CN113945711A - 降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法，包括步骤：一，配制磁珠工作液；二，在配制好的磁珠工作液中加入新生牛血清；三，将加入新生牛血清的磁珠工作液在室温下混合均匀，进行反应；四，将完成与新生牛血清反应后的磁珠工作液进行清洗、静置分离，并按照浓度0.3mg/ml重新配制；五，采用上述步骤加入新生牛血清处理后配制的磁珠工作液进行抗髓过氧化物酶免疫球蛋白G抗体检测；该处理方法为通过向磁珠工作液中加入动物血清结合非特异性物质，以减少磁微粒的非特异吸附能力，显著降低检测过程中由于非特异性吸附而造成的假阳性结果，有效提高检测的灵敏度及特异性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法。
背景技术
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)兴起于上世纪70年代中期，发展至今已经成为一种成熟先进的超微量活性物质检测技术，应用范围十分广泛。该技术近10年发展迅猛，是目前推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级。
磁微粒是指磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料。由于磁微粒具有磁响应性，成本低、能耗少和无污染等特点，人们在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团(如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等)将酶、抗体、寡核苷酸等生物活性物质进行固定，可进一步用于酶的固定化、靶向药物载体、细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化及杂交检测等领域。传统的免疫学检测多以酶标板为固相载体，悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较之酶标板载体具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性等优点，目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。
自身免疫性疾病是指机体对自身的抗原产生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。常见有类风湿关节炎、***性红斑狼疮、干燥综合征、硬皮病、混合性***病、血管炎等疾病。
磁微粒与血清样本中非目的蛋白的非特异性吸附会造成假阳性结果，导致整体检测灵敏度降低。现有技术中常用的磁珠封闭剂有BSA、血清、酪蛋白等，但是这些常规的磁珠封闭剂不能满足产品的要求，因此有待改进。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术产品存在的部分非特异性吸附问题，而提供一种降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法，实现减少磁珠表面非特异性吸附以降低本底的技术效果。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法，包括以下步骤：
第一步：配制磁珠工作液；
第二步：在配制好的磁珠工作液中加入新生牛血清；
第三步：将加入新生牛血清的磁珠工作液在室温下混合均匀，进行反应；
第四步：将完成与新生牛血清反应后的磁珠工作液进行清洗、静置分离，并按照浓度0.3mg/ml重新配制；
第五步：采用上述步骤加入新生牛血清处理后配制的磁珠工作液进行抗髓过氧化物酶(MPO)IgG抗体检测。
前述的降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法，其中，
所述磁珠工作液为磷酸盐缓冲液配制的浓度0.3mg/ml的链霉亲和素磁珠工作液；
所述新生牛血清为特级新生牛血清；该新生牛血清在磁珠工作液中加入的体积浓度为10±5％；
所述加入新生牛血清的磁珠工作液在室温下混合均匀，进行反应14～18小时；
所述完成与新生牛血清反应后的磁珠工作液采用磷酸盐缓冲液清洗2次，清洗时保持磁珠工作液的浓度为0.3mg/ml，每次清洗时间为5-10min；清洗后静置分离至少2min，然后去除分离出的清洗液；
