CN102409017B - 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。枯草芽孢杆菌是通过筛选得到的一株驱油用菌株，可以在油层内生长繁殖，代谢产生脂肽类生物活性物质及蛋白酶类物质，起到剥离原油、油井解堵、提高采收率的功效。本发明是按5%的接种比例将枯草芽孢杆菌（Bacillussubfilis）CAWB16-8-3CCTCCNO.M2011289接种至液体培养基中，在35℃的温度条件下恒温通气培养；液体培养基配方为：每100ml水中含，酵母提取物0.5g，蔗糖2g，磷酸氢二钾0.8g，磷酸二氢钾0.05g，pH6.8。本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株CAWB16-8-3，可以显著降低接触角，48h脱油效率可达45%左右；该菌可以有效驱替出岩心内部饱和原油，使岩心驱替效率增加15%左右。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用
技术领域
    本发明涉及菌种及其培养方法与应用，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。
背景技术
石油是关系国民经济命脉的战略性资源，经过经过一次、二次两次常规采油之后的总采收率一般只能占地下原油的30%～40%。三次采油（EOR）技术是一项能够利用物理、化学和生物等技术提高原油采收率的重要油田开发技术。在过去数十年内，美国、加拿大和委内瑞拉等石油大国都把如何提高原油采收率作为研究工作的重点目标。随着社会经济持续快速增长，我国对油气需求量也不断增加。因此，运用三次采油技术来原油提高采收率，是减缓我国多数油田产量递减速度、维持原油稳产的战略需要。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）即是通过筛选得到的一株驱油用菌株，可以在油层内生长繁殖，代谢产生脂肽类生物活性物质及蛋白酶类物质，起到剥离原油、油井解堵、提高采收率的功效。
发明内容
本发明的目的是提供一株能改善原油物性、提高采收率的枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。
本发明所采用的技术方案是：
一株枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289。
一株枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289的培养方法，是按5%的接种比例将枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289接种至液体培养基中，在35℃的温度条件下恒温通气培养；
液体培养基配方为：每100ml水中含，酵母提取物0.5g，蔗糖2g，磷酸氢二钾0.8g，磷酸二氢钾0.05g，pH6.8。
所述的培养时间为48小时；
所述的溶解氧条件为5-7mg/L。
所述的一株枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289在低渗透性油田三次开发中提高采收率中的应用。
一株枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289在制备提高原油采收率生物制剂中的应用。
    本发明具有以下优点：
本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株CAWB 16-8-3，可以显著降低接触角，48h脱油效率可达45%左右；该菌可以有效驱替出岩心内部饱和原油，使岩心驱替效率增加15%左右。此外，该菌培养方法简单易操作，生长繁殖迅速，具有扩大化生产的可行性。基于上述特点，本发明的枯草芽孢杆菌菌株CAWB 16-8-3可用于油田的三次开发，提高洗油效率，降低含水，解除油井堵塞，增加产油量，提高原油采收率，并可借此开发出相应的生物制剂，用于环保污水治理，具有较高的科研、应用及市场价值。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌CAWB 16-8-3的生长曲线。
图2为枯草芽孢杆菌CAWB 16-8-3电镜照片。
图3为枯草芽孢杆菌CAWB 16-8-3附着在岩芯表面的照片。
图4为枯草芽孢杆菌CAWB 16-8-3枯深入岩芯孔的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明所涉及的枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3，已与2011年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2011289。
以下实施例用于说明本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
以下实施例中所涉及的培养基为：
所用培养基：
Figure 2011104192971100002DEST_PATH_IMAGE002
 富集用液体培养基：NaNO3 1.5g，（NH4）2SO4 1.5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2 0.002g，蒸馏水1000ml，原油5g，pH6.8。
Figure 2011104192971100002DEST_PATH_IMAGE004
 分离培养基为富集用液体培养基中添加2%琼脂。
Figure 2011104192971100002DEST_PATH_IMAGE006
 血平板培养基：LB固体培养基中添加5%新鲜羊血。
Figure 2011104192971100002DEST_PATH_IMAGE008
 脱脂奶粉培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，琼脂2.0g，进口脱脂奶粉3g，蒸馏水100ml，pH7.0～7.2。
