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)染色呈阳性的细胞的百分比进行比较。
在其他的试验中，向所述的基质中加入蛋白酶抑制剂，从而对蛋白水解性降解作用或者由所述细胞产生的其他活性重建进行防止或者抑制。
实施例14：本发明中所述的人类间充质干细胞在维持造血干 细胞的存活能力中的用途
将到达10阶段(passage 10)的间充质干细胞悬浮液以103个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板上，其中所述的96孔组织培养板利用1型胶原质加上纤维粘连蛋白进行了覆盖。按照上述实施例中所描述的方法，将所述的细胞在生长培养基(GM)中进行24小时的培育之后，在有柔软的凝胶或者基质存在的条件下对所述的细胞进行培养。之后将上述得到的间充质干细胞培养物加入造血干细胞培养物之中，用以对后者细胞的存活能力进行维持。
在另外的研究中，直接在所述的柔软的凝胶之上对人类间充质干细胞进行培育，而不先将所述的细胞放置于组织培养皿中并且不进行胰蛋白酶化。
实施例15：来源于人类骨髓的间充质干细胞(MSC)
概述：利用1型胶原质以及纤维粘连蛋白的混合物对250帕的聚丙烯酰胺凝胶进行覆盖。所述的覆盖有胶原质以及纤维粘连蛋白的凝胶所具有的弹性类似于骨髓以及脂肪组织所具有的弹性。尽管有血清的存在，当将所述的人类间充质干细胞稀松的接种在这些凝胶之上时，所述的人类间充质干细胞终止了所述细胞周期的进行。然而，当与一种坚硬的底物进行耦联时，这些非增殖性人类间充质干细胞重新进入了所述的细胞周期中。
当将所述的非增殖性人类间充质干细胞培养在脂肪形成性诱导培养基中时，存在于250帕凝胶之上的这些细胞同样能够分化成为脂肪细胞，当将所述的非增殖性人类间充质干细胞转移到一种坚硬的底物之上并且利用成骨细胞诱导介质对其进行培育时，存在于250帕凝胶之上的这些细胞同能能够分化成为成骨细胞。这些结果证明，存在于250帕凝胶之上的人类间充质干细胞是静止态的，但是经过适宜的刺激后，它们同样有能力重新开始增殖作用或者开始分化作用。
材料以及方法
材料。来源于骨髓的人类间充质干细胞是从Cambrex(Walkersville，MD)处购买获得的。丙烯酰胺粉末以及双丙烯酰胺粉末是从Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)处购买获得的。1型鼠尾胶原质是从DB Bioscience(San Jose，CA)处购买获得的。人类纤维粘连蛋白是使用本领域已知的操作过程来进行纯化的(参见Williams EC，Janmey PA，Ferry JD等人于1982年在JBiol Chem《生物化学杂志》257：14973-14978中发表的文章“Conformational states of fibronectin.Effects of pH，ionicstrength，and collagen binding《pH、离子强度、以及胶原质结合对纤维粘连蛋白的构想状态所产生的影响》”)。油红O(ORO)是从Sigma(St.Louis，MO)处获得的。茜素红S(Alizarin RedS)是从Alfa Aesar(Ward Hill，MA)处获得的。5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)标记试剂是从Zymed(San Francisco，CA)处获得的。抗5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)抗体以及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)是从Invitrogen(Carlsbad，CA)处获得的。在这一实施例1中所使用到的全部其他化学试剂均是分析纯级的。
细胞培养。在被接种至凝胶上之前，将来源于骨髓的人类间充质干细胞(MSC)保持在一种生长培养基(GM)中，所述的生长培养基存在于组织培养塑料板中，其中所述的生长培养基包括Dulbecco’s Modified Eagle Media(DMEM)，在其中含有1克/升的D-葡萄糖(低葡萄糖DMEM)，0.3毫克/毫升的L-谷氨酸盐以及100毫克/升的丙酮酸钠以及10％的加热灭活性胎牛血清。为了进行脂肪细胞的分化作用，将所述的细胞暴露在两种化学诱导周期中，所述的两种化学诱导周期是通过下述方式构成的：3天存在于脂肪形成性诱导培养基(生长培养基，1微摩***，200微摩茚甲新，10微克/毫升胰岛素以及0.5毫摩3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)中，1天存在于脂肪形成性维持培养基(生长培养基以及10微克/毫升胰岛素)中。