所述抗髓过氧化物酶(MPO)免疫球蛋白G(IgG)抗体检测为自身免疫抗体检测，是采用磁微粒化学发光免疫分析法检测试验。
前述的降低自身免疫抗体检测中非特异性吸附的处理方法，其中，所述磷酸盐缓冲液为常用磷酸盐缓冲液0.02M的PBS缓冲液。
本发明的降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法的有益效果，通过向磁珠工作液中加入新生牛血清结合血清样本中非特异性物质，以减少磁微粒的非特异吸附，显著降低检测过程中由于非特异吸附性而造成的假阳性结果，有效提高检测的灵敏度及特异性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步阐述。所描述的具体实施例仅用于和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法，其包括以下步骤：
第一步：配制磁珠工作液；
第二步：在配制好的磁珠工作液中加入新生牛血清；
第三步：将加入新生牛血清的磁珠工作液在室温下混合均匀，进行反应；
第四步：将完成与新生牛血清反应后的磁珠工作液进行清洗、静置分离，并按照浓度0.3mg/ml重新配制；
第五步：采用上述步骤加入新生牛血清处理后配制的磁珠工作液进行抗髓过氧化物酶(MPO)免疫球蛋白G(IgG)抗体检测。
本发明降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法，其中，
所述磁珠工作液为磷酸盐缓冲液配制的浓度0.3mg/ml的链霉亲和素磁珠工作液；所述新生牛血清为特级新生牛血清；该新生牛血清在磁珠工作液中加入的体积浓度为10±5％；所述加入新生牛血清的磁珠工作液在室温下混合均匀，进行反应14～18小时；所述完成与新生牛血清反应后的磁珠工作液采用磷酸盐缓冲液清洗2次，清洗时保持磁珠工作液的浓度为0.3mg/ml，每次清洗时间为5-10min；清洗后静置分离至少2min，然后去除分离出的清洗液；所述抗髓过氧化物酶(MPO)免疫球蛋白G(IgG)抗体检测为自身免疫抗体检测，是采用磁微粒化学发光免疫分析法检测试验。所述磷酸盐缓冲液为常用磷酸盐缓冲液0.02M的PBS缓冲液。
实施例1：
第一步，采用常规方法配制磷酸盐缓冲液备用。
第二步，用磷酸盐缓冲液配制浓度为0.3mg/ml的链霉亲和素磁珠工作液10ml，在配制好的磁珠工作液中加入体积浓度为5％即0.5ml的新生牛血清。
将加入新生牛血清的链霉亲和素磁珠工作液在室温下混合均匀，反应14至18小时。反应后的含有新生牛血清的链霉亲和素磁珠工作液用磷酸盐缓冲液清洗2次，每次清洗时磷酸盐缓冲液用量为10ml，每次清洗混匀5至10min；清洗后静置分离至少2min，清洗完成后重新配制成0.3mg/ml的磁珠工作液。
实施例2：
第一步，采用常规方法配制磷酸盐缓冲液备用。
第二步，用磷酸盐缓冲液配制浓度为0.3mg/ml的磁珠工作液10ml，在配制好的磁珠工作液中加入体积浓度为10％即1ml的新生牛血清。
将加入新生牛血清的链霉亲和素磁珠工作液在室温下混合均匀，反应14至18小时。反应后的含有新生牛血清的链霉亲和素磁珠工作液用磷酸盐缓冲液清洗2次，每次清洗时磷酸盐缓冲液用量为10ml，每次清洗混匀5至10min；清洗后静置分离至少2min，清洗完成后重新配制成0.3mg/ml的磁珠工作液。
实施例3：
第一步，采用常规方法配制磷酸盐缓冲液备用。
第二步，用磷酸盐缓冲液配制浓度为0.3mg/ml的磁珠工作液10ml，在配制好的磁珠工作液中加入体积浓度为15％即1.5ml的新生牛血清。
将加入新生牛血清的链霉亲和素磁珠工作液在室温下混合均匀，反应14至18小时。反应后的含有新生牛血清的链霉亲和素磁珠工作液用磷酸盐缓冲液清洗2次，每次清洗时磷酸盐缓冲液用量为10ml，每次清洗混匀5至10min；清洗后静置分离至少2min，清洗完成后重新配制成0.3mg/ml的磁珠工作液。
实施例4：
取实施例1、2和3处理方法制备的磁珠工作液，采用常规方法分别进行抗髓过氧化物酶(MPO)免疫球蛋白G(IgG)抗体检测，对比发光值的梯度及非特异的大小。
样本发光值测试：
第一步，采用常规方法配制磷酸盐缓冲液备用。
