CN113980835A

CN113980835A - 复合微生物菌剂及其在肥料中的应用

Info

Publication number: CN113980835A
Application number: CN202111115788.7A
Authority: CN
Inventors: 战帅; 王子浩; 张帅; 李洪顺; 刘巍
Original assignee: Sinochem Agriculture Linyi Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Sinochem Agriculture Linyi Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113980835B

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种复合微生物菌剂及其在肥料中的应用。复合微生物菌剂包括巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis和枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilis subsp.subtilis中的至少两种，菌株均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所提供的复合微生物菌剂可以用作制备肥料，可促进作物生长，例如对花生、大蒜、黄瓜、茄子、辣椒、柑橘多种作物均有促生作用，显著提高作物产量。

Description

复合微生物菌剂及其在肥料中的应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种复合微生物菌剂及其在肥料中的应用。

背景技术

近几十年来，为满足我国农作物生产的需求，我国肥料施用量不断升高，化肥产业迅速发展，2019年国内化肥消耗量(折纯)达5100万吨，单位施肥量达到21.9kg/亩，是欧盟的2.5倍，美国的2.6倍。过量施肥带来的环境问题日益严重，重视无机肥料而轻视生物有机肥料的现象，在全国各地普遍发生，土壤问题日益严重。为响应国家减肥减药的两减政策，积极推广使用生物生态类肥料，减少化学肥料的施用量，实现减肥、增产的目的，促进农业可持续发展。

微生物菌剂具有绿色无污染、使用无残留、改良土壤生态环境、抑制土传病害、提高土壤养分活性等优点，近年来微生物菌剂开始在农业上得到广泛应用。随着技术的发展，复合菌剂的应用逐渐代替了单一菌剂的应用，人们发现将不同作用的微生物菌剂进行复配，可以复合不同微生物菌剂的功能，互相促进增强促生效果，并且提高微生物菌剂在不同环境的适应能力，提高微生物的定植效果。

同时将复合微生物菌剂与复合肥料相结合，制成生物肥料，可以简化微生物菌剂的施用方法，增加肥料的效果，提高作物产量，最终达到肥料增效，作物增产的目的。

然而有关复合微生物菌剂还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明提供了一种复合微生物菌剂，其可以应用在肥料中提高肥料效果，促进作物生长并且可以抑制病害发生的。同时还提供了复合微生物菌剂的制备方法。

本发明的第一方面提供了一种复合微生物菌剂，包括：巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中的至少两种或者三种；所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21828；所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21827；所述枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilissubsp.subtilis 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21826。

在本发明的第二方面提供了一种复合微生物菌剂的制备方法，包括：将菌株分别进行发酵处理，基于发酵处理的产物获得微生物菌剂；将所述微生物菌剂进行复配，以便获得所述复合微生物菌剂。

在本发明的第三方面提供了一种肥料，所述肥料包括本发明第一方面所述的复合微生物菌剂。

在本发明的第四方面提供了一种复合微生物菌剂在制备肥料中的用途，所述肥料用作作物施肥，所述复合微生物菌剂为本发明第一方面所述的复合微生物菌剂。

本发明的第五方面提供了一种农作物施肥方法，包括：给予农作物施用复合微生物菌剂或者肥料，所述复合微生物菌剂为本发明第一方面所述的复合微生物菌剂，所述肥料为本发明第三方面所述的肥料。

本发明所取得的有益效果为：本发明所提供的微生物菌剂可以用作肥料中，能够起到促生的作用，显著增加作物的产量，尤其是可以增加花生、大蒜、黄瓜、茄子、辣椒、柑橘等的产量。

菌种保藏信息

巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium保藏编号为CGMCC No.21828，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年02月25日。

贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis保藏编号为CGMCC No.21827，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年02月25日。

枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilis subsp.subtilis，保藏编号为CGMCCNo.21826，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年02月25日。

附图说明

图1是根据本发明的实施例1提供的巨大芽孢杆菌的室内解磷能力评价结果图。

图2是根据本发明的实施例提供的巨大芽孢杆菌在TSA培养基培养的结果图。

图3是根据本发明的实施例1提供的巨大芽孢杆菌的16S rDNA的***分析结果图。

图4是根据本发明的实施例1提供的巨大芽孢杆菌的rpoB基因的***发育分析结果图。

图5是根据本发明的实施例1提供的贝莱斯芽孢杆菌在TSA培养基上的形态结果图。

图6是根据本发明的实施例1提供的贝莱斯芽孢杆菌的16S rDNA进行进化树分析的结果图。

图7是根据本发明的实施例1提供的贝莱斯芽孢杆菌的gyrB基因进行进化树分析的结果图。

图8是根据本发明的实施例1提供的枯草芽孢杆菌的形态结果图。

图9是根据本发明的实施例1提供的枯草芽孢杆菌的16S rDNA进行进化树分析的结果图。

图10是根据本发明的实施例1提供的枯草芽孢杆菌的gyrB基因进行进化树分析的结果图。

具体实施方式

下面结合附图详细描述本发明的实施例，需要说明的是，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本文中，如无特殊说明，当表述某种物质的含量时，是指的该物质的质量占总物质重量的百分比。

本文中，当提到对于疾病的“防治”时，“防治”不仅包括预防某种疾病的发生，还包括治疗某种疾病，从而减轻、降低、缓解疾病的症状。

本发明提供了一种复合微生物菌剂，包括：巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中的两种或者三种；所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21828；所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.21827；所述枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilis subsp.subtilis保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21826。所提供的各菌株均由本公司实验室分离保存。所提供的复合微生物菌剂可以促进作物生长，例如可以花生、大蒜、黄瓜、茄子、辣椒、柑橘多种作物产量，效果显著，可以进行生产应用。并且所提供的复合微生物菌剂可以和有机无机肥和复合肥相结合制成生物肥料，与不添加菌剂的处理相比增产效果4.27％～13.42％。所提到的枯草芽孢杆菌经鉴定属于枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilis subsp.Subtilis，因此在本文中在表述枯草芽孢杆菌时，也会根据需要表述为枯草芽孢杆菌枯草亚种。

在至少一些实施方式中，所述复合微生物菌剂为干粉状，每克所述复合微生物菌剂中含有所述巨大芽孢杆菌为500亿CFU～800亿CFU，含有所述贝莱斯芽孢杆菌为1000亿CFU～1500亿CFU，含有所述枯草芽孢杆菌枯草亚种1000亿CFU～1500亿CFU。所提到的 CFU做本领域通常理解，为菌落形成单位。

在至少一些实施方式中，所述复合微生物菌剂包括：30～35重量份的巨大芽孢杆菌， 25～35重量份的贝莱斯芽孢杆菌，30～40重量份的枯草芽孢杆菌枯草亚种。

本发明还提供了一种复合微生物菌剂的制备方法，包括：将菌株分别进行发酵处理，基于发酵处理的产物获得微生物菌剂；将所述微生物菌剂进行复配，以便获得所述复合微生物菌剂。

在一些实施方式中，所述发酵处理包括：对菌株进行活化发酵培养，以便获得液体发酵菌液；对所述液体发酵菌液进行放大发酵培养，以便获得所述发酵处理的产物。

在进行活化发酵培养时，所用到的可以为LB培养液。活化培养的温度为37摄氏度，培养液在三角瓶中，并于150-250rpm条件下培养4～8小时，例如可以为6小时。在具体实施方式中，可以将平皿中保存的巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，分别用接种环接种至含有100mL LB培养液的三角瓶(250mL)中，37℃，150-250rpm，于恒温培养箱中培养6h，培养至对数生长期，OD₆₀₀值为0.5～0.8，种子液浓度不低于1亿/mL，分别得到接入发酵培养基中的巨大芽孢杆菌种子液、贝莱斯芽孢杆菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液。