实施例一：枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289的分离筛选与纯化：
1、石油降解菌株的富集与分离：将5g油泥样品加入100ml培养基
Figure 952061DEST_PATH_IMAGE002
中，35℃、150r/min摇床培养7d。待培养液混浊后，吸取5ml培养液重新转接入新鲜培养基
Figure 751389DEST_PATH_IMAGE002
中，与上述培养条件相同连续转接富集培养3次。采用稀释平板法进行分离，将培养液系列稀释后，取100μl稀释液涂布于培养基
Figure 900873DEST_PATH_IMAGE004
中，培养48h；待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，分别回接于培养基①和②中，在两种培养基中均能生长的即为石油降解微生物。
2、表面活性剂产生菌的筛选：由于表面活性剂具有降低表面张力的作用，可使红细胞破裂并释放血红素出现溶血圈，因此采用血平板法筛选。挑取活化好的石油降解菌株一环，点接于血平板上，35℃培养3d后若有溶血圈出现，证明该菌能产生表面活性剂。
3、蛋白酶产生菌的筛选：蛋白酶可以水解蛋白质，因此以脱脂奶粉为蛋白质源的培养基
Figure 393034DEST_PATH_IMAGE008
作为筛选蛋白酶产生菌的培养基。挑去表面活性剂产生菌株一环，点接于培养基
Figure 257829DEST_PATH_IMAGE008
上，35℃培养3d后若有溶解圈出现，证明该菌能产生蛋白酶。
4、纯化：挑取单菌落，转移到培养基
Figure 595269DEST_PATH_IMAGE002
中，35℃，120r/min振荡培养，至菌浓度达到107-108CFU/ml，取100μl涂布于LB固体培养基上，检测纯度，直至获得纯种菌株。
实施例二：枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289的培养方法：
（一）培养基的配方优化：
1、              碳源优化：考察了枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289对葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、酵母浸膏等几种碳源的利用情况，具体方法为：采取单因素分析试验，固定氮源成分为酵母提取物5g/L，改变碳源成分为葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、酵母浸膏等（均为20g/L），接种枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289，35℃，120r/min振荡培养48h，测定OD600，确定细菌生长情况，试验结果显示，蔗糖为适宜的碳源。
2、 氮源优化：考察了枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289对蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物这几种氮源的利用情况，具体方法为：采取单因素分析试验，固定碳源成分为蔗糖（20g/L），改变氮源成分为蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物（含量均为5g/L），接种枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289，35℃，120r/min振荡培养48h，测定OD600，确定细菌生长情况，试验结果显示，酵母提取物为适宜的氮源。
发酵培养基组分的正交试验：通过正交试验确定枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289发酵培养基各组分的最佳添加量，被考察因子与水平数如下：
表1 发酵培养基组分察因子与水平数列表
Figure 2011104192971100002DEST_PATH_IMAGE010
正交试验设计与数据分析如表2所示：
表2 培养基优化正交试验设计与结果
Figure 2011104192971100002DEST_PATH_IMAGE012
最佳组合：X13X24X33
回归方程为：y=0.1213X1+0.1794X2+0.029X3+4.4576
最佳培养基配方为：每100ml水中含，酵母提取物0.5g，蔗糖2g，磷酸氢二钾0.8g，磷酸二氢钾0.05g。
（二）培养方法：
按5%的接种比例将枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289接种至液体培养基中，在35℃的温度条件和5-7mg/L的溶解氧条件下恒温通气培养48小时。液体培养基配方为：每100ml水中含，酵母提取物0.5g，蔗糖2g，磷酸氢二钾0.8g，磷酸二氢钾0.05g，pH6.8。
实施例三：枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289的鉴定：
枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289属于芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，需氧，单个细胞0.7～0.8×2～3μm，着色均匀，无荚膜。呈椭圆状或柱状，芽孢形成后菌体不膨大。在LB平板中生长菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。该菌在LB液体培养基中生长繁殖的生长曲线如图1所示，进入对数期的时间为12～24小时，平衡期细菌浓度为108-109 CFU/ml。
图2为枯草芽孢杆菌CAWB 16-8-3电镜照片；图3为枯草芽孢杆菌CAWB 16-8-3附着在岩芯表面的照片；图4为枯草芽孢杆菌CAWB 16-8-3枯深入岩芯孔的照片。