第二步，加样温育：向微孔板中分别加入30ul样本(抗髓过氧化物酶MPO-IgG抗体阴性血清(N1)、阳性血清(P1)或者阳性血清(P2))，然后加入100ul生物素-抗髓过氧化物酶MPO抗原结合物以及50ul本实用新型实施例1、2或3中制备的新生牛血清的链霉亲和素磁珠工作液，反应液在37℃温育30min。
第三步，清洗：先将微孔板在磁板上静置5min，倒掉微孔板内上清液；然后向微孔板中加入磷酸盐缓冲液混匀清洗；再将微孔板在磁板上静置5min，倒掉清洗用的磷酸盐缓冲液；重复清洗操作3次，每次使用200ul磷酸盐缓冲液清洗。
第四步，酶标二抗温育：向微孔板中加入100ul酶标二抗试剂，混匀，37℃温育30min。
第五步，清洗：微孔板在磁板上静置5min，倒掉微孔板内上清液；加入清洗缓冲液混匀，微孔板在磁板上静置5min，倒掉清洗液；重复以上操作3次，每次使用200ul清洗缓冲液。
第六步，读数：向微孔板内加入150ul化学发光底物，混匀，然后用化学发光免疫分析仪测读发光值，测试结果如表1所示。
样本非特异性(NSB)测试方法：
第一步，采用常规方法配制磷酸盐缓冲液备用。
第二步，加样温育：向微孔板中分别加入30ul样本(抗髓过氧化物酶MPO-IgG抗体阴性血清N1、阳性血清P1和P2)、50ul磁珠工作液，37℃温育30min。
第三步，清洗：微孔板在磁板上静置5min，倒掉微孔板内上清液。加入清洗缓冲液混匀，微孔板在磁板上静置5min，倒掉清洗液。重复以上操作3次，每次使用200ul清洗缓冲液。
第四步，酶标二抗温育：向微孔板中加入100ul酶标二抗试剂，混匀，37℃温育30min。
第五步，清洗：微孔板在磁板上静置5min，倒掉微孔板内上清液。加入清洗缓冲液混匀，微孔板在磁板上静置5min，倒掉清洗液。重复以上操作3次，每次使用200ul清洗缓冲液。
第六步，读数：向微孔板内加入150ul化学发光底物，混匀，然后用化学发光免疫分析仪测读发光值，测试结果如表1所示。
表1：实施例1、2和3制备的磁珠工作液检测结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 样本 | 发光值 | 发光值 | 发光值 |
| N1 | 8577 | 8319 | 9056 |
| P1 | 227604 | 265974 | 236499 |
| P2 | 946739 | 949877 | 910646 |
| NSB-N1 | 11223 | 11586 | 12730 |
| NSB-P1 | 12490 | 12863 | 12930 |
| NSB-P2 | 12782 | 12897 | 13141 |
| P1/N1 | 26.54 | 31.97 | 26.12 |
| P2/N1 | 110.38 | 114.18 | 100.56 |
注：表中N1：MPO-IgG抗体阴性血清1；P1：MPO-IgG抗体阳性血清1；P2：MPO-IgG抗体阳性血清2；NSB-N1：血清N1的非特异背景值；NSB-P1：血清P1的非特异背景值；NSB-P2：血清P2的非特异背景值；P1/N1：血清P1与N1检测发光值的比值；P2/N1：血清P2与N1检测发光值的比值。
实施例5：
分别以下列物质替换实施例1中制备的磁珠工作液中加入的新生牛血清，制作为对比例：对比例1为BSA(牛血清白蛋白)、对比例2为马血清、对比例3为山羊血清。
用常规测试方法，采用对比例1、2和3号分别进行发光值和非特异性的测试。
对比例发光值测试：
第一步，采用常规方法配制磷酸盐缓冲液备用。
第二步，加样温育：向微孔板中分别加入30ul样本(抗髓过氧化物酶MPO-IgG抗体阴性血清(N1)、阳性血清(P1)或者阳性血清(P2))，然后加入100ul生物素-抗髓过氧化物酶MPO抗原结合物以及50ul本实用新型实施例1、2或3中制备的新生牛血清的链霉亲和素磁珠工作液，反应液在37℃温育30min。
第三步，清洗：先将温育样本的微孔板在磁板上静置5min，倒掉微孔板内上清液；然后向该温育样本的微孔板中加入磷酸盐缓冲液混匀清洗；再将该温育样本的微孔板在磁板上静置5min，倒掉清洗用的磷酸盐缓冲液；重复清洗操作3次，每次使用200ul磷酸盐缓冲液清洗。
第四步，酶标二抗温育：向微孔板中加入100ul酶标二抗试剂，混匀，37℃温育30min。
第五步，清洗：微孔板在磁板上静置5min，倒掉微孔板内上清液；加入清洗缓冲液混匀，微孔板在磁板上静置5min，倒掉清洗液；重复以上操作3次，每次使用200ul清洗缓冲液。
第六步，读数：向微孔板内加入150ul化学发光底物，混匀，然后用化学发光免疫分析仪测读样本发光值，测试结果如表2所示。
