TWI537388B - 一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法 - Google Patents

一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI537388B
TWI537388B TW103141552A TW103141552A TWI537388B TW I537388 B TWI537388 B TW I537388B TW 103141552 A TW103141552 A TW 103141552A TW 103141552 A TW103141552 A TW 103141552A TW I537388 B TWI537388 B TW I537388B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
mutant strain
bacillus subtilis
semi
yield
fermentation
Prior art date
Application number
TW103141552A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201621050A (zh
Inventor
陸振岡
林逸朋
王心玫
Original Assignee
南京莎菲特生物科技有限公司
陸振岡
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 南京莎菲特生物科技有限公司, 陸振岡 filed Critical 南京莎菲特生物科技有限公司
Priority to TW103141552A priority Critical patent/TWI537388B/zh
Priority to EP15197196.7A priority patent/EP3029147A1/en
Priority to US14/955,444 priority patent/US9689017B2/en
Application granted granted Critical
Publication of TWI537388B publication Critical patent/TWI537388B/zh
Publication of TW201621050A publication Critical patent/TW201621050A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法
本發明係利用高產量枯草桿菌突變株與半固態發酵方式生產表面素的方法。
生物表面活性劑是由微生物在一定條件下發酵產生的二次代謝產物，同時具有親水性和疏水性之兩性結構。生物表面活性劑除了具有與化學合成表面活性劑相同或相近的物理及化學性質，亦具有結構複雜、專一性強、低毒性、可生物降解、環境友善及可利用廉價農副產品進行發酵生產等特性。而某些生物表面活性劑具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤…等等藥理作用。大多數的脂肽類生物表面活性劑具有抗微生物作用，也被稱為抗生素，目前發現的微生物脂肽主要有：表面素(surfactin)、豐原素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)和桿菌黴素(bacillomycin)、抗黴枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)等。目前，生物表面活性劑已廣泛地應用在化妝品、食品、石油及藥學等領域。
1968年Arima等人發現枯草桿菌生產的一種脂肽類生物表面活性劑，其活性極強，並將之命名為表面素，Arima等人當時製造的表面素產量僅有0.04-0.05g/L。1981年Cooper等人採用含4%葡萄糖的基本無機鹽 培養基培養枯草桿菌ATCC21332後，收集其泡沫並分離表面素，其產量為0.78g/L。1989年Mulligan等人發現一枯草桿菌紫外光突變株ATCC51338，其表面素產量為1.124g/L。1997年Kim等人使用一個改良的Cooper培養基，在限氧條件下培養枯草桿菌C9，其表面素產量為7.0g/L。2002年魏毓宏等人使用一種強化無機鹽培養基，以控制pH值方式，使得表面素的產量可以達到約3.5g/L。
目前枯草桿菌生產表面素之方式主要是以液態發酵為主，由於液態發酵可以調控的發酵參數較多，但主要調控的參數為培養基成份的組成、發酵條件之探討與高產量菌株篩選。研究結果顯示培養基中，不同的碳源確實會影響表面素的產量(Lang,et al.,1999；Wei,et al.,2004；Wei,et al.,2005)；以葡萄糖做為碳源可有效被枯草桿菌利用，但是培養基中，若含有過多的葡萄糖會造成pH值下降，而表面素產量也下降，因此得知表面素的生成與培養基中pH值有相當密切的關係(Yeh,et al.,2005)；於培養基中添加長鏈碳也有助於增加表面素的產量(Ghribi and Ellouze-Chaabouni,2011)。不同氮源會造成兩種影響：1.產量：調整Cooper在1981年提出的培養基配方，改變其氮源成分並培養於無氧的環境下，可提高表面素產量至7g/L(Kim,et al.,1997)；2.表面素結構：在培養液中添加不同的疏水性胺基酸會改變表面素的結構(Peypoux,et al.,1992)。