其中用于巨大芽孢杆菌放大发酵培养的培养基包括豆粕，玉米粉，淀粉，葡萄糖，氯化钠，磷酸氢二钾，硫酸锰和消泡剂。在一些具体实施方式中，用于巨大芽孢杆菌放大发酵培养的培养基以重量份计包括：1～5重量份的豆粕，1～5重量份的玉米粉，0.1～1重量份的淀粉，0.1～1重量份的葡萄糖，0.02～0.3重量份的氯化钠，0.1～0.8重量份的磷酸氢二钾， 0.01～0.2重量份的硫酸锰，和0.1～1重量份的消泡剂。在具体实施方式中，以重量百分比计，用于巨大芽孢杆菌放大发酵培养的培养基包括：豆粕3％，玉米粉2％，淀粉0.5％，葡萄糖 0.50％，氯化钠0.10％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸锰0.02％，消泡剂0.3％，余量为水，pH调节为7.0。各成分可以在0.1MPa条件下，连同发酵罐一起在121℃高压灭菌60min，待减压冷却到常压常温条件下备用。

用于贝莱斯芽孢杆菌放大发酵培养的培养基包括玉米淀粉，蔗糖，豆粕，酵母粉，蛋白胨，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，碳酸钙，氯化钠和消泡剂。在一些具体实施方式中，用于贝莱斯芽孢杆菌放大发酵培养的培养基以重量份计包括：2.5-3份的玉米淀粉，0.5-1份的蔗糖，3-4.5份的豆粕，0.15-0.20份的酵母粉，0.15-0.20份的蛋白胨，0.2-0.3份的磷酸氢二钾，0.2-0.3份的磷酸二氢钾，0.1-0.15份的碳酸钙，0.1-0.15份的氯化钠，和0.2-0.3份的消泡剂。在具体实施方式中，用于贝莱斯芽孢杆菌放大发酵培养的培养基以重量百分比计，包括：玉米淀粉2.5％-3％，蔗糖0.5％-1％，豆粕3％-4.5％，酵母粉0.15％-0.20％，蛋白胨 0.15％-0.20％，磷酸氢二钾0.2％-0.3％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％，碳酸钙0.1％-0.15％、氯化钠0.1％-0.15％，消泡剂0.2％-0.3％，余量为水，pH调节为7.0。各成分混合配制好后，可以在0.1MPa条件下，连同发酵罐一起在121℃高压灭菌60min，待减压冷却到常压常温条件下备用。

用于枯草芽孢杆菌枯草亚种放大发酵培养的培养基包括玉米淀粉，蔗糖，豆粕，酵母粉，蛋白胨，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，碳酸钙，氯化钠，和消泡剂。在一些具体实施方式中，用于枯草芽孢杆菌枯草亚种放大发酵培养的培养基以重量份计，包括：3.0-3.5重量份的玉米淀粉，0.8-1.0重量份的蔗糖，4.0-4.5重量份的豆粕，0.20-0.50重量份的酵母粉，0.20-0.50蛋白胨，0.2-0.3重量份的磷酸氢二钾，0.2-0.3重量份的磷酸二氢钾，0.1-0.15重量份的碳酸钙，0.1-0.15重量份的氯化钠，和0.3-0.5重量份的消泡剂。在具体实施方式中，用于枯草芽孢杆菌枯草亚种放大发酵培养的培养基以重量百分比计，包括：玉米淀粉3.0-3.5％，蔗糖0.8-1.0％，豆粕4.0-4.5％，酵母粉0.20-0.50％，蛋白胨0.20-0.50％，磷酸氢二钾0.2-0.3％，磷酸二氢钾0.2-0.3％，碳酸钙0.1-0.15％，氯化钠0.1-0.15％，消泡剂0.3-0.5％，余量为水，pH调节为7.0。各成分混合配制好后，可以0.1MPa条件下，连同发酵罐一起 121℃高压灭菌60min，待减压冷却到常压常温条件下备用。

在进行放大发酵培养时，所用到的发酵罐可以为中试发酵罐，例如可以为10L、50L或者500L的中试发酵罐，可以采用这些发酵罐进行逐级发酵。制备的巨大芽孢杆菌种子液、贝莱斯芽孢杆菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液分别接种于中试发酵罐中(10L-50L-500L)，保证各发酵培养体系中菌体初始浓度不低于100万/ml，在35-37℃条件下，罐压保持 0.05～0.10KPa，保证溶氧量20％～25％，转速180r/min，pH值7.0～8.0，进行培养36h-48h。发酵结束分别得到巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌发酵液，产孢率达90％以上，发酵液活菌数分别达到不低于50亿/mL、300亿/mL、300亿/mL。

所得到的发酵液按比例添加3％-5％硅藻土，通过喷雾干燥装置进行干燥、分装，即制得用于肥料中添加使用的巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌剂制剂，菌剂制剂活菌数分别达到巨大芽孢杆菌：500亿CFU/g～800亿CFU/g、贝莱斯芽孢杆菌1000 亿CFU/g～1500亿CFU/g、枯草芽孢杆菌1000亿CFU/g～1500亿CFU/g。

然后将所制备的不同的微生物菌剂按照不同的比例进行复配，获得复合微生物菌剂。在一些实施方式中，可以按30-35重量份的份巨大芽孢杆菌菌粉、25-35重量份的贝莱斯芽孢杆菌菌粉、30-40重量份的枯草芽孢杆菌菌粉，进行充分混匀制得复合微生物菌剂，活菌数达到800亿/g-1200亿/g。

本发明还提供了一种肥料，所述肥料包括上述所述的复合微生物菌剂。所述肥料还进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自复合肥、有机无机肥中的至少一种。肥料中复合微生物菌剂的含量可以根据需要添加，例如肥料中复合微生物菌剂的占比可以为千分之一至千分之五。所提供的肥料可以通过下述方法获得：将制备的复合微生物菌剂与防结粉混匀，将混匀后的粉剂在有机无机肥和复合肥生产的包膜工段中通过连锁蛟龙上料机添加到肥料滚筒中包裹在肥料颗粒表面，待稳定生产后制得相应的肥料，即为生物肥料，有效活菌数≥0.2亿/g。

例如，将所提供肥料应用在花生种植中，可以起到促生的作用，具体可以表现为在大田试验中相较于不添加复合微生物菌剂的处理组相比，添加了复合微生物菌剂的肥料使得产量增加10％以上，例如可以达到13％。

再例如，将所提供的肥料应用在大蒜种植中，可以起到促生的作用，具体可以表现为在大田试验中相较于不添加复合微生物菌剂的处理组相比，添加了复合微生物菌剂的肥料使得产量增加了5％以上，如增加了约7％。再例如将所提供的肥料应用在黄瓜种植中，可以起到促生的作用，具体可以表现为在大田试验中相较于不添加复合微生物菌剂的处理组相比，添加了复合微生物菌剂的肥料使得产量增加10％以上，如增加了约13％。再例如将所提供的肥料应用在茄子种植中，可以起到促生的作用，具体可以表现为在大田试验中相较于不添加复合微生物菌剂的处理组相比，添加了复合微生物菌剂的肥料使得产量增加10％以上，如增加了约11％。再例如将所提供的肥料应用在辣椒种植中，可以起到促生的作用，具体可以表现为在大田试验中相较于不添加复合微生物菌剂的肥料相比，添加了复合微生物菌剂的肥料使得产量产量增加3％以上，如增加了约4％。

再例如，所提供的肥料应用在柑橘(贡柑)种植中，可以起到促生的作用，具体可以表现为在大田试验中相较于不添加复合微生物菌剂的肥料来说，添加了复合微生物菌剂的肥料使得产量增加了10％以上，如增加了约12％左右。再例如，所提供的肥料应用在柑橘(冰糖橙)种植中，可以起到促生的作用，具体可以表现为在大田试验中相较于不添加复合微生物菌剂的肥料，添加了复合微生物菌剂的肥料使得产量增加了8％以上，如增加了约9％左右。

本发明还提供了一种复合微生物菌剂在制备肥料中的用途，所述肥料用作作物施肥，所述复合微生物菌剂为上述所述的复合微生物菌剂。本发明还提供了一种农作物施肥方法，包括：给予农作物施用复合微生物菌剂或者肥料，所述复合微生物菌剂为上述所述的复合微生物菌剂，所述肥料为上述所述的肥料。所提到的农作物可以为粮食作物，也可以为瓜果作物。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

实施例1分别获得了巨大芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌枯草亚种。

(一)巨大芽孢杆菌

从马铃薯根系表面采用平板涂布法和平板划线法分离获得巨大芽孢杆菌LY153-1，具体包括如下步骤：

在内蒙古自治区锡林郭勒盟正蓝旗马铃薯种植基地棕壤土中选取健康马铃薯根际土进行筛选。具体步骤为：将根部土壤轻轻抖落，然后将其放置在称量纸上用刀片轻刮根系，全部收集混匀，称取1g放入100mL无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min，然后进行梯度稀释，至10⁴倍，选取3个梯度进行涂布，每个梯度3个平行，在30℃培养箱中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在LB培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，菌株编号为LY153-1，并保存。