实施例四：枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289的接触角：
接触角，也称润湿接触角，是指在固、液、气三相接触达到平衡时，三相接触周边的任一点上，液气界面切线与固体表面间形成的并包含液体的夹角，是润湿程度的量度。若接触角小于90°，则固体是亲液的，即液体可润湿固体，其角越小，润湿性越好；若接触角大于90°，则固体是憎液的，即液体不润湿固体，容易在表面上移动，不能进入毛细孔。
将一滴水或3%、5%枯草芽孢杆菌溶液滴在正戊烷处理过的石英片上，10min后用S-2接触角仪测定接触角，实验结果见表1。由结果可知，3%、5%的枯草芽孢杆菌溶液可以有效降低接触角，从而改变岩石润湿性，易于原油剥离。
表3 枯草芽孢杆菌溶液接触角测定结果（10min）
Figure 2011104192971100002DEST_PATH_IMAGE014
实施例五：检测枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289的驱油效率：
取烘干带油石英砂20，分别加入3%和5%的枯草芽孢杆菌溶液50ml，置于37度恒温箱中观察，分别于0.5，1，3，6，12，24，48小时后取出计算油量，实验结果见表4。3%和5%的枯草芽孢杆菌溶液在48h的脱油效率分别为40.3%和54.8%。
表4  枯草芽孢杆菌溶液脱油效率检测  
实施例六：检测枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289的室内驱替效率：
在室内模拟地下油藏的采油工艺过程，通过实验计算渗透率、采收率的变化，从而对能提高岩芯中的石油采出率的微生物进行评价。具体为用饱和有石油的岩芯样品代表地下的油层，用泵给岩芯样品的圆柱面加压，模拟地层的上覆压力，通过驱替设备给中间容器中的试验液体和岩芯加温到所需要的试验温度（60℃）并维持此温度；用计量泵在模拟地层的高压（最高到60 MPa）下向岩芯注入加热后的微生物液体，并注入岩芯样品，微生物会将岩芯样品中的石油驱除，然后收集计量采出的油量，并计算渗透率、采收率，从而对微生物性能进行评价。
表5  5%简单节杆菌溶液驱油实验数据
Figure 2011104192971100002DEST_PATH_IMAGE018
可以看出，枯草芽孢杆菌溶液注入后，可以驱替出水驱无法动用的原油，整体采收率增加了14.815%。

Claims (5)

1.一株枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289。
2.一株枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289的培养方法，是按5%的接种比例将枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289接种至液体培养基中，在35℃的温度条件下恒温通气培养；
液体培养基配方为：每100ml水中含，酵母提取物0.5g，蔗糖2g，磷酸氢二钾0.8g，磷酸二氢钾0.05g，pH6.8。
3.根据权利要求2所述的一株枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289的培养方法，其特征在于：
所述的培养方法的培养时间为48小时；
所述的培养方法的溶解氧条件为5-7mg/L。
4.权利要求1所述的一株枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289在低渗透性油田三次开发中提高采收率中的应用。
5.权利要求1所述的一株枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subfilis）CAWB 16-8-3 CCTCC NO.M2011289在制备提高原油采收率生物制剂中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694439B (zh) * 2015-03-24 2018-01-19 东华大学 一种降解原油细菌及其应用
CN106520104A (zh) * 2016-10-14 2017-03-22 常州亚环环保科技有限公司 一种耐温抗盐复合驱油剂的制备方法
CN109486726A (zh) * 2018-12-27 2019-03-19 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一株可降解石油烃的菌株及其应用
CN110951472A (zh) * 2019-12-09 2020-04-03 李国斌 一种生化联效的解堵剂及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101838621A (zh) * 2009-03-17 2010-09-22 大连百奥泰科技有限公司 枯草芽孢杆菌及脂肽类生物表面活性剂的制备方法
CN101935615A (zh) * 2010-07-02 2011-01-05 大连百奥泰科技有限公司 一种复合菌剂及处理返排压裂液为驱油活性水的生物方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101838621A (zh) * 2009-03-17 2010-09-22 大连百奥泰科技有限公司 枯草芽孢杆菌及脂肽类生物表面活性剂的制备方法
CN101935615A (zh) * 2010-07-02 2011-01-05 大连百奥泰科技有限公司 一种复合菌剂及处理返排压裂液为驱油活性水的生物方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一株产生脂肽的枯草芽孢杆菌的分离鉴定及脂肽对原油的作用;王大威 等;《微生物学报》;20080304;第48卷(第3期);304-311 *
王大威 等.一株产生脂肽的枯草芽孢杆菌的分离鉴定及脂肽对原油的作用.《微生物学报》.2008,第48卷(第3期),

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