當培養液中的二價及三價鐵離子的濃度由μg提升到mg，可有效增加枯草桿菌ATCC 21332的表面素產量，然而鐵離子的添加亦會造成培養基中pH值的下降，當pH值小於5時，枯草桿菌將不分泌表面素，因此添加鐵離子需配合調整pH值以利表面素生成(Wei and Chu,1998；Wei and Chu,1998)；於培養基中添加 錳離子可以顯著提高表面素的產量，亦不會影響到枯草桿菌的生長(Wei and Chu,2002)；將枯草桿菌培養於無金屬離子鎂、鉀、錳、鐵的培養基中，發現其細胞生長與表面素的產量皆明顯下降，因此證明此四種離子雖然為微量元素，但在培養過程中是不可或缺的(Wei,et al.,2007)。除了培養基中的成份會影響表面素的生成外，有學者指出在培養基中添加固體載體能有效增加表面素的產量，由於活性碳在發酵過程中不易分解，易與培養基分離，因此利用活性碳作為載體，能增加細胞量，延緩細胞進入停滯期，提高表面素的產量(Yeh,et al.,2005)。
液態發酵之缺點，由於發酵過程中，需要添加除泡劑，進而導致後續純化的困難，故需改變發酵方式來增加表面素的生產。
除了液態發酵方式之外，亦還有固態發酵方式，其基質成本較低，在發酵工業上是一種重要的發酵方式。文獻指出枯草桿菌ATCC 21332以馬鈴薯加工後廢棄物發酵，低固體含量的組別其表面素產量較高固體含量組別佳(Nitschke,et al.,2004)；枯草桿菌MI113以豆腐加工後所產生的副產品與廢棄物於37℃發酵48小時後，其表面素產量為2g/kg(Ohno,et al.,1995)；枯草桿菌(Bacillus polyfermenticus KJS-2)以黃豆發酵所生產的表面素，具有抗菌活性，其最小抑菌活性為0.05mg/mL(Kim,et al.,2009)。
固態發酵之缺點，包括：1.水分低限制了物質與能量的傳遞速率，發酵時產生的熱能不易消除，營養物質會形成濃度梯度，導致發酵不平均；2.發酵參數不易偵測(如pH質、生物量)，再現性差；3.基質攪拌不易，容易導致微生物的生長環境被破壞；4.發酵時間較液態發酵長。
表面素是目前所知表面活性最強的生物表面活性劑之一，自 從被發現以來，受到持續的關注，但是由於產量很低以及生產成本過高的問題，一直是脂肽類生物表面活性劑達不到商業化用途的原因，截至目前為止，仍無法實現表面素的工業化大規模生產，因此，許多發明者致力於提高表面素的產量。除此之外，由於生物發酵過程本身的不穩定性，從實驗室技術向工業化生產技術轉化是一個很難的問題。
如何降低生產成本是目前研發的主要目標，這需要選育優良的高產量菌株、合適且廉價的培養基以降低發酵成本並提高單位產量。此外，發酵後的基質之再利用與開發高附加值產品，這正是本發明要解決的技術問題。
本發明旨在於克服現有技術的不足，提供了一種脂肽類生物表面活性劑的商業化製備方法。此方法基於改善固態發酵之部分缺點採用半固態發酵。因為半固態發酵含水量較固態發酵高，可以改善物質與能量的傳遞速率，減少發酵時產生的熱能，加快發酵時間等問題，此外，藉由改變半固態發酵方式之含水量、發酵基質等發酵基本條件，並額外添加油脂與胺基酸補充其碳氮源，以提高半固態發酵時表面素的產量。這種生產技術具有產量高、效率高、發酵週期短、製程簡易，使得生產成本大量降低，適合商業化用途及工業化大規模生產，有助於脂肽類生物表面活性劑的推廣及應用。
本發明之目的係提供一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法。
該方法包括以下步驟，步驟一：將枯草桿菌(Bacillus subtilis ssp.)接種至營養液體培養基(Nutrient broth)，得一活化菌液；其中該營養液體培養基係包括蛋白胨(peptone A)5.0g/L、氯化鈉(NaCl)5.0g/L、牛肉萃取物(beef extract)1.5g/L、酵母萃取物(yeast extract)1.5g/L、pH值為7.4±0.2。
步驟二：將活化菌液以物理或化學方法突變處理，得一混合菌液；其中該物理方法係以紫外光(UV)波長254nm，3,500-4,500μW/cm2，處理1-50秒；該化學方法係以15-20μg/ml溴化乙錠(EtBr)於25-30℃處理20-28小時。
步驟三：將該混合菌液接種於一營養固體培養基(Nutrient agar)，於25-30℃培養12-20小時，取得單一菌落；其中該營養固體培養基係包括0.5%蛋白胨(peptone A)、0.3%牛肉萃取物(beef extract)、0.3%酵母萃取物(yeast extract)、0.5%氯化鈉(NaCl)、1.5%瓊脂(agar)、pH值為6.8。
步驟四：將該單一菌落接種於一無機鹽液體培養基(Mineral salt medium)，於25-30℃培養20-28小時後，由該單一菌落篩選出高產量突變菌株；其中該突變菌株係sfp表現量較高者，當sfp表現量越高，其表面素生成量越多；該無機鹽液體培養基係包括2-6%(v/v)葡萄糖、35-45mM磷酸氫鈉(Na2HPO4)、25-35mM磷酸二氫鉀(KH2PO4)、45-55mM硝酸銨(NH4NO3)、5-10mM氯化鈣(CaCl2)、2-6mM乙二胺四乙酸鈉(Sodium EDTA)、750-850mM含水硫化鎂(MgSO4.7H2O)、1-3mM含水硫化鐵(FeSO4.7H2O)。
步驟五：將該高產量突變菌株接種至含無機鹽液體培養基與黃豆之混合物，進行半固態發酵，得一發酵物；其中高產量突變菌株之接種體積與該混合物中黃豆體積之比例為5：100-10：100；該無機鹽液體培養基 之體積與該混合物中黃豆體積之比例為25：100-35：100；該半固態發酵係於溫度30-40℃，濕度80-90%，發酵2-3天。