对比例非特异性(NSB)测试：
第一步，采用常规方法配制磷酸盐缓冲液备用。
第二步，加样温育：向微孔板中分别加入30ul样本(MPO-IgG阴性血清N1、阳性血清P1和P2)、50ul磁珠工作液，37℃温育30min。
第二步，清洗：微孔板在磁板上静置5min，倒掉微孔板内上清液。加入清洗缓冲液混匀，微孔板在磁板上静置5min，倒掉清洗液。重复以上操作3次，每次使用200ul清洗缓冲液。
第三步，酶标二抗温育：向微孔板中加入100ul酶标二抗试剂，混匀，37℃温育30min。
第四步，清洗：微孔板在磁板上静置5min，倒掉微孔板内上清液。加入清洗缓冲液混匀，微孔板在磁板上静置5min，倒掉清洗液。重复以上操作3次，每次使用200ul清洗缓冲液。
第五步，读数：向微孔板内加入150ul化学发光底物，混匀，然后用化学发光免疫分析仪测读样本发光值，测试结果如表2所示。
表2：对比例1、2和3处理方法制备的磁珠工作液检测结果
| 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
| 样本 | 发光值 | 发光值 | 发光值 |
| N1 | 11775 | 12481 | 12428 |
| P1 | 204804 | 188656 | 185644 |
| P2 | 848520 | 790519 | 781901 |
| NSB-N1 | 12475 | 13332 | 13457 |
| NSB-P1 | 13306 | 13218 | 14146 |
| NSB-P2 | 13415 | 13178 | 14301 |
| P1/N1 | 17.39 | 15.12 | 14.94 |
| P2/N1 | 72.06 | 63.34 | 62.91 |
注：表中N1：MPO-IgG抗体阴性血清1；P1：MPO-IgG抗体阳性血清1；P2：MPO-IgG抗体阳性血清2；NSB-N1：血清N1的非特异背景值；NSB-P1：血清P1的非特异背景值；NSB-P2：血清P2的非特异背景值；P1/N1：血清P1与N1检测发光值的比值；P2/N1：血清P2与N1检测发光值的比值。
从表1和表2的数据可知，实施例4中NSB-N1、NSB-P1、NSB-P2发光值均低于实施例5中的结果，说明实施例1、2和3中处理方法具有降低磁珠非特异性吸附的作用；实施例4中P1/N1、P2/N1发光值的比值均大于实施例5中的结果，说明实施例1、2和3中的处理方法具有提高检测灵敏度的作用。由此可见，本发明的降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法效果显著，有效提高了检测试剂的灵敏度。
本实施例中未将进行说明的内容为现有技术，故，不再进行赘述。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：配制磁珠工作液；
第二步：在配制好的磁珠工作液中加入新生牛血清；
第三步：将加入新生牛血清的磁珠工作液在室温下混合均匀，进行反应；
第四步：将完成与新生牛血清反应后的磁珠工作液进行清洗、静置分离，并按照浓度0.3mg/ml重新配制；
第五步：采用上述步骤加入新生牛血清处理后配制的磁珠工作液进行抗髓过氧化物酶免疫球蛋白G抗体检测。
2.根据权利要求1所述的降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法，其特征在于，
所述磁珠工作液为磷酸盐缓冲液配制的浓度0.3mg/ml的链霉亲和素磁珠工作液；
所述新生牛血清为特级新生牛血清；该新生牛血清在磁珠工作液中加入的体积浓度为10±5％；
所述加入新生牛血清的磁珠工作液在室温下混合均匀，进行反应14～18小时；
所述完成与新生牛血清反应后的磁珠工作液采用磷酸盐缓冲液清洗2次，清洗时保持磁珠工作液的浓度为0.3mg/ml，每次清洗时间为5-10min；清洗后静置分离至少2min，然后去除分离出的清洗液；
所述抗髓过氧化物酶免疫球蛋白G抗体检测为自身免疫抗体检测，是采用磁微粒化学发光免疫分析法检测试验。
3.根据权利要求2所述的降低自身免疫抗体检测中磁珠非特异性吸附的处理方法，其特征在于，
所述磷酸盐缓冲液为常用磷酸盐缓冲液0.02M的PBS缓冲液。
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