将未分化的细胞保持在生长培养基(GM)中并且每3天进行一次重新饲喂。为了进行成骨细胞的分化作用，利用一种成骨细胞诱导培养基(生长培养基，50微摩抗坏血酸-2-磷酸盐，10毫摩β-磷酸甘油以及100纳摩***)对细胞进行24天的培育，其中每3-4天对所述的培养基进行更换。将细胞以每4.9平方厘米5×104个细胞的密度放置于凝胶之上，或者以每4.9平方厘米1×105个细胞的密度(密集的)放置于玻璃之上，或者以每4.9平方厘米1×104个细胞的密度(稀松的)放置于玻璃之上。
凝胶的制备以及鉴定。使用本领域已知的操作过程并且在进行最小改动的前提下，制备250帕的聚丙烯酰胺凝胶以及7500帕的聚丙烯酰胺凝胶，其中所述的操作过程是例如Pelham等人所描述的(参见Pelham RJ，Jr.Wang Y.于1997年在Proc Natl AcadSci USA.《美国科学院院刊》94：13661-13665中发表的文章“Celllocomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility《细胞运动力以及黏着斑是由底物弹性进行调节的》”)。在磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH 7.4)中，分别制备3.0％的丙烯酰胺溶液以及0.2％的双丙烯酰胺溶液(用于250帕的凝胶)，或者7.5％的丙烯酰胺溶液以及0.5％的双丙烯酰胺溶液(用于7500帕的凝胶)，使总体积达到500微升。利用N，N，N’，N’-四甲基乙二胺以及过硫酸铵使聚合作用开始。将一个150微升的液滴沉积在一个25毫米的玻璃盖片之上，其中事先使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷以及戊二醛对所述的玻璃盖片进行了修饰。向所述的液滴上施加15微升2％的N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯的甲苯溶液，并且在所述的液滴之上放置一个25毫米的经过氯硅烷化的盖片，在聚合作用完成之后去除所述的盖片，并且利用紫外光对上述得到的凝胶进行大约10-15分钟的照射。将所述的凝胶放置在一个六孔聚苯乙烯组织培养板内并且利用磷酸盐缓冲溶液(PBS)进行洗涤。其中所述的六孔培养板事先利用1％的琼脂糖凝胶进行了覆盖，其目的在于防止发生在凝胶或者盖片之外的细胞粘附。使存在于所述凝胶之上的所述的N-琥珀酰亚胺丙烯酸酯与由0.1毫克/毫升1型鼠尾胶原质以及0.02毫克/毫升人类纤维粘连蛋白组成的混合液进行一个小时的反应。之后利用磷酸盐缓冲溶液对所述的凝胶进行三次洗涤并且将所述的细胞保存在磷酸盐缓冲溶液之中直至所述的细胞需要在24小时之内进行接种。将玻璃盖片在由1型鼠尾胶原质加上人类纤维粘连蛋白所组成的溶液中浸没1小时，从而利用细胞外物质配体对它们的表面进行覆盖。
流变学测量。为了对所述的聚丙烯酰胺凝胶的动力学剪切模量(G’)进行测量，在一个水合作用腔室中，使500微升的单体溶液在两个25毫米的平行钢板之间发生聚合反应。在一种应变控制型RFS III流体分光流变仪(Rheometrics，Piscataway，NJ)中通过所述的相内(in phase)剪切应力对所述的剪切模量进行计算，其中使用了2％的振荡剪切应变，频率为每秒10弧度(radian)。对相关动物组织的动力学剪切模量(G’)进行测量。在进行所述的测量之前，将大鼠组织从所述的动物中分割开来，并且将其保存在磷酸盐缓冲溶液中，进行不超过1小时的水合反应。牛的组织是从一个商业屠宰场购买获得的，将其在冰上进行运输，水合，并且升温至37℃后再进行所述的测量。在37℃下，使用平行培养板并且在频率为每秒10弧度(radian)的2％的振荡剪切应变条件下，对水合后的、直径为8毫米且厚度为2毫米的大鼠组织样本的动力学剪切模量(G’)以及水合后的、直径为25毫米且厚度为2毫米的牛组织样本的动力学剪切模量(G’)进行测量，其中所述的平行培养板与所述的样本在几何学上是相互匹配的。对每种组织的三个样本进行测量。