对巨大芽孢杆菌LY153-1解磷效果进行了如下测定：

(1)解磷效果评价方法

按照《NY/T 1847-2010微生物肥料生产菌株质量评价通用技术》中的检测方法，配置解磷液体培养基，接种解磷菌摇瓶培养，一定时间后取样测定可溶性磷的含量，对比接种前和接种后液体培养基可溶性磷的增加量。

无机磷解磷培养基配制：葡萄糖10g，(NH4)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO₄.7H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄.4H₂O 0.03g，Ca₃(PO4)₂ 10g，PH＝7.0，定容至1000mL；有机磷解磷培养基配制：其他成分与无机磷培养基相同，Ca₃(PO4)₂ 10g需要替换成卵磷脂 2g，定容至1000mL。

将巨大芽孢杆菌153-1接种到LB液体培养基中，培养3d后测OD₆₀₀值，调整菌液浓度1*10⁸cfu/mL。将以上调整浓度的培养液吸取5mL接入解磷培养基中，同时设置同系列功能菌株CK1，CK2(CK1，CK2均为实验室自主筛选，保存菌株)解磷效果对照。重复3次，培养4d后，将样品4000rpm，离心20min，取上清10mL，送检。

(2)解磷效果评价结果

153-1室内评价结果表明，如图1。

从图1可以看出，相对于对照菌株CK1，CK2来说，功能菌株LY153-1的解磷效果最好，对无机磷的解磷能力为204mg/L，高于《NY/T 1847-2010》标准191％，对有机磷的解磷能力为11mg/L，高于《NY/T 1847-2010》标准120％；与对照组CK1，CK2相比，对无机磷的解磷能力提高603％，98％，对有机磷的解磷能力提高22％，450％。

然后对巨大芽孢杆菌进行形态特征、生理生化特性以及分子生物学鉴定。

(1)形态特征：

革兰氏染色为阳性，菌体呈杆状，具圆端。在TSA培养基上，菌落近圆形，表面光滑，边缘整齐，淡黄色且不透明，有光泽。如图2所示。

(2)生理生化特性：

通过微生物脂肪酸快速鉴定***(MIDI)检测菌株LY153-1的脂肪酸组成，可知待测菌株的主要脂肪酸为C15:0anteiso，C15:0iso，C14:0iso和C16:1w11c其含量分别为42.73％，27.26％，7.90％和4.46％。符合芽孢杆菌属(Bacillus)的主要细胞脂肪酸特征。

API 50CH检测结果：阳性反应有L-***糖、L-木糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、N- 乙酰-葡糖胺、七叶灵、乳糖、蔗糖和海藻糖；弱阳性反应有甘油、半乳糖、甘露糖、肌醇、柳醇、麦芽糖、淀粉、拢牛儿糖和D-松二糖；阴性反应有对照、赤藓糖、D-***糖、核糖、D-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖甙、山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、山梨醇、α-甲基-D- 甘露糖甙、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁甙、熊果甙、纤维二糖、蜜二糖、菊糖、松叁糖、棉籽糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、D-***糖醇、L-***糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐。符合芽孢杆菌属 (Bacillus)的生化代谢特征。

(3)分子生物学特性：

1)菌株LY153-1的16S rDNA基因序列(1454bp)及***发育分析

GCCTGGCGGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTAT GACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGAT AACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATT GAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTG AGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCG CAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCG TAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGT ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTG ATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTG CAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGG AACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCG TGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA AGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC TCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGC ATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC CCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAA CCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACA CGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCAT AAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGC TAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCT AGCCGCATAAGGGGACAGA(SEQ ID NO:1)

其16S rDNA的***分析结果如图3所示。

2)LY153-1菌株的rpoB基因序列(385bp)及***发育分析

TGATCGAAACGGCTGAAGGTCCAAACATAGGTGAAGATGCGCTTCGCAACTTAGATG AGCGTGGAATCATCCGCATTGGTGCAGAAGTAAAAGACGGAGATCTTTTAGTTGGTAA AGTAACGCCAAAAGGTGTAACAGAACTAACAGCTGAAGAACGTCTTCTACACGCTAT TTTCGGTGAAAAAGCGCGTGAAGTTCGTGATACTTCTCTTCGTGTACCGCACGGCGGC GGTGGAATCATTCTTGATGTTAAAGTCTTCAACCGTGAAGATGGGGACGAATTACCAC CAGGTGTAAACCAATTAGTCCGTGTATATATTGTTCAGAAGCGTAAAATTTCTGAAGGT GACAAAATGGCCGGTCGTCACGGTAACAAGGGTGTAAA(SEQ ID NO:2)

其rpoB基因的***发育分析结果如图4所示。

通过菌株形态特征、生理生化特性以及分子生物学特性分析，该菌株被鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium.)。

(二)贝莱斯芽孢杆菌

从玉米根系表面采用平板涂布法和平板划线法分离获得贝莱斯芽孢杆菌，包括如下步骤：

(1)贝莱斯芽孢杆菌的分离筛选

在山东省临沂市河东区梅埠街道侯宅子村黄壤土中选取健康玉米根际土进行筛选。具体步骤为：将根部土壤轻轻抖落，用清水冲洗干净，然后将其放置在称量纸上用刀片轻刮根系，全部收集混匀，称取1g放入100ml无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min，然后进行梯度稀释，至10⁴倍，选取3个梯度进行涂布，每个梯度3个平行，在30℃培养箱中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在LB培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，分别编号保存。

通过菌株分离、纯化和鉴定，获得4株具有应用潜力的贝莱斯芽孢杆菌，分别编号为 012-2、025-2、121-1、LY149-1。

(2)草莓根腐病拮抗菌的筛选。

初筛：采用平板对峙法，制备PDA培养基，用打孔器分别在草莓疫霉菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、棒状拟盘多毛孢的平板边缘打取直径为5mm的菌饼，将其移植在新的PDA平板中央，同时将步骤1中筛选到菌株用牙签分别接种在平板四周，转移到25℃恒温培养箱中培养，观察记录菌株对病原菌的抑制程度。

复筛：通过再次对比筛选，获得对草莓根腐病病原菌具有拮抗效果，且拮抗效果最好的微生物菌株，并测定拮抗率，通过拮抗率计算，最终获得一株拮抗效果最好的菌株，即为贝莱斯芽孢杆菌LY149-1。

其中拮抗率通过下述公式计算获得：

拮抗率(％)＝(对照菌落半径–处理菌落半径)/对照菌落半径*100

其中公式中对照菌落半径是指以下述PDA培养基处理，对应的病原菌的菌落半径。

表1中列出了编号为LY149-1的菌株对于镰刀菌属病原菌的拮抗效果。

表1LY149-1菌株对镰刀菌属病原菌的拮抗效果

此外，对菌株代谢产物进行液相色谱质谱联用(LC-MS)分析，结果表明贝莱斯芽孢杆菌LY149-1能够产生卡那霉素、纳他霉素、生物素等拮抗活性物质。

然后对贝莱斯芽孢杆菌LY149-1进行了鉴定：

(1)形态特征：

对编号为LY149-1的贝莱斯芽孢杆菌进行鉴定，结果表明：革兰氏染色呈阳性，菌体杆状。在TSA培养基上，菌落呈不规则圆形，乳白色，质地粘稠，如图5所示。

(2)生理生化特性：

通过微生物脂肪酸快速鉴定***(MIDI)检测菌株LY149-1的脂肪酸组成，可知待测菌株的主要脂肪酸为C15:0anteiso、C15:0iso、C17:0anteiso和C17:0iso，其含量分别为42.09％，12.85％，18.71％和10.36％，符合芽孢杆菌属(Bacillus)的主要细胞脂肪酸特征。

API 50CH检测结果：

阳性反应有L-***糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、蔗糖、海藻糖、糖原、拢牛儿糖和D-松二糖；

弱阳性反应有甘油、肌醇、山梨醇、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、麦芽糖、菊糖、淀粉和葡萄糖酸盐；