步驟六：將該發酵物進行粗產物萃取，得一黃色沉澱物；其粗產物萃取步驟包括：A、將發酵物以純水清洗、將清洗過後的發酵物裝入250網目濾袋，以脫漿機進行固液分離；B、將該固液分離之液體以5000rpm於4℃，離心15分鐘，取其上清液，以濃鹽酸調整pH值至4.0，再以10000rpm於4℃，離心30分鐘，收集沉澱物；C、將該沉澱物懸浮於二氯甲烷(dichloromethane)之分液漏斗中，均勻震盪靜置使其分層，再取其有機層，以減壓濃縮機將有機溶劑揮發，即得一黃色沉澱物，係一粗表面素。
步驟七：將該黃色沉澱物溶於去離子水中，使用0.22μm濾膜過濾後，以裝有不同分子量大小(molecular weight cut-offs，MWCO)的纖維素膜(cellulose membrane)的磁吸攪拌式超過濾裝置(Amicon magnetically stirred ultrafiltration cell)在3kg/cm2的壓力下進行濃縮，再通過44.5mm中空纖維超濾濾芯(Hollow fiber ultrafiltration cartridges)於1.7x105帕(Pa)壓力下收集其過濾物，即得一純表面素。
本發明係提供一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法，其表面素生產量可以達到7.11g/kg。
第一圖係比較半固態發酵與固態發酵方式之表面素生成量。
第二圖係粗表面素之HPLC圖譜。
第三圖係枯草桿菌生長曲線與表面素產量關係。
第四圖係篩選sfp基因表現量高者為高量產表面素枯草桿菌突變株之標準。
第五圖係表面素之表面張力測定。
第六圖係表面素之乳化活性測定。
實施例一.篩選高產量枯草桿菌突變株
將泰國海水蝦池所分離出的枯草桿菌(Bacillus subtilis ssp.)以營養液體培養基(Nutrient broth)活化後，以20μg/ml溴化乙錠，於30℃突變處理24小時，再將突變處理後的菌液，以營養固態培養基(Nutrient agar)於30℃培養16小時，取單一菌落；將單一菌落以無機鹽液體培養基於30℃培養24小時，抽取其RNA，以核酸引子(primers)(見表一)分析sfp基因與rpo基因的相對定量，與控制組(未經溴化乙錠處理之菌株)做比較，篩選sfp基因表現量高者為高產量枯草桿菌突變株(寄存編號：BCRC910653)。
實施例二.半固態發酵法
將有機黃豆(美國產)浸泡16小時，以黃豆量的10%水量為添加量的比例於121℃蒸煮30分鐘，待冷卻至常溫後接種10%高產量突變菌株之菌液，並分別添加30%滅菌水(半固態發酵)、30%無機鹽液體培養基(半固態發酵)與不添加任何水份(固態發酵)，混合均勻後放至鐵盤上並以紗布覆蓋，於30℃，濕度80%，培養48小時，每24小時取發酵黃豆進行分析。
試驗結果如圖一所示：以無機鹽液體培養基進行半固態發酵之方式相較於另外2組，可以於發酵第2天，得到最佳的表面素產量。
實施例三.粗表面素之分析
將粗表面素溶於二次水，使用0.22μm濾膜過濾後，以逆相高效能液相層析儀(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析。利用Techsphere 5mm ODS C18逆相管柱(reverse column)，將管柱溫度控制在30℃，移動相為3.8mM，三氟乙酸：乙腈=1：4(trifluroacetic acid：acetonitrile)，流速為1ml/min，波長為210nm，樣品量為20μl(Wei et al.,2003)。
試驗結果如圖二所示：標準品為枯草桿菌ATCC 21332市售標準品(Sigma)。樣本為高產量突變株所生產之表面素。由先前研究指出，以MALDI-TOF分析其17分鐘的尖峰(peak)分子量最為接近表面素分子量1022kD，因此採用此時間點作為定量、定性分析
實施例四.枯草桿菌生長曲線與表面素產量之關係
於高產量枯草桿菌突變株生長期間，每12小時取其菌液並以分光光度計600nm測其吸光值，若吸光值大於0.7，則先稀釋後再測定；此外，於每12小時取10ml菌液，以逆相高效能液相層析儀分析其表面素產量。
試驗結果如圖三所示：枯草桿菌突變株在培養0到48小時為對數期(logarithmic phase)，48小時後進入平穩期(stationary phase)，而表面素的產量於培養後24小時開始增加，於培養後60小時達到穩定產量。
實施例五.sfp基因表現量與表面素產量之關係
取經過突變處理之單一菌落，以無機鹽液體培養基於30℃培養24小時，抽取其RNA，分析sfp基因與rpo基因的相對定量。
試驗結果如圖四所示：sfp/rpo的基因相對表現量較高者，其所能生成的表面素量亦較多。
實施例六.表面素之表面張力測定
以DST 30 Series Surface Tension Meter進行表面張力測定，純水做為控制組，其表面張力約為72mN/m，將表面素依序稀釋濃度為5×10-4M、1×10-4M、5×10-5M、1×10-5M、5×10-6M、1×10-6M、5×10-7M、1×10-7M、5×10-8M、1×10-8M，可得其臨界微胞濃度(critical micelle concentration,CMC)，試驗結果如圖五所示。
實施例七.表面素之乳化特性測定
係參考Cooper等人所使用的方法，將表面素溶於純水中並配製成不同濃度，取出2ml稀釋後的表面素溶液並添加3ml煤油於試管中，以vortex震盪2分鐘後，於室溫下靜置24小時，測量乳化層高度與溶液總高度之比值乘上100%即為該待測樣品之乳化指數。油品乳化能力之大小以乳化指數(emulsification index,E24)表示之，試驗結果如圖六所示。