准3D凝胶***。使用Beningo等人所描述的方法建立一种底物三明治结构，所述的底物三明治结构被设计成用来模拟所述细胞的三维环境，并且按照下文中的描述进行修饰，用以改变所述底物的弹性，改变所述细胞外物质(ECM)层的组成，以及为使所述的细胞与所述的盖片紧密接触所使用的砝码(参见Beningo KA，Dembo M，Wang YL于2004年在Proc Natl Acad SciUSA《美国科学院院刊》101：18024-18029中发表的文章“Responses of fibroblasts to anchorage of dorsal extracellularmatrix receptors《纤维原细胞对于背侧细胞外物质受体的锚定作用所产生的应答》”)。将细胞接种在一种25毫米的凝胶之上并且允许其在此放置满48小时。除去过量的介质，并且在上述被接种的凝胶之上放置另外一个盖片(在所述盖片的底侧上带有或者不带有250帕的聚丙烯酰胺凝胶)。所述的第二个盖片的底侧上利用如上所述的1型胶原质以及纤维粘连蛋白的混合物进行了覆盖。为了使所述的细胞与所述的第二个盖片进行紧密的接触，在所述的三明治结构的顶端放置一个无菌的35克砝码，放置30秒。在将上述的砝码去除后，再引入所述的介质，并且将所述的细胞在所述的三明治结构中保持2天。在即将施加所述的顶部盖片之前并且在在此之后的2天时间之后，立即对所述的细胞进行成像。
成像。使用本领域已知的操作步骤完成免疫染色(参见FunakiM，Randhawa P，Janmey PA于2004年在Mol Cell Biol.《分子生物学与细胞生物学》24：7567-7577中发表的文章“Separation ofinsulin signaling into distinct GLUT4 translocatoin and activationsteps《进入不同的葡萄糖转运蛋白4的易位步骤以及活化步骤的胰岛素信号的分离》”)。按照Shao以及Lazar所描述的方法，在进行了两个周期的脂肪形成性诱导之后或者在生长介质中存在8天之后，利用油红O(ORO)对富含脂肪酸的溶媒进行染色(参见Shao D，Lazar MA于1997年在J Biol Chem《生物化学杂志》272：21473-21478中发表的文章“Peroxisome proliferator activatedreceptor gamma，CCAAT/enhancer-bingding protein alpha，and cellcycle status regulate the commitment to adipocyte differentiation《过氧化物酶体增殖物激活受体γ，CCAAT/增强子结合蛋白α，以及细胞周期分布对脂肪细胞分化作用的执行所进行的调节》”)。按照制造商的说明书，在成骨细胞诱导培养基中培养24天之后，利用茜素红S对富含钙的细胞外物质进行染色。通过使所述的细胞在含有5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的培养基中培育过夜的方式，对5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的导入进行测量。对细胞进行固定并且依照制造商的说明书同时针对5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)以及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色。在所有的情形中，使用带有Hamamatsu ORCA照相机(Hamamatsu，日本)的徕卡(Leica)DM-IRBE显微镜(Wetzlar，德国)对细胞进行成像。
使用鬼笔环肽染色图像对所述的投影细胞面积进行测量。将所述的图像转换为8比特(bit)并且进行阈值化(thresholded)。使用图像J(Image J)软件(美国全国卫生研究所(NIH)，Bethesda，MD)对颗粒的尺寸进行分析。同样利用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对所述的细胞进行染色，用来验证所述的细胞没有发生重叠。仅仅对分离的细胞进行计数。
结果
对骨髓进行流变学测试，从而确定在进行底物顺应性对于静止态人类间充质干细胞储存室(reservoir)的维持所起到的作用的研究中所适宜的凝胶弹性。正如下面的表格3中所示，牛骨髓表现出了220帕的振荡性贮能模量(G’)。为了研究底物硬度在人类间充质干细胞的脂肪形成过程中所起到的作用，同样对所述的脂肪组织的振荡性贮能模量(G’)进行了测量。大鼠脂肪组织表现出了大约150帕的稍低一些的振荡性贮能模量(G’)。在大鼠的内脏脂肪所具有的振荡性贮能模量(G’)以及皮下脂肪所具有的振荡性贮能模量(G’)之间不存在统计学差异。采用一种聚丙烯酰胺底物溶液对所述细胞的天然环境所具有的弹性进行模拟，其中所述的聚丙烯酰胺底物溶液中含有3.0％的丙烯酰胺以及0.1％的双丙烯酰胺。