CN110967493A - 一种维生素b12测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物分子化学发光检测技术领域，具体涉及一种维生素B12测定试剂盒及其制备方法。本发明所提供的一种维生素B12测定试剂盒的制备方法，包括：将磁珠与链霉亲和素反应，制备链霉亲和素包被的磁珠；将检测抗体偶联碱性磷酸酶，制备碱性磷酸酶标记的检测抗体；然后，采用有机磷酸酯类化合物对所述碱性磷酸酶标记的检测抗体进行磷酸化修饰，得到酶标记抗体复合物；将经过活化处理的生物素偶联维生素B12，制备生物素标记的维生素B12。通过上述制备方法制得的维生素B12测定试剂盒的稳定性显著提高。

Description

一种维生素B12测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物分子化学发光检测技术领域，具体涉及一种维生素B12测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
维生素B12(Vitamin B12，VB12)，又称氰钴胺素、钴胺素、外源因子、动物蛋白因子，是唯一含有矿物质的维生素，是维持人体正常代谢和机能不可缺少的一种微量营养素。维生素B12分子量1355，是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成为1个咕啉大环(与卟啉相似)，是维生素B12分子的核心，且含这种环的化合物一般被称为类咕啉。维生素B12为浅红色的针状结晶，易溶于水和乙醇，在pH4.5～5.0的弱酸条件下最稳定，在强酸(pH<2)或碱性溶液中分解，遇热可有一定程度的破坏，但短时间的高温消毒损失小，遇强光或紫外线易被破坏。维生素B12是人体内一碳单位转移的重要辅助因子，故在诸多生化反应中都起到协同作用，是DNA合成过程中重要的辅酶，降低血浆中同型半胱氨酸水平等。若缺乏VB12，将影响人体对叶酸的利用，还可导致周围神经炎和儿童贫血。人VB12缺乏也是巨幼红细胞性贫血症的诱因，同时也与老年痴呆症、抑郁症以及冠心病等有关。
目前体外检测人体中VB12水平的方法主要包括酶联免疫法、化学发光法和液相色谱串联质谱法，化学发光法因其具有较高的灵敏度和特异性，检测快速，近年来深受国内外研究学者的重视，已逐渐成为国际主流的体外检测手段之一。
按检测原理，化学发光法可分为夹心法和竞争法，夹心法以磁性微粒为载体偶联抗体，利用磁珠被磁场吸引，在磁力作用下发生力学移动的特性，迅速捕捉到待测抗原。当加入样本后，样本的待测抗原，与磁珠上的抗体结合，此时再加入碱性磷酸酶(AP)标记检测抗体，形成“磁珠包被抗体-待测抗原-AP标记抗体”复合物，经洗涤去掉未结合的抗体后，加入AP的发光底物液，发光底物被复合物上的AP催化，持续稳定地发射出光子，发射出的光子被***记录，通过软件将光子能量强度在标准曲线上转化为待测抗原的浓度。竞争法则以磁珠为载体包被抗原，当加入样本后，样本的待测抗原与磁珠偶联的抗原竞争性结合AP标记检测抗体，形成“磁珠包被抗原-AP标记抗体”复合物。
按发光原理，化学发光法可分为直接发光和酶促化学发光。酶促化学发光主要分为辣根过氧化物酶发光体系和碱性磷酸酶发光体系两种，辣根过氧化物酶发光体系的化学发光底物容易被氧化自身发光，本底相对较高，信噪比较低，影响因素复杂，结果较不稳定。碱性磷酸酶发光体系的化学发光底物达到平台期的时间长，背景发光低，信噪比高，反应不需要催化，体系简单，干扰因素少，检测成本低，故其能够克服上述缺点。然而，由于碱性磷酸酶在碱性的条件下稳定性较高，其标记的检测抗体在酸性环境下较为稳定，因而碱性磷酸酶标记的检测抗体容易受到所处环境的影响，导致酶标记物较低的稳定性，不但降低了产品有效期，且在使用过程中需频繁定标，增加了成本和未知风险。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种维生素B12测定试剂盒的制备方法，旨在解决现有技术制备得到的维生素B12测定试剂盒中的碱性磷酸酶容易受到环境影响，稳定性低等技术问题。