阴性反应有对照、赤藓糖、D-***糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖甙、半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、α-甲基-D-甘露糖甙、乳糖、蜜二糖、松叁糖、棉籽糖、木糖醇、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、D-***糖醇、L-***糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐。

符合芽孢杆菌属(Bacillus)的生化代谢特征。

(3)分子生物学特性：

1)16S rDNA基因序列(1419bp)及***发育分析

经鉴定，16S rDNA基因序列如下所示：

TTCGGCGGCTGGCTCCTAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTG GTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCC GCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGA GAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATT GTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCT TCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAA GATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGAC GACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATT GTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATG CTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTAC TCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTA ACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCC CCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTG TTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGC ACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCA GACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCA CCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCG TCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGA TCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGA AGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGC CGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAA CTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTG AACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAG TCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGC(SEQ ID NO:3)

对该菌株进行16S rDNA进化树分析，结果如图6所示。

通过菌株16S rDNA进化树分析，该菌株符合芽孢杆菌属(Bacillus.sp)特征。

2)gyrB基因序列(1162bp)及***发育分析

对编号为LY149-1的菌株进行gyrB基因序列分析，结果如下所示： GGATAACGCGCTTTTTCAAGATTAAAATCTTCTCCGATTCCTGTTCCGAGGGCCGTGAT CATTGATCTGACCTCATTGTTTGAGAGAATCTTATCAAGTCTGGCTTTCTCAACGTTCA GAATCTTACCGCGCAGCGGCAGAATGGCTTGGAAATGACGGTCCCGTCCCTGTTTCGC TGATCCGCCCGCAGAGTCACCCTCTACGATATACAGCTCGGAAATGCTCGGATCTTTAG AAGAACAGTCCGCCAGTTTGCCCGGCAGATTGGAAATCTCAAGCGCACTTTTGCGGC GGGTCAATTCCCGCGCTTTTTTCGCTGCCATCCGCGCTCTTGCGGCCATTAAACCTTTT TCAACGATTTTGCGGGCTGAGTCCGGATTTTCAAGAAGGAATGTTTCCAGCGCAGAA GAAAACAGCGTATCAGTGATCGTTCTCGCTTCGGAGTTGCCGAGCTTCGTTTTCGTCT GCCCTTCGAATTGCGGATCAGGGTGCTTAATTGAAATAATGGCAGTCAGCCCTTCCCT CACATCATCCCCGCTTAAATTCGGATCATTTTCTTTGAAAATCCCTTTTCTTCTTGCATA GTCGTTTATAACACGGGTCAGACCGGTTTTAAATCCGGCTTCGTGCGTGCCGCCTTCGT ATGTGTTGATATTATTTGTGAAAGAATAAATATTGCTTGTATAGCTGTCGTTGTATTGCA ATGCAACTTCAACCGTTATGCCGTCTTTCTCGCCTTCGATATAAATCGGCTCTTCATGA ACGACTTCTTTGGAACGGTTTAAGTACTCAACATAGCTTTTGATTCCGCCTTCGTAGTG GTACTCGTTTTTCCGTTCTTGTCCTTCACGTTTGTCTTCAATCGTGATGTTTACACCTTT TGTCAGGAAGGCCAATTCCCGGACACGGTTTGAAAGCAGGTCATAGTCGTATTCGGTT GTTTCTTTGAAAATTTCCGGATCCGGAACGAAGTGCGTAATCGTTCCGGTCTTATCAGT ATCACCGATCACTTCAAGATCGGCCACAGGTACACCGCGCTCGTACGCCTGATAGTGG ATTTTTCCGTCACGATGAACCGTAACGTCAAGAGTGGTCGACAAGGCGTTTACGACA GACGCCCCTACACCGTGAAGACCGCCGGATACTTATATCCGCCTCCCGT(SEQ ID NO:4)

同时对gyrB基因进行进化树分析，如图7所示。

通过菌株gyrB基因进化树分析，该菌株与Bacillus velezensis strain A2的相似度达到 99.7％，亲缘关系最为相近。

总结：通过上述菌株形态特征、生理生化特性以及分子生物学特性分析，LY149-1菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

(三)枯草芽孢杆菌枯草亚种

从春红薯根际土中采用平板涂布法和平板划线法分离获得枯草芽孢杆菌枯草亚种。包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌枯草亚种的分离筛选：在河南省开封市通许县张营乡朱化岗村沙壤土中选取健康春红薯根际土进行筛选。具体步骤为：将植株根部土体土轻轻抖落，然后将根部放入装有200ml无菌水的三角瓶中，震荡10分钟，收集土壤悬液，离心收集土壤，称取1g放入100ml无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min，然后进行梯度稀释，至10⁴倍，选取3个梯度，每个梯度3个平行，在30℃培养箱中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在LB培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，分别编号保存，编号为LY005、A21、A100、A197。

(2)促生功能菌的筛选。

采用平皿促生试验进行筛选，制备LB培养液，将筛选出的各菌株进行摇瓶，30℃，180rpm，培养3天，收集发酵液，然后将发酵液稀释200-300倍，每个培养皿中放入20粒小麦种子，并将稀释完成的发酵液加入5ml，于25度培养箱中培养3-5天，检测芽长，以纯水作为对照，试验结果如表2所示。

表2不同菌株对小麦种子的促生效果

菌株	A21	A197	A100	LY005	对照
						芽长cm	2.60	2.81	2.97	3.21	2.11
比对照提高％	23.22	33.18	40.76	52.13	/

(3)代谢产物鉴定

选择编号为LY005菌株在LB培养液中培养3天，然后取10ml发酵上清液，用2倍体积的乙酸乙酯萃取，旋蒸蒸发浓缩至2ml，用少量乙腈进行复溶，转入液相瓶，备用。采用HPLC-MS对发酵上清液进行检测分析，结果显示代谢物中含有3-吲哚乙酸等促生物质。

然后对编号为LY005的菌株分别进行形态特征、生理生化特性以及分子生物学分析。

(1)形态特征：

革兰氏染色呈阳性，菌体杆状。在TSA培养基上，菌落近圆形，浅黄色，边缘呈矩齿状，如图8所示。

(2)生理生化特性：

通过微生物脂肪酸快速鉴定***(MIDI)检测编号为LY005的菌株的脂肪酸组成，可知该菌株的主要脂肪酸为C15:0anteiso、C15:0iso、C17:0anteiso和C17:0iso，其含量分别为42.09％，12.85％，18.71％和10.36％，符合芽孢杆菌属(Bacillus)的主要细胞脂肪酸特征。

API 50CH检测结果：阳性反应有L-***糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、蔗糖、海藻糖、糖原、拢牛儿糖和D-松二糖；弱阳性反应有甘油、肌醇、山梨醇、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、麦芽糖、菊糖、淀粉和葡萄糖酸盐；阴性反应有对照、赤藓糖、D-***糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖甙、半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、α-甲基-D-甘露糖甙、乳糖、蜜二糖、松叁糖、棉籽糖、木糖醇、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、L-岩糖、D-***糖醇、L-***糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐和5-酮基-葡萄糖酸盐。API 50CH结果表明该菌株符合芽孢杆菌属(Bacillus)的生化代谢特征。

(3)分子生物学特性：

1)16S rDNA基因序列(1417bp)及***发育分析

GCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTG TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCG ATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAA CAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTA GCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCC TCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGAT CAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGAC AACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTC AGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTC CACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCC CCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACA CTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCA CGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTC CTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACT CAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGAC TTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCT ACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTC AAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCC GAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGA TTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGA TCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTA GCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAA CCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCT TACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGC(SEQ ID NO:5)