这种聚丙烯酰胺溶液具有250+/-25帕的聚合的振荡性贮能模量(G’)，这种贮能模量与所测量得到的大鼠组织以及牛组织的振荡性贮能模量(G’)数值相类似。在一些试验中，使用另外一种底物作为对照，其中所述的另外一种底物具有7500+/-250帕的贮能模量(类似于肌肉组织的贮能模量)。(参见Engler AJ，Griffin MA，Sen S等人于2004年在J Cell Biol《细胞生物学杂志》166：877-887中发表的文章“Myotubesdifferentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness：pathological implications for soft or stiff microenvironments《肌小管在具有组织样硬度的底物上所进行的最佳分化：柔软微环境或者坚硬微环境的病理学意义》”)。
表格3
  物种   牛   大鼠   大鼠
  组织   骨髓   内脏脂肪   皮下脂肪
  弹性(平均值+/-标准偏差)   220+/-50帕   130+/-70帕   160+/-70帕
附图9A-9I表示的是存在于250帕(附图9A，9D以及9H)、7500帕(附图9B，9E以及9I)、以及玻璃(附图9C，9F以及9J)底物之上的人类间充质干细胞的成像，其中所述的人类间充质干细胞是以2000个细胞/平方厘米的初始放置密度而存在的。正如附图9A-9C中所表示出的，细胞被放置于经过I型胶原质以及纤维粘连蛋白覆盖的底物之上，并且在生长培养基(GM)中经过24小时的培育之后，在相衬模式下进行的成像。箭头指示的是所述细胞的位置。附图9D-9F表示的是在生长培养基中经过7天的培育之后，在同样位置上的成像。在成像过程中，细胞被保持在37℃下。对来自于两个独立的试验中的代表性的图像进行了表示。正如附图9H-9J中所表示出的，在接种后的两天时，利用异硫氰酸荧光素(FITC)共轭型鬼笔环肽对存在于人类间充质干细胞中的丝状肌动蛋白进行了标记。同样报道出的是所述的平均投影面积+/-标准偏差。在每种情形下，对七个随机选择的区域内的至少40个细胞进行了计数。在附图9A-9F中的比例尺为900微米，而在附图9G-9I中的比例尺为20微米。
在250帕凝胶上经过两天之后，人类间充质干细胞形成一种相对小的、圆形的形态，并且具有杂乱的丝状肌动蛋白细胞骨架，正如附图9A以及9G中所表示出的，其中所述的凝胶利用纤维粘连蛋白以及胶原质I的混合物进行了覆盖。所述的人类间充质干细胞仅仅具有650+/-250平方微米的平均投影细胞面积，这明显小于3500+/-1100平方微米的延展面积，其中所述的延展面积是在覆盖有同样的粘附蛋白的玻璃上测量得到的。在存在于250帕凝胶之上的纤维原细胞、内皮细胞、以及星形细胞中观察到了一种类似的表现型(参见Yeung T，Georges PC，Flanagan LA等人于2005年在Cell Motil Cytoskeleton《细胞运动性以及细胞骨架》60：24-34中发表的文章“Effects of substrate stiffness on cellmorphology，cytoskeletal structure，and adhesion《底物硬度对于细胞的形态学、细胞骨骼的结构、以及粘附作用所产生的影响》”；Pelham RJ，Jr.Wang Y.于1997年在Proc Natl Acad Sci USA.《美国科学院院刊》94：13661-13665中发表的文章“Cell locomotionand focal adhesions are regulated by substrate flexibility《细胞运动力以及黏着斑是由底物弹性进行调节的》”；Georges PC，MillerWJ，Meaney DF等人于2006年在Biophysical Journal《生物物理学杂志》90：3012-3018中发表的文章“Matrices with compliancecomparable to that of brain tissue select neuronal over glial growthin mixed cortical cultures《具有与大脑组织所具有的顺应性相当的基质在混合的皮质培养物中对完成了神经胶质生长的神经元的筛选》”)。当所述的培养时间延长至七天时，所述细胞中的一部分加强了它们对于顺应性基质的粘附性并且开始进行延展。然而，正如附图9D中所表示出的，所述的细胞数量并没有发生些微的增加。因此，在来源于骨髓的人类间充质干细胞中，柔软的凝胶诱导出一种圆形的形状，杂乱的丝状肌动蛋白以及细胞周期的停止。