为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种维生素B12测定试剂盒的制备方法，包括：
将磁珠与链霉亲和素反应，制备链霉亲和素包被的磁珠；
将检测抗体偶联碱性磷酸酶，制备碱性磷酸酶标记的检测抗体；然后，采用有机磷酸酯类化合物对所述碱性磷酸酶标记的检测抗体进行磷酸化修饰，得到酶标记抗体复合物；
将生物素偶联维生素B12，制备生物素标记的维生素B12。
另一方面，本发明还提供了一种维生素B12测定试剂盒，包括：磁分离试剂、抗体试剂和酶标试剂；
所述磁分离试剂包括链霉亲和素包被的磁珠；
所述酶标试剂包括酶标记抗体复合物，所述酶标记抗体复合物为碱性磷酸酶标记的检测抗体经过有机磷酸酯类化合物磷酸化修饰的产物；
所述抗原试剂包括生物素标记的维生素B12和生物素标记物工作液。
与现有技术相比，本发明采用有机磷酸酯类化合物对碱性磷酸酶标记的检测抗体进行磷酸化修饰，有机磷酸酯类化合物与碱性磷酸酶的活性位点连接形成酶标记抗体复合物，降低了碱性磷酸酶的自由能，从而使得酶标记抗体复合物中的标记酶构象更加稳定，即使在溶液环境pH值较小或pH波动范围较大的情况下依然能维持其四维结构，进而大大提高了测定试剂盒的稳定性。经实验检测，通过本发明制备方法制得的维生素B12测定试剂盒的稳定性优异。
附图说明
图1为测试例中本发明VB12测定试剂盒和贝克曼VB12测定试剂盒的相关性拟合曲线。
具体实施方式
为了解决现有技术制备得到的维生素B12测定试剂盒中的碱性磷酸酶容易受到环境影响，稳定性低等技术问题。本发明实施例提供了一种维生素B12测定试剂盒的制备方法，通过该法得到的VB12测定试剂盒的稳定性优异。
本发明的一种维生素B12测定试剂盒的制备方法，包括：
S01、将磁珠与链霉亲和素反应，制备链霉亲和素包被的磁珠；
S02、将检测抗体偶联碱性磷酸酶，制备碱性磷酸酶标记的检测抗体；然后，采用有机磷酸酯类化合物对所述碱性磷酸酶标记的检测抗体进行磷酸化修饰，得到酶标记抗体复合物；
S03、将生物素偶联维生素B12，制备生物素标记的维生素B12。
本发明采用有机磷酸酯类化合物对碱性磷酸酶标记的检测抗体进行磷酸化修饰，有机磷酸酯类化合物与碱性磷酸酶的活性位点连接形成酶标记抗体复合物，降低了标记酶活性位点附近的自由能，从而使得酶标记抗体复合物中的标记酶构象更加稳定，即使在低pH溶液环境或pH波动范围变化较大的情况下依然能维持其四维结构，进而大大提高了测定试剂盒的稳定性。
具体的，上述步骤S01中，磁珠作为超强的顺磁性的固相载体，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散，可以选自但不限于羧基磁珠、氨基磁珠、磺酸基磁珠或羟基磁珠。
磁珠具有丰富的表面活性基团，链霉亲和素通过磁珠的表面活性基团与磁珠偶联，链霉亲和素可高度特异性地与生物素结合，链霉亲和素和生物素之间的亲和力极为强烈，链霉亲和素可作为偶联分子将磁珠与生物素标记的维生素B12连接，并进一步与生化物质结合形成结合物，结合物在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
作为优选的，磁珠与链霉亲和素的质量比为10:(0.2～0.5)。
在本发明实施例中，步骤S01可参考本领域常规技术手段进行。在步骤S01中，磁珠与链霉亲和素反应之前，必须经过活化处理，活化磁珠的表面活性基团。磁珠活化的处理的方法可参考本领域常规技术手段进行，例如，采用如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)等活化剂进行进行活化处理。