16S rDNA基因序列的***发育分析结果如图9所示。

2)gyrB基因序列(1180bp)及***发育分析

CCGGGGAATGCGGCTATAAGTATCCGGAGGATTACACGGTGTAGGTGCGTCGGTCGTA AACGCACTATCAACAGAGCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCC AAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGACCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCA TACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAACAACCGA GTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGC GTAAACATCACGATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCAT TACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCC ATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTGGCTT TGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACAC GTACGAAGGCGGTACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAA CGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGAAAATGATCCAAACCTAAGCGGAGA TGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGCAGTTT GAGGGCCAAACAAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATAC GTTATTTTCTACGGCGATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCCAAAAAA ATTGTCGATAAAGGTTTAATGGCGGCAAGAGCAAGAATGGCTGCGAAAAAAGCGCGT GAACTAACACGCCGTAAGAGTGCTTTGGAAATTTCAAACCTGCCCGGTAAGTTAGCG GACTGCTCTTCAAAAGATCCGAGCATCTCCGAGTTATATATCGTAGAGGGTGACTCTGC CGGAGGATCTGCTAAACAAGGACGCGACAGACATTTCCAAGCCATTTTGCCGCTTAG AGGTAAAATCCTAAACGTTGAAAAGGCCAGACTGGATAAAATCCTTTCTAACAACGA AGTTCGCTCTATGATCACAGCGCTCGGCACAGGTATCGGAGAAGACTTCAACCTTGAG AAAGCCCGTACCACTAGAGAGATATCCAGC(SEQ IDNO:6)

gyrB基因序列的***发育分析结果如图10所示。

通过菌株形态特征、生理生化特性以及分子生物学特性分析，确定该菌株为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)。将该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21826。

实施例2复合微生物菌剂的制备

实施例2提供了制备复合微生物菌剂的方法，包括：1)种子液制备：将平皿中保存的巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，分别用接种环接种至含有100ml LB培养液的三角瓶(250mL)中，37℃，150-250rpm，于恒温培养箱中培养6h，培养至对数生长期，OD₆₀₀值为0.5～0.8，种子液浓度不低于1亿/mL，分别得到接入发酵培养基中的巨大芽孢杆菌种子液、贝莱斯芽孢杆菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液。

2)按照如下配方分别制备发酵培养基(以下均为质量百分比)：

发酵培养基A：豆粕3％，玉米粉2％，淀粉0.5％，葡萄糖0.50％，氯化钠0.10％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸锰0.02％，消泡剂0.3％，余量为水，pH调节为7.0，0.1MPa条件下，连同发酵罐一起121℃高压灭菌60min，待减压冷却到常压常温条件下备用。

发酵培养基B：玉米淀粉2.5％-3％，蔗糖0.5％-1％，豆粕3％-4.5％，酵母粉0.15％-0.20％，蛋白胨0.15％-0.20％，磷酸氢二钾0.2％-0.3％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％，碳酸钙0.1％-0.15％、氯化钠0.1％-0.15％，消泡剂0.2％-0.3％，余量为水，pH调节为7.0，0.1MPa条件下，连同发酵罐一起121℃高压灭菌60min，待减压冷却到常压常温条件下备用。

发酵培养基C：玉米淀粉3.0-3.5％，蔗糖0.8-1.0％，豆粕4.0-4.5％，酵母粉0.20-0.50％，蛋白胨0.20-0.50％，磷酸氢二钾0.2-0.3％，磷酸二氢钾0.2-0.3％，碳酸钙0.1-0.15％，氯化钠0.1-0.15％，消泡剂0.3-0.5％，余量为水，pH调节为7.0，0.1MPa条件下，连同发酵罐一起121℃高压灭菌60min，待减压冷却到常压常温条件下备用。

3)液体发酵：

将步骤1)制备的巨大芽孢杆菌种子液、贝莱斯芽孢杆菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液分别接种于中试发酵罐中(10L-50L-500L)，其中巨大芽孢杆菌采用发酵培养基A、贝莱斯芽孢杆菌采用发酵培养基B、枯草芽孢杆菌采用发酵培养基C，保证各发酵培养体系中菌体初始浓度不低于100万/mL，在35-37℃条件下，罐压保持0.05～0.10KPa，保证溶氧量20％～25％，转速180r/min，pH值7.0～8.0，进行培养36h-48h。发酵结束分别得到巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌发酵液，产孢率达90％以上，发酵液活菌数分别达到不低于50亿/mL、300亿/mL、300亿/mL。

4)将步骤3)中制得的发酵液按比例添加3％-5％硅藻土，通过喷雾干燥装置进行干燥、分装，即制得用于肥料中添加使用的巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌剂制剂，菌剂制剂活菌数分别达到巨大芽孢杆菌：500亿/g～800亿/g、贝莱斯芽孢杆菌1000 亿/g～1500亿/g、枯草芽孢杆菌1000亿/g～1500亿/g。

5)将步骤4)中制得的菌剂制剂，按巨大芽孢杆菌菌粉30-35份、贝莱斯芽孢杆菌菌粉25-35份、枯草芽孢杆菌菌粉30-40份，进行充分混匀制得复合微生物菌剂，活菌数达到800亿/g-1200亿/g。具体配比见表3所示。

表3复合微生物菌剂复配比例及活菌数

实施例3复合微生物菌剂在盆栽花生上的应用

盆栽试验地点为山东省临沂市中化化肥有限公司临沂农业研发中心温室大棚，供试作物为花生，品种为小白沙，试验采用盆栽试验，试验用土取自花生常年种植区10-20cm土层的土壤，去除各种杂质、砖块等，将土样晾干，过2mm筛。然后进行装盆，每盆装土8kg，试验用盆规格为，盆口直径28厘米，盆底直径24厘米，高为40厘米。

试验共设置7个处理组，分别为空白处理、添加巨大芽孢杆菌菌剂、添加贝莱斯芽孢杆菌菌剂、添加枯草芽孢杆菌菌剂、添加实施例2中制备的复合微生物菌剂1-3，每个处理均按2g/盆添加菌粉。每个处理种植20盆，每盆种植花生1株，按常规方法播种并常规管理。

产量测定标准为摘取每盆花生荚果，在烘箱中65℃烘至恒重，进行测定。

表4花生盆栽试验数据

处理	产量(g/株)
		空白	58.12
复合微生物菌剂1	65.11
		复合微生物菌剂2	63.22
复合微生物菌剂3	64.23
		巨大芽孢杆菌菌剂	62.12
贝莱斯芽孢杆菌菌剂	63.75
		枯草芽孢杆菌菌剂	59.32

从试验结果可以看出，复合微生物菌剂1处理效果最好，较空白处理产量提高12.03％；较巨大芽孢杆菌处理、贝莱斯芽孢杆菌处理、枯草芽孢杆菌处理产量分别增加4.81％、 2.13％、9.76％。由此可见，施用复合微生物菌剂可以提高花生产量，达到统计的显著水平，同时结果表明施用复合微生物菌剂效果优于施用单一微生物菌剂。

实施例4复合微生物菌剂在花生种植中的应用

首先制备含有复合微生物菌剂的肥料，制作工艺为：将实施例2中制备的复合微生物菌剂与防结粉混匀，将混匀后的粉剂在有机无机肥生产的包膜工段中通过连锁蛟龙上料机添加到肥料滚筒中包裹在肥料颗粒表面，待稳定生产后制得相应的肥料，即获得相应的微生物肥料，其中所用到的有机无机肥中有机质≥15％，N≥16％，P₂O₅≥12％，K₂O≥12％，所制备的肥料中含有的有效活菌数≥0.2亿/g。

将上述微生物肥料进行田间效果验证，花生田间试验在河南省正阳县熊寨镇魏庄村开展，试验田土壤理化性质为：有机质21.14g/kg，pH值为5.7，碱解氮132.59mg/kg，有效磷24.39mg/kg，速效钾156.29mg/kg。

试验设置5个处理组，分别为：

常规复合肥15-15-15/S、

有机无机肥16-12-12/S(含15％有机质)、

生物有机无机肥16-12-12/S(含15％有机质，添加实施例2中复合微生物菌剂1)、

生物有机无机肥2(添加实施例2中复合微生物菌剂2)、

生物有机无机肥3(添加实施例2中复合微生物菌剂3)，生物有机无机肥活菌数均为0.2亿/g。

所有试验处理均以底肥的形式施入到土壤中，施用量为50kg/亩，施用方式为撒施后机器翻耕，每小区面积为30m²，重复3次。按常规方法播种并统一管理。

产量测定标准为每小区选取3块1m²大小的正方形地块进行产量测定，摘取所有花生荚果，在烘箱中65℃烘至恒重，进行测定。

表5花生田间试验数据

处理	产量(kg/亩)
		常规复合肥	406.69
有机无机肥	430.23
		生物有机无机肥1	456.38
生物有机无机肥2	432.16
		生物有机无机肥3	450.11