作为比较，在7500帕的凝胶上被保持两天的人类间充质干细胞发生了部分延展，其具有2600+/-1500平方微米的投影细胞面积。正如附图9B以及9E中所表示出的，所述的人类间充质干细胞呈现出了某种程度的肌动蛋白组织化但很少量的应力纤维。经过七天之后，所述的人类间充质干细胞显著的增加它们的数量。正如附图9H中所表示出的，它们同样经由细胞-细胞间的接触进行了显著增加的延展。正如附图9C、9F以及9I中所表示出的，存在于玻璃之上的人类间充质干细胞呈现出了一种延展的形态，具有丰富的应力纤维，并且进行了快速的增殖。
为了调查基质所具有的弹性是否能够改变所述的人类间充质干细胞的增殖行为，正如附图10中所表示出的，对细胞进行5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)导入检测，其中所述的细胞是培养在各种不同的底物之上的。附图10表示的是对于5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)吸收的检测呈阳性的所述细胞的百分比，这表明在利用5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)进行培育的时期中，细胞在具有不同顺应性的底物上进行了增殖。将细胞在底物上放置48小时，在此之后在含有5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的介质中对所述的细胞进行过夜培育。在上述整个时期内将细胞保持在含有血清的介质中，除了所述的玻璃密集接种情形(GlassConfluent)之外，在所述的玻璃密集接种情形中，在向不含有血清的介质中加入5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)前的24小时里是需要所述血清的。利用抗-5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)对细胞的核进行染色并且利用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对所述的核进行复染色。在每一种底物上，对至少50个4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)阳性细胞的5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)染色情况进行检查，并且利用三次独立试验的平均值+/-SE(标准误差)来表示所述的数据，*p＜0.01证实了具有统计学显著意义。
在利用5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)进行过夜培育之后，事实上已经没有粘附在250帕凝胶之上的人类间充质干细胞进行了5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的导入。因此，尽管有所述血清的存在，DNA的复制作用是被抑制的(DNA复制是人类间充质干细胞的***过程中的一个必要的步骤)。在7500帕的凝胶之上，有接近一半的细胞在24小时内复制了它们的DNA。当被稀松的接种在玻璃上时，超过80％的所述细胞呈现出了细胞核的5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)染色。这些结果意味着在人类间充质干细胞中，底物的顺应性能够对所述细胞周期的进行产生显著的影响。
存在于一种柔软的底物之上的人类间充质干细胞的存活能力的受损能够下述的观察结果进行解释：尽管有所述血清的存在，存在于250帕凝胶之上的细胞发生了集中并且终止了增殖。然而，存在于250帕凝胶之上的人类间充质干细胞中没有导入台盼兰，这表明这些细胞并没有死亡。为了确定由柔软的凝胶诱导的所述细胞周期的停止是否是可逆的，将所述的细胞放置在一个准3D环境下，正如附图11A-11D中所表示出的。附图11A-11D描述的是一种准3D的环境对干细胞的形状以及增殖作用所产生的影响。将细胞接种在250帕的凝胶之上并且在含有血清的介质中培养2天之后对其进行成像(附图11A以及11B)。在第二天，使用另外一个250帕的凝胶(附图11C)或者玻璃盖片(附图11D)作为顶端底物，在准3D环境下建立所述细胞的三明治结构。两天之后，在同样的位置处再次对所述的细胞进行成像。在附图11A-11D中，所述的比例尺为100微米。