作为优选的，本发明实施例在将磁珠和链霉亲和素反应之前，对磁珠采用EDC进行活化处理；其中，磁珠与EDC的质量比优选为10:(0.2～0.5)；磁珠选为羧基磁珠。
目前，应用于化学发光检测的大部分磁珠以金属小颗粒(Fe3O4)为核，核心外包裹一层疏水性高分子材料(如聚苯乙烯、聚氯乙烯)，最外层负载修饰功能基团(如羧基、羟基、氨基、醛基等)，表面疏水，且其具有很多空腔，磁珠与水溶液的结合界面面积小于磁珠的表面积。生物素标记物为水溶性成分，磁珠表面疏水性越高，生物素标记物与磁珠表面接触的反应面积越小，生物素标记物与磁珠之间的结合效率就越弱。
作为一种优选实施方式，为了增加反应体系中的生物素标记物与磁珠表面的反应面积，本发明对磁珠表面进行亲水化修饰。具体的，在制备链霉亲和素包被的磁珠时，在反应体系中加入亲水试剂混合反应，使得链霉亲和素包被的磁珠的表面修饰有亲水基团。
通过对磁珠表面进行亲水化修饰，可使得磁珠与生物素标记物具有良好的反应界面，提高链霉亲和素包被的磁珠与生物素标记物的结合率，提高检测信噪比，进而提高试剂盒的灵敏度，且在长期保存的条件下不易板结，易于混匀。
优选的，亲水试剂为聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物、乙二胺基乙磺酸盐和乙二胺基乙磺酸盐衍生物中的至少一种。聚乙烯亚胺及其衍生物、乙二胺基乙磺酸盐及其衍生物于溶液中溶解度大、化学性质稳定，且带有氨基能与AP酶偶联。
在本发明实施例中，将亲水试剂与链霉亲和素同时加入磁珠混悬液中进行反应，使得链霉素标记磁珠以及磁珠亲水化修饰同时进行，在反应终止得到的磁珠表面部分结合位点连接链霉亲和素，部分结合位点连接亲水基团，部分位点待封闭。
在本发明实施例中，链霉亲和素与亲水试剂的质量比为(0.2～0.5):(0.02～0.1)。当链霉亲和素与亲水试剂的质量比小于0.2:0.1时，链霉亲和素与磁珠的偶联效率较低，影响测定试剂盒的检测效果；当链霉亲和素与亲水试剂的质量比大于0.5:0.02时，链霉亲和素与磁珠的偶联效率不会递增，造成资源浪费。
在本发明实施例中，将磁珠与链霉亲和素反应的反应条件为：在室温下反应1～3h。当反应时间小于1h时，磁珠与链霉亲和素的偶联效率较低，影响测定试剂盒的检测效果；当反应时间大于3h时，时间过长，且磁珠与链霉亲和素的偶联效率不会递增，造成资源浪费。
值得注意的是，本发明实施例的室温指的是25±5℃。本发明实施例磁珠与链霉亲和素在室温下的偶联效果优于4℃和37℃。
上述步骤S02中，检测抗体偶联碱性磷酸酶得到酶标记抗体，在检测过程中，待测样品中的抗原与生物素标记的维生素B12竞争性结合酶标记抗体，形成“磁珠包被抗原-AP标记抗体”复合物。经洗涤去掉未结合的抗体后，加入AP的发光底物液，发光底物被复合物上的AP催化，持续稳定地发射出光子，发射出的光子被***记录，通过软件将光子能量强度在标准曲线上转化为待测抗原的浓度。其中，检测抗体可以选自但不限于内因子蛋白、维生素B12单克隆抗体或维生素B12多克隆抗体。
在本发明实施例中，步骤S02中将检测抗体偶联碱性磷酸酶、制备碱性磷酸酶标记的检测抗体的这一过程可参考本领域常规技术手段进行。具体为：取检测抗体，加入碱性磷酸酶溶液(200～500μL，5.0mg/mL)混匀，室温避光反应2h后，加入含1％BSA的Tris缓冲液(0.1M，pH7.4)室温封闭反应30min，以封闭检测抗体上未结合位点。
在步骤S02中，将检测抗体偶联碱性磷酸酶之前，为了提高酶标记效率，必须经过活化处理，活化检测抗体的活性基团。检测抗体活化的处理的方法可参考本领域常规技术手段进行，例如，采用如EDC、NHS等活化剂进行进行活化处理。