實施例八.表面素之抑菌試驗
分別將大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)、哈威氏弧菌 (Vibrio harveyi)、溶澡弧菌(Vibrio alginolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、鮭弧菌(Vibrio salmonicida)、產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)培養於LBA(E.coli DH5α)或TSA(+1.5%NaCl)上，於37℃培養16小時後，刮下菌落並溶於指定培養液；使OD540為1時(濃度約為1×109/c.c.菌數)，取500μl菌液加入500μ的LB或TSB(+1.5%NaCl)，使菌液濃度1×104.5/c.c.菌數；使用96孔培養皿在每個凹槽加入130μl的菌液，菌液濃度為1×104.5/c.c.菌數，再加入20μl不同濃度的化學合成抗菌胜肽。於37℃培養16小時後，觀察呈現澄清的菌液(沒有生長)之最低抗菌胜肽濃度，即為最小抑菌濃度。
試驗結果如表二所示：與枯草桿菌ATCC21332所生產的表面素比較，由高產量枯草桿菌突變株，所生產的表面素其最小抑菌濃度為96.5μM。
【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
寄存機構：財團法人 食品工業發展研究所
日期：103年11月3日
編號：BCRC910653
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
無
<110> 南京莎菲特生物科技有限公司
<120> 一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4

Claims (8)

  1. 一種利用枯草桿菌(Bacillus subtilis)高產量突變株進行半固態發酵生產表面素之方法，該方法包括以下步驟：A、將該高產量突變株接種於一無機鹽液體培養基(Mineral salt medium)，於25-30℃培養20-28小時，由該單一菌落篩選出高產量突變菌株；B、將該高產量突變菌株接種至含無機鹽液體培養基(Mineral salt medium)與黃豆之混合物，進行半固態發酵，得一發酵物，其中高產量突變菌株之接種體積與該混合物中黃豆體積之比例為5：100-10：100，無機鹽液體培養基之體積與該混合物中黃豆體積之比例為25：100-35：100。；C、將該發酵物進行粗產物萃取，得一黃色沉澱物；D、將該黃色沉澱物純化，即得一純表面素；該枯草桿菌高產量突變株係表面素產量高於一般野生型枯草桿菌之突變株；該枯草桿菌高產量突變株寄存於財團法人食品工業研究所，寄存編號為BCRC910653。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之利用枯草桿菌高產量突變株進行半固態發酵生產表面素的方法，其中步驟D之無機鹽液體培養基(Mineral salt medium)係包括2-6%(v/v)葡萄糖、35-45mM磷酸氫鈉(Na2HPO4)、25-35mM磷酸二氫鉀(KH2PO4)、45-55mM硝酸銨(NH4NO3)、5-10mM氯化鈣(CaCl2)、2-6mM乙二胺四乙酸鈉(Sodium EDTA)、750-850mM含水硫化鎂(MgSO4.7H2O)、1-3mM含水硫化鐵(FeSO4.7H2O)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之利用枯草桿菌高產量突變株進行半固態發酵生產表面素的方法，其中步驟A之高產量突變菌株係sfp mRNA表現量較高者。
  4. 如申請專利範圍第1項或第7項所述之利用枯草桿菌高產量突變株進行半固態發酵生產表面素的方法，其中步驟A之高產量突變菌株之sfp mRNA表現量越高，其表面素生成量越多。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之利用枯草桿菌高產量突變株進行半固態發酵生產表面素的方法，其中步驟B之半固態發酵係於溫度30-40℃，濕度80-90%，發酵2-3天。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之利用枯草桿菌高產量突變株進行半固態發酵生產表面素的方法，其中步驟C之粗產物萃取，其步驟包括：A、將步驟B之一發酵物以純水清洗、進行固液分離；B、將該固液分離之液體以低溫離心，取其上清液後，再以低溫離心，收集沉澱物；C、將該沉澱物懸浮於二氯甲烷(dichloromethane)中，取其有機層，得一黃色沉澱物。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之利用枯草桿菌高產量突變株進行半固態發酵生產表面素的方法，其中該黃色沉澱物係一粗表面素。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之一種利用枯草桿菌高產量突變株進行半固態發酵生產表面素的方法，其中步驟D之純化係以磁吸攪拌式超過濾裝置(Amicon magnetically stirred ultrafiltration cell)及中空纖維超濾濾芯(Hollow fiber ultrafiltration cartridges)進行純化。