将一个250帕的凝胶或者一个玻璃盖片放置于圆形的非增殖性人类间充质干细胞之上，其中所述的人类间充质干细胞是存在于250帕的凝胶之上的，所述的凝胶或者玻璃盖片上均被覆盖有与所述的底部凝胶相同的基质配体。以三明治结构存在于所述的两层250帕凝胶之间的细胞保持圆形或者进行了小程度的延展。正如附图11C中所表示出的，没有观察到这些细胞的数量发生明显的增加。在另外一方面，正如附图11D中所表示出的，朝向顶端玻璃盖片的所述细胞进行了增殖并且变成纺锤形状。一旦人类间充质干细胞牢固的粘附在上层玻璃表面之上时，它们就脱离了所述的柔软底物。因此，通过接受来自于一种较为坚硬的底物的机械信号，存在于250帕凝胶之上的所述人类间充质干细胞有能力重新开始增殖作用。
存在于250帕的凝胶之上的人类间充质干细胞所发生的暂时性的生长停止引出了一个问题：这些细胞是否有能力进行分化。分化作用是经由一组高度协同的事件来实现的，所述的事件包括生长的停止以及细胞谱系限制性表现型的表达。已经报道了底物的弹性能够对人类间充质干细胞分化成的谱系进行指定。(参见Engler AJ，Sen S，Sweeney HL，Dishcher DE于2006年8月25日在Cell《细胞》126(4)：677-89中发表的文章“Matrix elasticitydirects stem cell lineage specification《对基质弹性指导干细胞谱系的说明》”)。在具有250帕的弹性的凝胶之上对人类间充质干细胞的脂肪细胞分化作用进行测试，其中所述的弹性与脂肪组织所具有的弹性是相当的。
当利用脂肪形成性分化培养基对存在于具有各种不同硬度的基质上的细胞进行处理时，在它们的核中导入5-溴-2’-脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)的所述细胞的百分比与积累脂质体液滴的所述细胞的百分比之间存在着一种互逆的关系，其中所述的脂质体液滴的积累是通过油红O(ORO)染色来进行探测的。
附图12A以及12B表示的是所述的人类间充质干细胞对脂肪形成性诱导介质所产生的应答。附图12A表示的是针对人类间充质干细胞中的脂质体积累所进行的油红O(ORO)染色。细胞被接种在250帕的底物、7500帕的底物、或者玻璃底物之上，并且在生长培养基中经历8天(-)，或者经历两个周期的脂肪形成性诱导(+)。附图12B表示的是所述的人类间充质干细胞对化学分化因子所产生的剂量应答，其中所述的人类间充质干细胞存在于250帕的凝胶之上(●)或者存在于玻璃之上(■)。细胞以2000个细胞/平方厘米的密度被接种在凝胶之上并且以20000个细胞/平方厘米的密度被接种在玻璃之上。在每一种底物上，对至少50个细胞进行计数。附图12A以及12B中的数据是用三个独立试验的平均值+/-标准误差来表示的并且是统计学显著的(*p＜0.02)。试验A以及试验B是利用不同批次的人类间充质干细胞来进行的。
正如附图12A中所表示出的，大约有75％的被稀松的接种在250帕凝胶之上的细胞中积累了脂质体液滴，而仅有大约20％的被稀松的接种在7500帕凝胶之上的细胞以及有2％的被稀松的接种在玻璃盖片之上的细胞通过进行脂质体液滴的积累从而对脂肪形成性分化培养基进行了应答。值得注意的是，当没有在脂肪形成性分化培养基中进行培育时，存在于250帕的凝胶之上的人类间充质干细胞不能够进行脂质体液滴的积累。这些结果表明，一种柔软的基质能够促进人类间充质干细胞的脂肪形成性分化作用。
通常通过对存在于玻璃之上的一种密集的单层培养物进行诱导的方式，来实现人类间充质干细胞的脂肪形成性分化作用。然而，在诱导介质中历经8天之后，与存在于玻璃之上的密集细胞相比，可以观察到存在于柔软的凝胶之上的稀松细胞中被诱导的更高比例的分化作用。为了进一步的确定来自于一种柔软凝胶中的机械信号是怎样对化学诱导的脂肪形成过程进行促进的，通过在两种环境中对生长停止进行诱导的方式，对存在于250帕凝胶之上的所述的人类间充质干细胞对一种脂肪形成性分化培养基的敏感性进行测试，其中所述的两种环境是：(1)被稀松的接种在250帕的凝胶之上以及(2)被密集的接种在玻璃盖片之上。对在这两种条件下的脂肪形成性分化率对于化学诱导因子浓度的降低所产生的应答进行比较。正如附图12B中所表示出的，随着所述的脂肪形成性因子的浓度的降低，存在于250帕凝胶之上的人类间充质干细胞所表现出的应答与存在于玻璃盖片之上的人类间充质干细胞所表现出的应答相类似。尽管发生在250帕凝胶之上的培养使得被稀松接种的人类间充质干细胞有能力进行脂肪形成性分化作用，这种环境不能够对人类间充质干细胞对它们的脂肪形成分化培养基所具有的敏感性产生影响。