作为优选的，碱性磷酸酶与检测抗体的质量比为5:1～10:1。当碱性磷酸酶与检测抗体的质量比小于5:1时，碱性磷酸酶与检测抗体的偶联效率较低，影响测定试剂盒的检测效果；当碱性磷酸酶与检测抗体的质量比大于10:1时，造成资源浪费。
作为一种优选实施方式，为了提高酶标记抗体的稳定性，本发明实施例采用有机磷酸酯类化合物作为磷酸化修饰原料，其通过化学作用力与碱性磷酸酶活性位点可逆性连接，在不影响碱性磷酸酶标记的检测抗体的催化活性的情况下提高其构象的稳定性，进而提高测定试剂盒的稳定性。
作为优选的，有机磷酸酯类化合物为磷酸二乙酯、磷酸二甲酯、磷酸三乙酯和磷酸二甲酯及其衍生物中的一种或多种。磷酸二乙酯、磷酸二甲酯、磷酸三乙酯和磷酸二甲酯及其衍生物与AP酶能形成可解离的结合物。在结合态时，AP酶的热稳定性得到明显的提高。
在本发明实施例中，碱性磷酸酶与有机磷酸酯类化合物的质量比为100:(3～5)。当碱性磷酸酶与有机磷酸酯类化合物的质量比小于100:5时，碱性磷酸酶标记的检测抗体的磷酸化修饰程度不够，测定试剂盒的热稳定性效果一般；当碱性磷酸酶与有机磷酸酯类化合物的质量比大于100:3时，造成资源浪费。
在本发明实施例中，磷酸化修饰的时间在30min以上。磷酸化修饰的时间低于30min，则会影响碱性磷酸酶标记的检测抗体的磷酸化修饰程度，稳定性较低。
在上述步骤S03中，生物素与链霉亲和素之间的亲和力极为强烈，检测时，生物素标记的维生素B12与链霉亲和素包被的磁珠结合，形成磁珠包被抗原。
在本实施例中，生物素指的是经过活化处理的生物素。本发明实施例活化处理的方法可参考本领域常规技术手段进行，例如，采用如EDC、NHS等活化剂进行进行活化处理。
作为一种优选实施方式，为了克服VB12对光敏感的问题，本发明实施例在生物素标记的维生素B12中加入β-环糊精。β-环糊精具有独特的环状结构，能在一定程度上抑制VB12的光解效应，提高VB12的稳定性，进而提高检测试剂盒的稳定性。
本发明实施例的生物素标记的维生素B12为水溶液，β-环糊精在水中具有良好的溶解度。
作为优选，在生物素标记的维生素B12溶液中，β-环糊精的质量百分含量为1％～5％。当β-环糊精的质量百分含量低于1％时，VB12的光解效应降低程度不明显；当β-环糊精的质量百分含量高于5％时，造成资源浪费。
综上，本发明实施例在对碱性磷酸酶标记的检测抗体进行磷酸化修饰，对链霉亲和素包被的磁珠进行亲水化修饰，以及通过在生物素标记VB12溶液中加入β-环糊精，大大提高了本发明实施例VB12测定试剂盒的稳定性，并从整体上降低了检测信噪比，提高了灵敏度，减小批间差异，提高检测精确度。
本发明实施例还提供了一种维生素B12测定试剂盒，包括：磁分离试剂、抗体试剂和酶标试剂；
磁分离试剂包括链霉亲和素包被的磁珠；
酶标试剂包括酶标记抗体复合物，酶标记抗体复合物为碱性磷酸酶标记的检测抗体经过有机磷酸酯类化合物磷酸化修饰的产物；
抗原试剂包括生物素标记的VB12和生物素标记物工作液。
作为一种优选实施方式，链霉亲和素包被的磁珠表面还修饰有亲水基团，亲水基团为聚乙烯亚胺基或乙二胺基乙磺酸基。
作为一种优选实施方式，生物素标记物工作液中还含β-环糊精。
进一步的，每升生物素标记物工作液包括：Tris 0.03～0.06mol；β-环糊精8～12g；BSA 8～12g；吐温-20 0.8～1.2g；NaCl 7～11g；Proclin300 0.3～0.7g。
更进一步的，在抗原试剂中，生物素标记的VB12的工作浓度优选为50ng/mL～500ng/ml。当生物素标记的VB12的工作浓度小于50ng/mL时，测定试剂盒的RLU值过低，线性关系差；当生物素标记的VB12的工作浓度大于500ng/mL时，测定试剂盒的灵敏度较低。
