CN113980872A - 一株生产脂肽类生物表面活性剂的莫海威芽孢杆菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产生物表面活性剂的莫海威芽孢杆菌菌株，GenBank编录号为OK605547。该菌株分离自克拉玛依油田土壤中，通过对菌株形态特征观察、16S rDNA测序分析，确定该菌株为莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis），该菌株在每100 mL加入菜籽油2 mL，硫酸铵0.4 g，KH2PO40.1 g，Na2HPO4·12H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，酵母粉0.2 g的培养基中于35℃、160 rpm下振荡培养2天以上可以得到质量较好的表面活性剂产物。进行单条件优化实验，得出以2%蛋白胨为氮源，2%液体石蜡为碳源，35℃培养时得到的表面活性剂质量最优。该表面活性剂属于糖脂类生物表面活性剂，在石油化工、医药、洗涤护理、环境保护等诸多领域都有很广泛的应用前景和发展可能。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产脂肽类生物表面活性剂的莫海威芽孢杆菌菌株，该菌株GenBank编录号为OK605547。
背景技术
生物表面活性剂是在一定条件下由微生物代谢合成的具有表面活性的天然化合物。其同时存在亲水基团和疏水基团，能够定向排列在水-油两相界面，形成分子层，具有乳化、抑菌、增溶及降低界面张力等多方面功能。另外，生物表面活性剂作为一种次级代谢产物，分子结构更加复杂，占据更大的空间，稳定性一般不受温度、盐度和酸碱度等环境条件的影响。
相比于化学合成表面活性剂，生物表面活性剂能够显著降低界面张力且作为一种性能优良、环境友好型的表面活性剂，符合我国“绿色发展”的趋势，在石油化工、医药、洗涤护理、环境保护等诸多领域都有很广泛的应用前景和发展可能。
脂肽类生物表面活性剂是效果最好的一类生物表面活性剂，可大幅降低表面和界面张力，具有诸多突出的优良特性。尽管能产生脂肽的微生物资源非常丰富，但是真正达到生产水平的并不多，主要有枯草芽胞杆菌生产的Surfactin、Iturin和Fengycin；玫瑰孢链霉菌生产的Daptomycin；地衣芽胞杆菌生产的Lichenyishin；短小芽胞杆菌生产Pumilacidin、Esperin。
由于分离纯化难度大、生产成本高等因素的制约，绝大多数脂肽尚处于实验室研究阶段，目前的主要研究集中在化学结构的鉴定方面。因此，挖掘新型高效的脂肽类物质，使其充分发挥其多元化的功能，具有重要的科学意义和实际应用价值。
发明内容
为解决目前生物表面活性剂成本高，难以实现大规模工业化的问题，本发明的目的在于提供一种产生物表面活性剂的高产菌株及生产方法。
本菌株采样于克拉玛依油田土壤，经过富集培养后筛选得到。
通过对菌株形态特征观察、16S rDNA测序、比对和进化树构建分析，确定该菌株为莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis），其在GenBank中的编录号为OK605547。
菌株在营养琼脂平板上生长良好，菌落呈偏黄色、不透明，边缘不整齐；细胞杆状，芽孢中生、椭圆形。
本发明提供了利用莫海威芽孢杆菌生产生物表面活性剂的方法，包括以下步骤：
(1)对所述菌株进行种子培养；
(2)将种子培养得到的种子以原油或菜籽油为碳源进行增殖培养，增殖培养时间根据培养体系排油圈变化情况确定，培养结束得发酵液；
(3)将发酵液经酸沉淀、离心、萃取、浓缩，以及干燥，即得表面活性剂。
(4)通过单因子实验，对发酵培养液的碳源、氮源以及温度进行优化。
优选的，种子培养于28～32℃振荡培养至对数生长期，得莫海威芽孢杆菌种子。
优选的，所述富集发酵培养采用添加有菜籽油的无机盐培养基；增殖培养的条件为：于28～32℃、150～170rpm下振荡培养2d以上。
优选的，所述无机盐培养基的配方为：每100ml加入菜籽油2mL，硫酸铵0.4g，KH2PO40.1g，Na2HPO4·12H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，酵母粉0.2g。
优选的，单因素实验中，以2%蛋白胨为氮源，2%液体石蜡为碳源，35℃培养时得到的发酵液排油圈直径最大，所得表面活性剂质量最优。
附图说明
图1为菌株PGF23的16S rDNA的进化树。
图2为菌株PGF23在不同碳源的培养基中的排油圈直径变化图。
图3为菌株PGF23在不同液体石蜡含量的培养基中的排油圈直径变化图。
图4为菌株PGF23在不同氮源的培养基中的排油圈直径变化图。
图5为菌株PGF23在不同蛋白胨含量的培养基中的排油圈直径变化图。
图6为菌株PGF23在不同温度培养下的排油圈直径变化图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步详细说明
（一）培养基配方