存在于250帕的凝胶之上的生长停止性人类间充质干细胞所发生的有效的脂肪形成性分化作用提出了下述可能性：这些非增殖性细胞可能被分化成为前脂肪细胞并且成为一种脂肪形成性谱系，而不是仍然存在的静止态干细胞。为了确定这些细胞是否是静止态干细胞还是分化的前脂肪细胞，将人类间充质干细胞稀松的接种在一种柔软的凝胶之上并保持两天，使用上文中所讨论的准3D方法将其转移到一种玻璃盖片之上，并且最后在成骨细胞诱导介质中对其进行24天的培养。(正如上文中所讨论的，将存在于250帕凝胶之上的细胞转移到一种坚硬的底物之上，所述的细胞通过接触重新开始增殖作用并且在组织培养塑料板上获得一种典型的人类间充质干细胞的纺锤状表现型。
附图13A以及13B描述的是利用骨诱导介质进行刺激之后，利用茜素红(Alizarin Red)S显现的钙沉积。正如附图13A中所表示出的，将细胞在一种柔软的凝胶之上进行两天的培养，之后使用所述的准3D方法将其转移到一种玻璃盖片之上，并且之后在骨诱导介质对其进行24天的培养。正如附图13B中所表示出的，人类间充质干细胞在一种玻璃盖片上进行了24天的培养，其中所述的培养是在骨诱导介质中进行的。在附图13A以及13B中，所述的比例尺为200微米。
在成骨细胞诱导介质中经过24天之后，在所述的培养皿中，富含钙的细胞外物质是清晰可见的，并且其对于茜素红S的染色呈阳性，如附图13A中所表示的。基质的矿化作用是成骨细胞分化作用的一种晚期标记(参见Kundu AK，Putnam AJ于2006年在Biochem Biophys Res Commun.《生物化学与生物物理学研究通讯》347：347-357中发表的文章“Vitronectin and collagen Idifferentially regulate osteogenesis in mesenchymal stem cells《玻璃粘连蛋白与I型胶原质在间充质干细胞中对骨形成过程所进行的不同的调节》”)。
为了进行比较，将从未在柔软的凝胶之上进行培养的细胞接种在一种玻璃盖片之上并且利用成骨细胞诱导介质对其进行相同长度的时间的处理。正如所预料的，这些底物对于钙沉积的染色同样呈阳性，如附图13B中所表示的。在不使用成骨细胞诱导介质进行刺激的前提下，在上述的条件下均不能产生被茜素红S所染色的细胞外物质。这些结果证明了存在于250帕的凝胶之上的人类间充质干细胞保持了它们的多谱系潜能。因此，这些结果证实了被接种在柔软的凝胶之上的所述人类间充质干细胞不会进行分化，而是仍然作为干细胞而保持静止态。

Claims (28)

1.一种对间充质干细胞的发育进行调节的方法，包括将所述的间充质干细胞悬浮在一种凝胶基质之中的步骤，所述的凝胶基质中包括一种胶凝剂，其中所述的凝胶基质利用1型胶原质、纤维粘连蛋白、或者它们的组合物进行了覆盖，并且其中所述的凝胶基质被保持在一种预先确定的硬度；以及将所述的凝胶基质暴露在一种生长调节因子之中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的生长调节因子是一种物理因子，一种化学因子或者是它们的组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的物理因子是压力，温度或者是它们的组合。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述的凝胶基质中进一步包括的所述化学因子是一种诱导培养基。
5.根据权利要求2所述的方法，其中在所述的化学因子或者物理因子中的暴露导致了所述凝胶基质所具有的硬度的增加。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的凝胶基质所具有的硬度与所述的间充质干细胞分化成的所述微环境中的细胞外物质(ECM)所具有的硬度相符合。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的胶凝剂是一种重组纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其中存在于所述凝胶基质中的所述的重组纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白的浓度为1-20毫克/毫升。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述的重组纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白是一种异温动物的纤维蛋白或者纤维蛋白原蛋白。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述的凝胶基质是一种二维的凝胶基质。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的凝胶基质是一种三维的凝胶基质。