在本发明VB12测定试剂盒中，磁分离试剂还包括磁珠工作液，在磁分离试剂中，磁珠的工作浓度优选为0.1～0.5mg/mL。当磁珠的工作浓度小于0.1mg/mL时，测定试剂盒的RLU值过低，线性关系差；当磁珠的工作浓度大于0.5mg/mL时，测定试剂盒的灵敏度较低。
进一步的，每升磁珠工作液包括：Tris 0.03～0.06mol；明胶8～12g；BSA8～12g；吐温-20 0.8～1.2g；NaCl 7～11g；Proclin300 0.3～0.7g。
在本发明VB12测定试剂盒中，酶标试剂还包括酶标记物工作液，在酶标试剂中，碱性磷酸酶标记的检测抗体的工作浓度优选为1～10ug/mL。当碱性磷酸酶标记的检测抗体的工作浓度小于1ug/mL时，测定试剂盒的RLU值过低，线性关系差；当碱性磷酸酶标记的检测抗体的工作浓度高于10ug/mL时，测定试剂盒的灵敏度较低。
进一步的，每升酶标记物工作液包括：MES 0.03～0.06mol；BSA 8～12g；吐温-200.8～1.2g；NaCl 7～11g；MgCl2 0.8～1.2mmol；ZnCl2 3～7mmol；Proclin3000.3～0.7g。
在本发明VB测定试剂盒中，有机磷酸酯类化合物为磷酸二乙酯、磷酸二甲酯、磷酸三乙酯和磷酸二甲酯及其衍生物中的一种或多种；
碱性磷酸酶标记的检测抗体中，检测抗体为内因子蛋白、维生素B12单克隆抗体或维生素B12多克隆抗体；
磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、磺酸基磁珠或羟基磁珠。
采用本发明实施例试剂盒进行测定待测样品中的VB12时，将生物素标记的维生素B12连接链霉亲和素包被的磁珠，加入待测样本、酶标记抗体复合物，混匀，孵育，得到复合物；将复合物进行化学发光反应，并采用发光检测仪进行检测其发光强度，计算待测样本中降钙素原的含量。
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供了一种维生素B12测定试剂盒，其制备包括以下步骤：
1、亲和素包被磁珠
取10mg羧基磁珠(粒径为2.80μm)，加入MES(0.02mol/L，pH6.0)缓冲液2mL重悬，加入20μL新配置的10mg/mL EDC水溶液，活化磁珠表面羧基30min；然后，加入0.5mg链霉亲和素(SA)与0.1mg的乙二胺基乙磺酸钠(AAS)，室温混悬3h，磁分离，去上清；接着，继续加入含1％BSA的Tris缓冲液(0.1M、pH7.4)室温继续反应3h，磁分离，去上清，得到链霉亲和素包被的磁珠。
使用时，将链霉亲和素包被的磁珠加入磁珠工作液中，混匀，并调节磁珠的工作浓度为0.2mg/mL，即得磁分离试剂R1。
其中，磁珠工作液的配方为：Tris(0.05mol/L，pH7.4)100mL；明胶1g；BSA 1g；吐温-20 0.1g；NaCl 0.9g；Proclin300 0.05g。
2、碱性磷酸酶标记检测抗体
取内因子蛋白作为检测抗体，将内因子蛋白(100μL，1.0mg/mL)和PBS缓冲液(250μL，0.1mol/L，pH 7.0)混匀，加入新配置的EDC水溶液(20μL，10mg/mL)，活化30min；然后，加入碱性磷酸酶溶液(200μL，5.0mg/mL)混匀，室温避光反应2h；接着，加入含1％BSA的Tris缓冲液(250μL,0.1M，pH7.4)室温封闭反应30min；接着，加入质量百分比浓度为0.5％的磷酸二乙脂250μL于室温下继续反应30min；最后，采用30KD超滤柱进行离心纯化，加入一半体积甘油并于-20℃下保存。
使用时，将碱性磷酸酶标记的检测抗体加入酶标记物工作液中，保持AP酶的工作液浓度在5ug/ml，即得酶标试剂R2。