从试验结果可以看出，微生物肥料均优于常规复合肥和有机无机肥，其中微生物肥料1效果最好，较常规复合肥和有机无机肥产量分别增加12.21％、6.08％。由此可见，在同等施肥量条件下施用微生物肥料可以有效提高花生产量。

实施例5复合微生物菌剂在盆栽大蒜上的应用

盆栽试验地点为山东省临沂市中化化肥有限公司临沂农业研发中心温室大棚，供试作物为大蒜，试验采用盆栽试验，试验用土取自大蒜常年种植区10-20cm土层的土壤，去除各种杂质、砖块等，将土样晾干，过2mm筛。然后进行装盆，每盆装土8kg，试验用盆规格为，盆口直径28厘米，盆底直径24厘米，高为40厘米。

试验共设置7个处理组，分别为空白处理、添加巨大芽孢杆菌菌剂、添加贝莱斯芽孢杆菌菌剂、添加枯草芽孢杆菌菌剂、添加实施例2中制备的复合微生物菌剂1-3，每个处理均按2g/盆添加菌粉。每个处理种植20盆，每盆种植大蒜3株，按常规方法播种并常规管理。分别在蒜苗期测定大蒜株高，大蒜蒜薹期收获蒜薹产量，大蒜成熟期收获大蒜产量。试验结果见表6。

株高测定标准为大蒜种植20天时进行测定每盆大蒜株高，蒜薹产量测定标准为摘取每盆大蒜蒜薹部位进行测定，大蒜产量测定标准为摘取每盆大蒜鳞茎部位进行测定。

表6大蒜盆栽试验数据

从试验结果可以看出，复合微生物菌剂1处理效果最好，较空白处理株高提高11.98％，蒜薹产量提高15.15％，大蒜产量提高18.98％；复合微生物菌剂1处理较巨大芽孢杆菌处理、贝莱斯芽孢杆菌处理、枯草芽孢杆菌处理株高分别增加2.78％、8.05％、12.11％，蒜薹产量分别增加8.91％、5.87％、7.90％，大蒜产量分别增加13.32％、10.47％、17.21％。由此可见，施用复合微生物菌剂可以促进大蒜生长并且提高蒜薹和大蒜产量，达到了统计的显著水平，同时结果表明施用复合微生物菌剂效果优于施用单一微生物菌剂。

实施例6复合微生物菌剂在大蒜种植中的应用

首先制备了微生物肥料：将实施例2中制备的复合微生物菌剂与防结粉混匀，将混匀后的粉剂在复合肥生产的包膜工段中通过连锁蛟龙上料机添加到肥料滚筒中包裹在肥料颗粒表面，待稳定生产后制得相应的肥料，即为微生物肥料，N≥12％，P₂O₅≥18％，K₂O≥15％，有效活菌数≥0.2亿/g。

将上述生物复合肥进行田间效果验证，大蒜田间试验在河南省开封市通许县开展，试验田土壤理化性质为：有机质65.21g/kg，pH值为5.5，碱解氮144.19mg/kg，有效磷84.55mg/kg，速效钾186.33mg/kg。

试验设置2个处理组，分别为：

复合肥12-18-15/S、

生物复合肥1(添加实施例2中复合微生物菌剂1)、

生物复合肥2(添加实施例2中复合微生物菌剂2)、

生物复合肥3(添加实施例2中复合微生物菌剂3)，生物复合肥活菌数均为0.2亿 /g。

所有试验处理均以底肥的形式施入到土壤中，施用量为80kg/亩，施用方式为撒施后机器翻耕，每小区面积为50m²，重复3次。按常规方法播种并统一管理。

产量测定标准为每小区选取3块1m²大小的正方形地块进行产量测定，摘取所有大蒜鳞茎，进行测定。试验数据见表7。

表7大蒜田间试验数据

处理	产量(kg/亩)
		复合肥	2569.77
生物复合肥1	2749.52.
		生物复合肥2	2678.12
生物复合肥3	2635.66

从试验结果可以看出，各生物复合肥效果均优于复合肥处理，其中生物复合肥1效果最好，较复合肥产量增加6.99％。由此可见，在同等施肥量条件下施用生物复合肥可以有效提高大蒜产量。

实施例7复合微生物菌剂在黄瓜种植中的应用

首先制备微生物肥料：将实施例1中制备的复合微生物菌剂与防结粉混匀，将混匀后的粉剂在有机无机肥生产的包膜工段中通过连锁蛟龙上料机添加到肥料滚筒中包裹在肥料颗粒表面，待稳定生产后制得相应的肥料，即为生物有机无机肥料，有机质≥15％，N≥18％， P₂O₅≥10％，K₂O≥12％，有效活菌数≥0.2亿/g。

将上述生物有机无机肥进行田间效果验证，黄瓜田间试验在山东省临沂市中化农业临沂研发中心试验田开展，试验田土壤理化性质为：有机质17.32g/kg，pH值为7.2，碱解氮 99.62mg/kg，有效磷32.56mg/kg，速效钾142.36mg/kg。

试验设置5个处理，分别为：

常规复合肥15-15-15/S、

有机无机肥18-10-12/S(含15％有机质)、

生物有机无机肥18-10-12/S(含15％有机质，添加实施例2中复合微生物菌剂1)，

生物有机无机肥2(添加实施例1中复合微生物菌剂2)，

生物有机无机肥3(添加实施例1中复合微生物菌剂3)，生物有机无机肥活菌数均为0.2亿/g。

所有试验处理均以底肥的形式施入到土壤中，施用量为40kg/亩，施用方式为撒施后机器翻耕，每小区面积为20m²，重复3次。按常规方法移苗并统一管理。

产量测定标准为每小区选取3块1m²大小的地块定点进行产量测定，每次采摘后累计计算产量，进行测定。试验结果见表8。

表8黄瓜田间试验数据

处理	产量(kg/亩)
		常规复合肥	2356.2
有机无机肥	2634.3
		生物有机无机肥1	2987.9
生物有机无机肥2	2879.3
		生物有机无机肥3	2744.5

从试验结果可以看出，生物有机无机肥效果均优于常规复合肥和有机无机肥，其中生物有机无机肥1效果最好，较常规复合肥和有机无机肥产量分别增加26.81％、13.42％。由此可见，在同等施肥量条件下施用生物有机无机肥可以有效提高黄瓜产量。

实施例8复合微生物菌剂在茄子种植中的应用

首先制备微生物肥料：将实施例2中制备的复合微生物菌剂与防结粉混匀，将混匀后的粉剂在有机无机肥生产的包膜工段中通过连锁蛟龙上料机添加到肥料滚筒中包裹在肥料颗粒表面，待稳定生产后制得相应的肥料，即为生物有机无机肥料，有机质≥15％，N≥18％， P₂O₅≥10％，K₂O≥12％，有效活菌数≥0.2亿/g。

将上述生物有机无机肥进行田间效果验证，茄子田间试验在山东省临沂市中化农业临沂研发中心试验田开展，试验田土壤理化性质为：有机质18.22g/kg，pH值为7.1，碱解氮 89.52mg/kg，有效磷35.62mg/kg，速效钾151.23mg/kg。

试验设置5个处理组，分别为：

常规复合肥15-15-15/S，

有机无机肥18-10-12/S(含15％有机质)，

生物有机无机肥2(添加实施例2中复合微生物菌剂2)，

生物有机无机肥3(添加实施例3中复合微生物菌剂3)，生物有机无机肥活菌数均为0.2亿/g。

产量测定标准为每小区选取3块1m²大小的地块定点进行产量测定，每次采摘后累计计算产量，进行测定。试验结果见表9。

表9茄子田间试验数据

处理	产量(kg/亩)
		常规复合肥	3152.6
有机无机肥	3501.0
		生物有机无机肥1	3898.5
生物有机无机肥2	3788.5
		生物有机无机肥3	3724.3

从试验结果可以看出，施用生物有机无机肥效果均优于常规复合肥和有机无机肥，其中生物有机无机肥1效果最好，较常规复合肥和有机无机肥产量分别增加23.66％、11.35％。由此可见，在同等施肥量条件下施用生物有机无机肥可以有效提高茄子产量。