12.根据权利要求1所述的凝胶基质，其中所述的凝胶基质中进一步包括一种选自牛血清以及马血清的血清。
13.根据权利要求1所述的凝胶基质，其中所述的凝胶或者基质中进一步包括一种蛋白酶抑制剂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的凝胶基质具有大约0.1至2.5千帕的硬度。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述的凝胶基质中进一步包括一种粘附蛋白。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述的凝胶基质是一种纤维粘连蛋白/胶原质的混合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的纤维粘连蛋白/胶原质的比例为大约5∶1。
18.一种用于在体外成体干细胞中对静止态进行诱导或者保持并且对其生物学活性进行保持的方法，包括：将所述的成体干细胞与一种凝胶基质进行接触，其中所述的凝胶基质中包括一种细胞外物质，所述的细胞外物质与存在于所述的成体干细胞膜之上的整联蛋白进行了结合，所述的凝胶基质所具有的弹性在本质上类似于同样类型的体内成体干细胞的主要体内生物学微环境所具有的弹性；以及向所述的成体干细胞提供营养物质，用以对所述的体外成体干细胞的生物学活性进行保持。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的成体干细胞是一种间充质干细胞(MSC)。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述的成体干细胞选自由下列细胞所组成的组中：来源于骨髓的间充质干细胞(MSC)，肾脏干细胞，肝脏干细胞，来源于骨骼肌的间充质干细胞，来源于骨头的间充质干细胞，牙髓间充质干细胞，来源于心肌的间充质干细胞，来源于滑液的间充质干细胞，以及脐带间充质干细胞。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，在进行所述的接触之前，所述的成体干细胞不是处于一种静止状态下的。
22.一种用于在权利要求18所述的成体干细胞中诱导体外增殖作用的方法，包括将所述的体外成体干细胞与一种增殖诱导物质进行接触的步骤，其中所述的增殖诱导物质中包括一种凝胶基质，所述的凝胶基质与存在于所述的成体干细胞表面上的整联蛋白进行了连接，所述的凝胶基质所具有的弹性小于所述的体内成体干细胞的生物学微环境所具有的弹性；以及提供营养生长物质，用以促进所述的体外成体干细胞及其后代细胞的增殖作用并且保持所述的体外成体干细胞及其后代细胞的生物学活性。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的增殖诱导物质对于所述的成体干细胞所产生的表观弹性小于在一种体内成体干细胞的生物学微环境中存在的主要体内物质所具有的弹性的大约0.4至0.5倍，其中所述的体内成体干细胞与所述的成体干细胞是相同类型的。
24.一种用于在权利要求22所述的成体干细胞中诱导体外分化作用的方法，包括下述步骤：将所述的成体干细胞与一种分化物质进行接触，其中所述的分化物质中包括化学刺激，所选择的化学刺激能够刺激所述的成体干细胞的分化作用，使其分化成为一种预先确定的细胞类型；以及向所述的分化细胞提供一种分化细胞营养物质，用以保持所述的分化细胞的生物学活性。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述的成体干细胞是一种来源于人类骨髓的间充质干细胞，并且其中所述的分化细胞是一种成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，脂肪细胞，β-胰岛细胞，神经元细胞或者***细胞。
26.根据权利要求18所述的方法制备得到的成体干细胞，所述的成体干细胞被诱导或者被维持在静止态，并且其生物学活性被得以保持。
27.根据权利要求26所述的成体干细胞，其中所述的细胞是一种间充质干细胞(MSC)。
28.根据权利要求27所述的成体干细胞，其中所述的间充质干细胞是一种来源于骨髓的间充质干细胞(MSC)，肾脏干细胞，来源于肝脏的干细胞，来源于骨骼肌的间充质干细胞，来源于骨头的间充质干细胞，牙髓间充质干细胞，来源于心肌的间充质干细胞，来源于滑液的间充质干细胞，或者脐带间充质干细胞。
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