其中，酶标记物工作液配方为：MES(0.05mol/L、pH6.5)100mL；BSA 1g；吐温-200.1g；NaCl 0.9g；MgCl2(1mmol/L)；ZnCl2(5mmol/L)；Proclin300 0.05g。
3、生物素标记VB12
取生物素(100μL，5.0mg/mL)，活化，加入PBS缓冲液(200μL，0.1mol/L、pH8.5)，混匀，加入新配置的VB12水溶液(10μL，5.0mg/mL)，室温避光反应2h；然后，采用脱盐柱进行离心纯化，收集第一峰的液体，加入一半甘油，于-20℃保存备用。
使用时，将生物素标记的VB12加入生物素标记物工作液中，保持VB12的工作浓度为100ng/mL，即得抗原试剂R3。
其中，生物素标记物工作液配方为：Tris(0.05mol/L、pH7.4)100mL；β-环糊精1g；BSA 1g；吐温-20 0.1g；NaCl 0.9g；Proclin300 0.05g。
4、维生素B12定标品的制备
用校准品缓冲液将VB12分别配置成浓度为0pg/mL、75pg/mL、150pg/mL、300pg/mL、750pg/mL和1500pg/mL的VB12溶液，0.5mL/瓶分装，4℃保存备用。
其中，校准品缓冲液的配方为：Tris(0.05mol/L、pH7.4)100mL；β-环糊精1g；BSA1g；吐温-20 0.1g；NaCl 0.9g；Proclin300 0.05g。
5、样品处理液的制备
样本处理液的配方为：MES(50mmol/L)100mL；二硫苏糖醇(DTT，10mmol/L)；KCN0.1g；Proclin300 0.05g；pH5.5。
使用时，将待测样本与样品处理液混合，然后添加磁分离试剂R1和抗原试剂R3，混合，再加入酶标试剂R2。
对比例1
本对比例提供了一种维生素B12测定试剂盒，其制备包括以下步骤：
1、亲和素包被磁珠
取10mg羧基磁珠(粒径为2.80μm)，加入0.02M、pH6.0的MES缓冲液重悬，加入20μL新配置的10mg/mL EDC水溶液，活化磁珠表面羧基30min；然后，加入0.5mg链霉亲和素(SA)，室温混悬3h，磁分离，去上清；接着，继续加入含1％BSA的Tris缓冲液(0.1M、pH 7.4)室温继续反应3h，磁分离，去上清，得到链霉亲和素包被的磁珠。
使用时，将链霉亲和素包被的磁珠加入磁珠工作液中，混匀，并调节磁珠的工作浓度为0.2mg/mL，即得磁分离试剂r1。
其中，磁珠工作液的配方为：Tris(0.05mol/L，pH7.4)100mL；明胶1mg；BSA 1mg；吐温-20 0.1mg；NaCl 0.9mg；Proclin300 0.05mg。
2、碱性磷酸酶标记检测抗体
取内因子蛋白作为检测抗体，将内因子蛋白(100μL，1.0mg/mL)和PBS缓冲液(250μL，0.1mol/L，pH 7.0)混匀，加入新配置的EDC水溶液(20μL，10mg/mL)，活化30min；然后，加入碱性磷酸酶溶液(200μL，5.0mg/mL)混匀，室温避光反应2h；接着，加入含1％BSA的Tris缓冲液(0.1M，pH7.4)室温封闭反应30min；最后，采用30KD超滤柱进行离心纯化，加入一半体积甘油并于-20℃下保存。
使用时，将碱性磷酸酶标记的检测抗体加入酶标记物工作液中，按稀释比1:800进行稀释，即得酶标试剂r2。
其中，酶标记物工作液配方为：MES(0.05mol/L、pH6.5)100mL；BSA 1g；吐温-200.1g；NaCl 0.9g；MgCl2(1mmol/L)；ZnCl2(5mmol/L)；Proclin300(0.05g)。
3、生物素标记VB12
取生物素(100μL，5.0mg/mL)，活化，加入PBS缓冲液(200μL，0.1mol/L、pH8.5)，混匀，加入新配置的VB12水溶液(10μL，5.0mg/mL)，室温避光反应2h；然后，采用脱盐柱进行离心纯化，收集第一峰的液体，加入一半甘油，于-20℃保存备用。