实施例9复合微生物菌剂在辣椒种植中的应用

首先制备微生物肥料：将实施例2中制备的复合微生物菌剂与防结粉混匀，将混匀后的粉剂在有机无机肥生产的包膜工段中通过连锁蛟龙上料机添加到肥料滚筒中包裹在肥料颗粒表面，待稳定生产后制得相应的肥料，即为生物有机无机肥料，有机质≥15％，N≥16％， P₂O₅≥8％，K₂O≥16％，有效活菌数≥0.2亿/g。

将上述生物有机无机肥进行田间效果验证，辣椒田间试验在山东省临沂市中化农业临沂研发中心试验田开展，试验田土壤理化性质为：有机质15.22g/kg，pH值为7.2，碱解氮 102.35mg/kg，有效磷41.23mg/kg，速效钾142.69mg/kg。

试验设置5个处理组，分别为：

常规复合肥15-15-15/S，

有机无机肥16-8-16/S(含15％有机质)，

生物有机无机肥16-8-16/S(含15％有机质，添加实施例2中复合微生物菌剂1)，

生物有机无机肥2(添加实施例2中复合微生物菌剂2)，

产量测定标准为每小区选取3块1m²大小的地块定点进行产量测定，每次采摘后累计计算产量，进行测定。试验结果见表10。

表10辣椒田间试验数据

处理	产量(kg/亩)
		常规复合肥	1613.4
有机无机肥	1710.6
		生物有机无机肥1	1783.7
生物有机无机肥2	1732.2
		生物有机无机肥3	1764.3

从试验结果可以看出，生物有机无机肥效果均优于常规复合肥和有机无机肥，其中生物有机无机肥1效果最好，较常规复合肥和有机无机肥产量分别增加10.56％、4.27％。由此可见，在同等施肥量条件下施用生物有机无机肥可以有效提高辣椒产量。

实施例10复合微生物菌剂在柑橘(贡柑)种植中的应用

将上述生物有机无机肥进行田间效果验证，贡柑田间试验在广东省清远市连州市大路边镇开展，试验田土壤理化性质为：有机质19.65g/kg，pH值为5.6，碱解氮68.32mg/kg，有效磷55.32mg/kg，速效钾188.65mg/kg。

试验设置5个处理组，分别为：

常规复合肥15-15-15/S，

有机无机肥16-8-16/S(含15％有机质)，

生物有机无机肥2(添加实施例2中复合微生物菌剂2)，

所有试验处理均以底肥的形式施入到土壤中，施用量为1kg/株，约合50kg/亩，施用方式为沟施，施用深度为15-20cm，每小区20株树，重复3次。

产量测定标准为每小区选取5株长势均匀的树进行产量和果径测定。试验结果见表11。

表11贡柑田间试验数据

处理	产量(kg/亩)	果径(mm)
			常规复合肥	800.2	52.3
有机无机肥	814.0	54.6
			生物有机无机肥1	913.7	59.9
生物有机无机肥2	864.3	57.2
			生物有机无机肥3	884.3	58.6

从试验结果可以看出，生物有机无机肥效果均优于常规复合肥和有机无机肥，其中生物有机无机肥1效果最好，较常规复合肥和有机无机肥产量分别增加14.2％、12.2％；果径分别增加14.6％、9.7％。由此可见，在同等施肥量条件下施用生物有机无机肥可以有效提高贡柑果径和产量。

实施例11复合微生物菌剂在柑橘(冰糖橙)种植中的应用

首先制备肥料：将实施例2中制备的复合微生物菌剂与防结粉混匀，将混匀后的粉剂在有机无机肥生产的包膜工段中通过连锁蛟龙上料机添加到肥料滚筒中包裹在肥料颗粒表面，待稳定生产后制得相应的肥料，即为生物有机无机肥料，有机质≥15％，N≥16％，P₂O₅≥8％，K₂O≥16％，有效活菌数≥0.2亿/g。

将上述生物有机无机肥进行田间效果验证，冰糖橙田间试验在湖南省郴州市永兴县开展，试验田土壤理化性质为：有机质23.21g/kg，pH值为5.3，碱解氮121.35mg/kg，有效磷86.22mg/kg，速效钾176.59mg/kg。

试验设置5个处理组，分别为：

常规复合肥15-15-15/S，

有机无机肥16-8-16/S(含15％有机质)，

生物有机无机肥2(添加实施例2中复合微生物菌剂2)，

产量测定标准为每小区选取5株长势均匀的树进行产量和果径测定。试验结果见表12。

表12冰糖橙田间试验数据

处理	产量(kg/亩)	果径(mm)
			常规复合肥	1765.7	59.0
有机无机肥	1839.1	61.5
			生物有机无机肥1	2010.9	65.7
生物有机无机肥2	1962.6	63.4
			生物有机无机肥3	1922.4	64.1

从试验结果可以看出，生物有机无机肥效果优于常规复合肥和有机无机肥，其中生物有机无机肥1效果最好，较常规复合肥和有机无机肥产量分别增加13.9％、9.3％；果径分别增加11.4％、6.9％。由此可见，在同等施肥量条件下施用生物有机无机肥可以有效提高冰糖橙果径和产量。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“实施方式”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中化农业（临沂）研发中心有限公司

<120> 复合微生物菌剂及其在肥料中的应用

<130> BI3211472

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1454

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 1

gcctggcggc gtgcctatac atgcaagtcg agcgaactga ttagaagctt gcttctatga 60

cgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggcaacctgc ctgtaagact gggataactt 120

cgggaaaccg aagctaatac cggataggat cttctccttc atgggagatg attgaaagat 180

ggtttcggct atcacttaca gatgggcccg cggtgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg caacgatgca tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttagg 420

gaagaacaag tacgagagta actgctcgta ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg 540

ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt 600

ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag aaaagcggaa ttccacgtgt 660

agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcggct ttttggtctg 720

taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780

acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgcagctaa 840

cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960

aggtcttgac atcctctgac aactctagag atagagcgtt ccccttcggg ggacagagtg 1020

acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080

gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca tttagttggg cactctaagg tgactgccgg 1140

tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200

acacacgtgc tacaatggat ggtacaaagg gctgcaagac cgcgaggtca agccaatccc 1260

ataaaaccat tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ctggaatcgc 1320

tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtggag taaccgtaag gagctagccg 1440