1、富集发酵培养基：每100ml加入菜籽油2mL，硫酸铵0.4g，KH2PO4 0.1g，Na2HPO4·12H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，酵母粉0.2g，121℃灭菌20min，备用。
2、种子培养基（条件优化下发酵培养基）：每100ml加入Yeast Extract（酵母膏）1g， Peptone（蛋白胨）2g， glucose（葡萄糖)2g，121℃灭菌20min，备用。
3、固体培养基：每100ml加入Yeast Extract（酵母膏）1g， Peptone（蛋白胨）2g，glucose（葡萄糖)2g，琼脂粉2g，121℃灭菌20min，备用。
（二）莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）菌株的筛选。
1、样品的采集及富集培养
取10 g低温保存的土样加入100 mL无菌水中，在摇床中以30 ℃，160 rpm的条件培养30 min，取出后静置1 h，取10 mL溶液接种于100mL的以菜籽油为碳源的富集发酵培养基中，放入30 ℃摇床，于160 rpm培养2-3天（另设立一个对照组，除不加入土样之外其余同上）。
2、菌株的初步筛选与分离纯化
利用排油法对产生表面活性剂菌株进行初步筛选。具体方法为：向培养皿中加入40 mL去离子水，滴加3 mL菜籽油于水面上，取上步中适量菌液缓慢地滴加于油膜中心，对排油圈直径进行粗略测定。以不加样品的菌液作为对照组，产生排油圈的菌液中可能含有产生表面活性剂的菌株。将产生排油圈的菌液在固体培养基上进行划线分离，在30 ℃恒温箱中培养3-5天，得到单一纯种菌株。
3、菌株复筛
将初筛得到的纯种菌株以5%接种量接种到100 mL富集发酵培养基中，在30 ℃，160 rpm条件下培养2-3天后，对发酵液继续进行排油活性的测定，筛选出其中排油直径大于3 cm的菌株。
本发明从筛选到的8株单菌株中得到一株产表活剂能力较强的菌株PGF23。
（三）菌株发酵条件优化。
1、碳源的影响
碳源是微生物代谢的重要影响因素，分别选择葡萄糖、液体石蜡、菜籽油、蔗糖为碳源进行比较。将菌种接种到已灭菌的 100mL 发酵培养基中，在30℃，160r/min 的条件下恒温振荡培养 3d。测定发酵液的排油圈直径，选出合适的碳源。之后进一步确定最合适碳源的在培养基中的含量。
2、氮源的影响
分别以酵母粉、硫酸铵、氯化铵、蛋白胨作为发酵培养液的氮源，碳源为单因素实验中确定的碳源，其他条件不变，在 30℃，160r/min 条件下，于摇床中振荡培养 3d，测发酵培养液的排油圈直径，确定最适的氮源。之后进一步确定最合适氮源的在培养基中的含量。
3、培养温度的影响
采用以上的单因素试验确定的碳源、氮源，其他组分不变，在振荡速率为 160r/min，不同温度下培养 3d，测发酵培养液的排油圈直径，确定最佳培养温度。
（四）单菌株的鉴定
分离的菌株通过比对16S rDNA序列来确定种属，送至南京擎科生物科技有限公司进行PCR扩增，Sanger测序
上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’
下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
所得序列经BLAST(NCBI)后，使用MEGA软件绘制进化树(图1)。最终确定菌株PGF23属于莫海威芽孢杆菌属（Bacillus mojavensis），命名为Bacillus mojavensis PGF23。
(五)菌株PGF23所产表面活性剂的提纯
将发酵液排油圈较大的PGF23菌株接种到富集培养基中培养三天，用NaOH将培养基pH调至7.0左右。在10000 rpm、4℃的条件下进行离心，离心时间为10分钟，之后将上清液单独倒出，在上清液中加入盐酸，将pH调节至2.0，在4 ℃静置24小时后按上述相同条件进行离心。将上清液用二氯甲烷按体积比1：1的比例进行萃取，萃取液在40℃条件下进行旋转蒸发，得到固体与第二次离心沉淀物合并即为粗提产物。
Claims (3)
1.一种生物表面活性剂高产菌株，该菌株为莫海威芽孢杆菌PGF23（Bacillus mojavensis PGF23），该菌株在GenBank中的编录号为OK605547。
2.一种生物表面活性剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)对莫海威芽孢杆菌PGF23进行种子扩大培养；
2)将扩大培养得到的种子以原油或菜籽油或液体石蜡为碳源进行增殖培养，增殖培养2-3天，得到发酵液；
3)发酵液采用酸沉淀、离心、萃取、浓缩，以及干燥等方法处理，得到表面活性剂。
3.根据权利要求2所述一种表面活性剂的制备方法，其特征在于：以2%蛋白胨为氮源，2%液体石蜡为碳源，35 ℃培养时所得发酵液排油圈直径均达到1.85cm左右，排油性能最佳，可知此时莫海威芽孢杆菌PGF23（Bacillus mojavensis PGF23）所产表面活性剂性能最优。
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