使用时，将生物素标记的VB12加入生物素标记物工作液中，按VB12工作浓度100ng/ml添加，即得抗原试剂r3。
其中，生物素标记物工作液配方为：Tris(0.05mol/L、pH7.4)；BSA 1g；吐温-200.1g；NaCl 0.9g；Proclin300 0.05g。
其余地方与实施例1基本相同，此处不再一一赘述。
实施例2
本对比例与对比例1的区别在于：在步骤1亲和素包被磁珠的过程中，在加入0.5mg链霉亲和素的同时加入0.1mg AAS。
其余地方与对比例1基本相同，此处不再一一赘述。
实施例3
本对比例与对比例1的区别在于：在步骤2碱性磷酸酶标记检测抗体的过程中，在封闭反应和离心纯化之间还加入0.5％磷酸二乙脂，并于室温下继续反应30min。
其余地方与对比例1基本相同，此处不再一一赘述。
实施例4
本对比例与对比例1的区别在于：在步骤3生物素标记VB12的过程中，生物素标记工作液中还含有1％的β-环糊精。
其余地方与对比例1基本相同，此处不再一一赘述。
测试例
1、取对比例1和实施例2的维生素B12测定试剂盒，采用化学发光法进行检测，表1为检测结果。如检测结果所示，本申请采用AAS对磁珠的表面进行亲水性修饰，可显著提高检测信号值的信噪比，进而使得本发明实施例VB12测定试剂盒的灵敏度更高。
表1
Figure BDA0001816798630000111
2、取对比例1和实施例3的维生素B12测定试剂盒，采用化学发光法进行检测，测定温度为2～8℃，记录低温检测值。然后，将对比例1和实施例3的VB12测定试剂盒置于37℃下加速7天后测试，记录高温处理后的检测值，并计算高温加速后的检测值相对于原始检测值的偏差，表2为检测结果。
如结果所示，本发明实施例的VB12测定试剂盒通过对酶标记检测抗体采用有机磷酸酯类化合物进行修饰后，其稳定性显著提高。
表2
Figure BDA0001816798630000121
3、取对比例1和实施例4的维生素B12测定试剂盒，在黑暗环境中采用化学发光法进行检测，记录避光条件下的检测值。然后，将对比例1和实施例4的维生素B12测定试剂盒置于LED灯下直射24h后，采用化学发光法检测，记录光照处理后的检测值，并计算光照处理后的检测值相对于避光条件下的检测值的偏差，表3为检测结果。
如检测结果所示，本发明实施例通过在生物素标记工作液添加β-环糊精能降低检测试剂盒的光解效应，提高本发明实施例VB12测定试剂盒在光照下的稳定性。
表3
Figure BDA0001816798630000122
4、取实施例1的维生素B12测定试剂盒，采用化学发光法检测其灵敏度、精密度、稳定性和临床样本符合性测试。
1)灵敏度检测
参照CLSI EP17-A文件推荐的实验方案，测得本发明实施例VB12测定试剂盒的灵敏度为20pg/mL。
2)精密度检测
取浓度分别为100pg/mL和1000pg/mL的两个VB12样品，采用不同时间制备得到的3个批次的VB12测定试剂盒，每次检测三次重复，取均值，然后计算本发明实施例VB12测定试剂盒的批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于8％。
3)稳定性检测
将本发明实施例VB12测定试剂盒采用全自动化学发光仪进行质控测试，每天一次，连续检测40次，质控结果全部再符合范围内，在机稳定性提高到40天，说明本发明实施例的VB12测定试剂盒的贮存稳定性优异。
将本发明实施例的VB12测定试剂盒置于37℃下加速7天后测试，数值下降在5％以内，热稳定非常好，能够避免运输、使用过程中一些意外因素对试剂性能的影响。
4)临床样本符合性测试