TW103141552A 2014-12-01 2014-12-01 一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法 TWI537388B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW103141552A TWI537388B (zh) 2014-12-01 2014-12-01 一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法
EP15197196.7A EP3029147A1 (en) 2014-12-01 2015-12-01 A method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp
US14/955,444 US9689017B2 (en) 2014-12-01 2015-12-01 Method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of Bacillus subtilis subsp

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW103141552A TWI537388B (zh) 2014-12-01 2014-12-01 一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TWI537388B true TWI537388B (zh) 2016-06-11
TW201621050A TW201621050A (zh) 2016-06-16

Family

ID=54770922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW103141552A TWI537388B (zh) 2014-12-01 2014-12-01 一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9689017B2 (zh)
EP (1) EP3029147A1 (zh)
TW (1) TWI537388B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018187749A2 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Locus Ip Company, Llc Production and cryopreservation of high concentration inocula
US11414640B2 (en) 2017-10-31 2022-08-16 Locus Ip Company, Llc Matrix fermentation systems and methods for producing microbe-based products
CN108823250A (zh) * 2018-06-21 2018-11-16 华东理工大学 一种提高生物表面活性剂产率的工业发酵生产工艺
CN109517847A (zh) * 2018-12-04 2019-03-26 张白羽 一种利用水产品废弃物发酵制备生物表面活性剂的方法
CN110669811A (zh) * 2019-10-21 2020-01-10 天津大学 一种提高表面活性素产量的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5037758A (en) * 1989-01-11 1991-08-06 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The National Research Council Of Canada Enhanced production of biosurfactant through the use of a mutated B subtilis strain
US5264363A (en) * 1990-06-22 1993-11-23 Eniricerche S.P.A. Mutant of Bacillus subtilis
EP0463393B1 (en) * 1990-06-22 1995-11-15 ENIRICERCHE S.p.A. A mutant of bacillus subtiles and a method of producing surfactin with the use of the mutant
CA2025812A1 (en) * 1990-09-20 1992-03-21 Catherine N. Mulligan Enhanced production of biosurfactant through the use of a mutated b. subtilis strain
IT1254918B (it) * 1992-04-24 1995-10-11 Eniricerche Spa Isolamento e caratterizzazione del gene sfp di bacillus subtilis
DE60139789D1 (de) * 2000-09-29 2009-10-15 Showa Denko Kk Verfahren zur surfactin herstellung