cataagggga caga 1454

<210> 2

<211> 385

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 2

tgatcgaaac ggctgaaggt ccaaacatag gtgaagatgc gcttcgcaac ttagatgagc 60

gtggaatcat ccgcattggt gcagaagtaa aagacggaga tcttttagtt ggtaaagtaa 120

cgccaaaagg tgtaacagaa ctaacagctg aagaacgtct tctacacgct attttcggtg 180

aaaaagcgcg tgaagttcgt gatacttctc ttcgtgtacc gcacggcggc ggtggaatca 240

ttcttgatgt taaagtcttc aaccgtgaag atggggacga attaccacca ggtgtaaacc 300

aattagtccg tgtatatatt gttcagaagc gtaaaatttc tgaaggtgac aaaatggccg 360

gtcgtcacgg taacaagggt gtaaa 385

<210> 3

<211> 1419

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 3

ttcggcggct ggctcctaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60

gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120

tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga 180

tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg 240

tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300

tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg 360

cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420

cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga 480

cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540

ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat 600

gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg 660

cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag 720

ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc 780

gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc 840

tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac 900

gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960

tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt 1020

cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080

gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140

gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1200

tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga 1260

agccaccttt tatgtctgaa ccatgcggtt cagacaacca tccggtatta gccccggttt 1320

cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380

aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgactgc 1419

<210> 4

<211> 1162

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 4

ggataacgcg ctttttcaag attaaaatct tctccgattc ctgttccgag ggccgtgatc 60

attgatctga cctcattgtt tgagagaatc ttatcaagtc tggctttctc aacgttcaga 120

atcttaccgc gcagcggcag aatggcttgg aaatgacggt cccgtccctg tttcgctgat 180

ccgcccgcag agtcaccctc tacgatatac agctcggaaa tgctcggatc tttagaagaa 240

cagtccgcca gtttgcccgg cagattggaa atctcaagcg cacttttgcg gcgggtcaat 300

tcccgcgctt ttttcgctgc catccgcgct cttgcggcca ttaaaccttt ttcaacgatt 360

ttgcgggctg agtccggatt ttcaagaagg aatgtttcca gcgcagaaga aaacagcgta 420

tcagtgatcg ttctcgcttc ggagttgccg agcttcgttt tcgtctgccc ttcgaattgc 480

ggatcagggt gcttaattga aataatggca gtcagccctt ccctcacatc atccccgctt 540

aaattcggat cattttcttt gaaaatccct tttcttcttg catagtcgtt tataacacgg 600

gtcagaccgg ttttaaatcc ggcttcgtgc gtgccgcctt cgtatgtgtt gatattattt 660

gtgaaagaat aaatattgct tgtatagctg tcgttgtatt gcaatgcaac ttcaaccgtt 720

atgccgtctt tctcgccttc gatataaatc ggctcttcat gaacgacttc tttggaacgg 780

tttaagtact caacatagct tttgattccg ccttcgtagt ggtactcgtt tttccgttct 840

tgtccttcac gtttgtcttc aatcgtgatg tttacacctt ttgtcaggaa ggccaattcc 900

cggacacggt ttgaaagcag gtcatagtcg tattcggttg tttctttgaa aatttccgga 960

tccggaacga agtgcgtaat cgttccggtc ttatcagtat caccgatcac ttcaagatcg 1020

gccacaggta caccgcgctc gtacgcctga tagtggattt ttccgtcacg atgaaccgta 1080

acgtcaagag tggtcgacaa ggcgtttacg acagacgccc ctacaccgtg aagaccgccg 1140

gatacttata tccgcctccc gt 1162

<210> 5

<211> 1417

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 5

gcggctggct cctaaaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120

tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaacagattt 180

gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg tagcacgtgt 240

gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300

caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc 360

tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420

gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct 480

ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540

cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600

ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt 660

ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta 720

cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct 780

acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc 840

ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc cctttacgcc 900

caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960

ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg taccgcccta ttcgaacggt acttgttctt 1020

ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc 1080

agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140

tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtt gccttggtga 1200

gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc 1260

caccttttat gtttgaacca tgcggttcaa acaaccatcc ggtattagcc ccggtttccc 1320

ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac 1380

atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gacttgc 1417

<210> 6

<211> 1180

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 6

ccggggaatg cggctataag tatccggagg attacacggt gtaggtgcgt cggtcgtaaa 60

cgcactatca acagagcttg atgtgacggt tcaccgtgac ggtaaaattc accgccaaac 120

ctataaacgc ggagttccgg ttacagacct tgaaatcatt ggcgaaacgg atcatacagg 180

aacgacgaca cattttgtcc cggaccctga aattttctca gaaacaaccg agtatgatta 240

cgatctgctt gccaaccgcg tgcgtgaatt agccttttta acaaagggcg taaacatcac 300

gattgaagat aaacgtgaag gacaagagcg caaaaatgaa taccattacg aaggcggaat 360

taaaagttat gtagagtatt taaaccgctc taaagaggtt gtccatgaag agccgattta 420

cattgaaggc gaaaaggacg gcattacggt tgaagtggct ttgcaataca atgacagcta 480

cacaagcaac atttactcgt ttacaaacaa cattaacacg tacgaaggcg gtacccatga 540

agctggcttc aaaacgggcc tgactcgtgt tatcaacgat tacgccagaa aaaaagggct 600

tattaaagaa aatgatccaa acctaagcgg agatgacgta agggaagggc tgacagcgat 660

tatttcaatc aaacaccctg atccgcagtt tgagggccaa acaaaaacaa agctgggcaa 720

ctcagaagca cggacgatca ccgatacgtt attttctacg gcgatggaaa catttatgct 780

ggaaaatcca gatgcagcca aaaaaattgt cgataaaggt ttaatggcgg caagagcaag 840

aatggctgcg aaaaaagcgc gtgaactaac acgccgtaag agtgctttgg aaatttcaaa 900

cctgcccggt aagttagcgg actgctcttc aaaagatccg agcatctccg agttatatat 960

cgtagagggt gactctgccg gaggatctgc taaacaagga cgcgacagac atttccaagc 1020

cattttgccg cttagaggta aaatcctaaa cgttgaaaag gccagactgg ataaaatcct 1080

ttctaacaac gaagttcgct ctatgatcac agcgctcggc acaggtatcg gagaagactt 1140

caaccttgag aaagcccgta ccactagaga gatatccagc 1180

Claims

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，包括：

巨大芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌枯草亚种中的至少两种；

所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21828；

所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21827；

所述枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilis subsp.subtilis保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21826。

2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂为干粉状，每克所述复合微生物菌剂中含有所述巨大芽孢杆菌为500亿～800亿CFU，含有所述贝莱斯芽孢杆菌为1000亿～1500亿CFU，含有所述枯草芽孢杆菌1000亿～1500亿CFU。

3.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，包括：

30～35重量份的巨大芽孢杆菌，

25～35重量份的贝莱斯芽孢杆菌，

30～40重量份的枯草芽孢杆菌。

4.权利要求1～3中任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括：

将菌株分别进行发酵处理，基于发酵处理的产物获得微生物菌剂；

将所述微生物菌剂进行复配，以便获得所述复合微生物菌剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵处理包括：

对菌株进行活化发酵培养，以便获得液体发酵菌液；

对所述液体发酵菌液进行放大发酵培养，以便获得所述发酵处理的产物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，用于巨大芽孢杆菌放大发酵培养的培养基包括豆粕，玉米粉，淀粉，葡萄糖，氯化钠，磷酸氢二钾，硫酸锰和消泡剂；

优选地，用于巨大芽孢杆菌放大发酵培养的培养基以重量份计包括：

1～5重量份的豆粕，

1～5重量份的玉米粉，

0.1～1重量份的淀粉，

0.1～1重量份的葡萄糖，

0.02～0.3重量份的氯化钠，

0.1～0.8重量份的磷酸氢二钾，

0.01～0.2重量份的硫酸锰，和

0.1～1重量份的消泡剂；

用于贝莱斯芽孢杆菌放大发酵培养的培养基包括玉米淀粉，蔗糖，豆粕，酵母粉，蛋白胨，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，碳酸钙，氯化钠和消泡剂；

优选地，用于贝莱斯芽孢杆菌放大发酵培养的培养基以重量份计包括：

2.5-3份的玉米淀粉，

0.5-1份的蔗糖，

3-4.5份的豆粕，

0.15-0.20份的酵母粉，

0.15-0.20份的蛋白胨，

0.2-0.3份的磷酸氢二钾，

0.2-0.3份的磷酸二氢钾，

0.1-0.15份的碳酸钙，

0.1-0.15份的氯化钠，和

0.2-0.3份的消泡剂；

用于枯草芽孢杆菌放大发酵培养的培养基包括玉米淀粉，蔗糖，豆粕，酵母粉，蛋白胨，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，碳酸钙，氯化钠，和消泡剂；

优选地，用于枯草芽孢杆菌放大发酵培养的培养基以重量份计，包括：

3.0-3.5重量份的玉米淀粉，

0.8-1.0重量份的蔗糖，

4.0-4.5重量份的豆粕，

0.20-0.50重量份的酵母粉，

0.20-0.50蛋白胨，

0.2-0.3重量份的磷酸氢二钾，

0.2-0.3重量份的磷酸二氢钾，

0.1-0.15重量份的碳酸钙，

0.1-0.15重量份的氯化钠，和

0.3-0.5重量份的消泡剂。

7.一种肥料，其特征在于，所述肥料包括权利要求1～3中任一项所述的复合微生物菌剂；

任选地，每克所述肥料中含有所述复合微生物菌剂的有效活菌数在0.2亿CFU以上。

8.根据权利要求7所述的肥料，其特征在于，所述肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料选自复合肥、有机无机肥中的至少一种；

任选地，所述肥料中所述复合微生物菌剂的占比为千分之一至千分之五。

9.复合微生物菌剂在制备肥料中的用途，所述肥料用做作物施肥，所述复合微生物菌剂为权利要求1～3中任一项所述的复合微生物菌剂。

10.一种农作物施肥方法，其特征在于，包括：

给予农作物施用复合微生物菌剂或者肥料，所述复合微生物菌剂为权利要求1～3中任一项所述的复合微生物菌剂，所述肥料为权利要求7或8所述的肥料；

任选地，所述农作物选自花生、大蒜、黄瓜、茄子、辣椒、柑橘中的至少一种。