取本市一医疗机构提供的200例样本，采用本发明VB12测定试剂盒以及贝克曼VB12测定试剂盒进行测试，图1为本发明VB12测定试剂盒和贝克曼VB12测定试剂盒的相关性拟合曲线，其相关性为：0.9867，K值为0.9734，相关性非常好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种维生素B12测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
将磁珠与链霉亲和素反应，制备链霉亲和素包被的磁珠；
将检测抗体偶联碱性磷酸酶，制备碱性磷酸酶标记的检测抗体；然后，采用有机磷酸酯类化合物对所述碱性磷酸酶标记的检测抗体进行磷酸化修饰，得到酶标记抗体复合物；
将生物素偶联维生素B12，制备生物素标记的维生素B12。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶与所述有机磷酸酯类化合物的质量比为100:(3～5)。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸化修饰的时间在30min以上；和/或
所述有机磷酸酯类化合物为磷酸二乙酯、磷酸二甲酯、磷酸三乙酯和磷酸二甲酯及其衍生物中的一种或多种；和/或
所述检测抗体为内因子蛋白、维生素B12单克隆抗体或维生素B12多克隆抗体。
4.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，在制备链霉亲和素包被的磁珠时，在反应体系中加入亲水试剂混合反应，使得所述链霉亲和素包被的磁珠的表面修饰有亲水基团；
所述亲水试剂为聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物、乙二胺基乙磺酸盐和乙二胺基乙磺酸盐衍生物中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述链霉亲和素与所述亲水试剂的质量比为(0.2～0.5):(0.02～0.1)；和/或
所述磁珠为羧基磁珠、氨基磁珠、磺酸基磁珠或羟基磁珠；和/或
将磁珠与链霉亲和素反应的反应条件为：在室温下反应1～3h。
6.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述生物素标记的维生素B12中加入β-环糊精。
7.一种维生素B12测定试剂盒，其特征在于，包括：磁分离试剂、抗体试剂和酶标试剂；
所述磁分离试剂包括链霉亲和素包被的磁珠；
所述酶标试剂包括酶标记抗体复合物，所述酶标记抗体复合物为碱性磷酸酶标记的检测抗体经过有机磷酸酯类化合物磷酸化修饰的产物；
所述抗原试剂包括生物素标记的维生素B12和生物素标记物工作液。
8.根据权利要求7所述的维生素B12测定试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁珠表面修饰有亲水基团，所述亲水基团为聚乙烯亚胺基或乙二胺基乙磺酸基；和/或
所述生物素标记物工作液中含β-环糊精。
9.根据权利要求8所述的维生素B12测定试剂盒，其特征在于，每升所述生物素标记物工作液包括：Tris 0.03～0.06mol；β-环糊精8～12g；BSA 8～12g；吐温-20 0.8～1.2g；NaCl 7～11g；Proclin300 0.3～0.7g。
10.一种维生素B12的检测方法，其特征在于，包括：
提供权利要求7至9任一项所述的维生素B12测定试剂盒，将生物素标记的维生素B12连接链霉亲和素包被的磁珠，加入待测样本、酶标记抗体复合物，混匀，孵育，得到复合物；
将所述复合物进行化学发光反应，并采用发光检测仪进行检测其发光强度，计算待测样本中VB12的含量。
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