WO2010039539A2 (en) * 2008-09-23 2010-04-08 Modular Genetics, Inc. Growth of microorganisms in cellulosic media
WO2010151660A1 (en) * 2009-06-24 2010-12-29 Modular Genetics, Inc. Engineered microorganisms and methods of use
FR2980802B1 (fr) * 2011-10-03 2014-12-26 Univ Lille 1 Sciences Et Technologies Ustl Procede de production de biosurfactants et dispositif de mise en œuvre
CN103865855B (zh) * 2014-03-25 2017-03-29 南京工业大学 枯草芽孢杆菌菌株及其应用
US9364413B2 (en) * 2014-07-31 2016-06-14 Umo International Co., Ltd. Method for anti-aging treatment by surfactin in cosmetics via enhancing sirtuin
TWI659696B (zh) * 2014-12-12 2019-05-21 南京莎菲特生物科技有限公司 一種製備含高濃度表面素之飼料添加劑的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3029147A1 (en) 2016-06-08
TW201621050A (zh) 2016-06-16
US9689017B2 (en) 2017-06-27
US20160237467A1 (en) 2016-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI537388B (zh) 一種利用高產量枯草桿菌突變株進行半固態發酵生產表面素之方法
WO2016179735A1 (en) A method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp
CN104342390B (zh) 一种苜蓿中华根瘤菌株及其组合物与应用
CN105624080B (zh) 产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法
CN114107092B (zh) 一株降解邻苯二甲酸酯的植物内生菌戈登氏菌l191及其应用
CN106635872B (zh) 一株莫海威芽孢杆菌及其应用
JP6181972B2 (ja) 芳香族化合物の製造方法
CN111909881B (zh) 一株可产阿魏酸酯酶的短小芽孢杆菌及其应用
Yu Effect of mixed carbon substrate on exopolysaccharide production of cyanobacterium Nostoc flagelliforme in mixotrophic cultures
CN105950500A (zh) 一株溶藻气单胞菌及其在控制蓝藻水华中的应用
WO2022262874A1 (zh) 一种伯克霍尔德菌及其发酵产fr901464的方法
CN109112171A (zh) 一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法
CN108641968A (zh) 一种空间紫红曲霉FuH-23-4筛选及其在生产红曲色素中的应用
CN112143681B (zh) 一株可产阿魏酸酯酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN105802872B (zh) 一种荧光假单胞菌和生产吩嗪酰胺的方法及其应用
CN109136097B (zh) 降解异丙甲草胺的草酸青霉及其应用
JP4573187B1 (ja) 汚泥削減方法
RU2564105C1 (ru) ШТАММ БАКТЕРИЙ Exiguobacterium sp. -ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ
CN115247131B (zh) 深绿木霉及代谢产物和应用
CN116004750B (zh) 桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法
CN116179400B (zh) 一株产重排甾体化合物的黏细菌及其应用
CN110144303A (zh) 一种哌嗪二酮类化合物、菌株及制备与应用
RU2558299C1 (ru) ШТАММ БАКТЕРИЙ Rhodococcus sp. - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ
JP7489119B2 (ja) フェルラ酸エステラーゼ及びその応用
KR101058246B1 (ko) 코엔자임 ｑ10 생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈를 이용한 코엔자임 ｑ10의 대량생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees