CN103033624A

CN103033624A - 一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒

Info

Publication number: CN103033624A
Application number: CN2012105432515A
Authority: CN
Inventors: 单存海; 潘学继; 王立凯; 曹青; 洪宇霞
Original assignee: TIANJIN XIEHE MEDICAL TECHNOLOGY GROUP Co Ltd
Current assignee: TIANJIN XIEHE MEDICAL TECHNOLOGY GROUP Co Ltd
Priority date: 2012-12-16
Filing date: 2012-12-16
Publication date: 2013-04-10

Abstract

本发明公开了一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒，包括以下组份：1）人髓过氧化物酶标准品；2）包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体；3）酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体；4）上述酶所作用的化学发光底物；5）浓缩洗涤液，本发明的试剂盒可以对病人血清样本中的人髓过氧化物酶（MPO）分子进行非常专一的定量检测。它既有效地利用了化学发光技术原理，又在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，提高了检测的灵敏度，同时也具有稳定性高、特异性好、准确性佳、操作简单及无放射性污染的优点，可为动脉粥样硬化（AS）、急性冠脉综合征（ACS）、冠心病（CAD）等心血管疾病的临床诊断提供更为特异、快速、可靠依据。

Description

一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。

背景技术

心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）是一类严重危害人类生命和身体健康的高风险疾病。目前，已成为我国城市和农村人口的第一大死因，也是造成死亡率最高的非传染性疾病。WHO指出对CVD疾病的早期诊断和预防可有效降低临床突发事件和过早死亡的发生。

近年来，多种心血管疾病标志物相继问世，由于大多数能够反映心肌坏死损伤的指标多在心肌发生实质性损伤之后才被检测到，在发病早期很难提供科学的预防依据。髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）是一种大量存在于嗜中性多核白细胞（粒细胞）的血红素蛋白，其表达和活性增加促进动脉粥样硬化形成，可以诱发心血管功能障碍，进而对心肌造成损伤。人体MPO的表达和释放常在心肌损伤之前，并与其他心肌类标志物无明显相关性，因此对患者心血管疾病的早期诊断和疗效观察具有更加重要的医学价值。MPO被认为是目前最有前景的心脏标记物之一。已被证实患者血清中MPO浓度的升高可作为动脉粥样硬化和冠心病的风险指标，并预示着心肌梗死的早期风险。

近年来，用于临床诊断领域的免疫分析方法主要有：放射免疫法、酶联免疫法、胶体金免疫法、荧光免疫法及化学发光免疫法等。放射免疫法检测灵敏度相对不高，又存在一定的放射性污染，已经逐渐被替代；酶联免疫法虽无放射性污染，但受影响因素多，很容易造成结果失真，准确性较差；胶体金法检测速度快，但是稳定性和可靠性不理想；荧光法也存在着稳定性差的缺点。

化学发光免疫分析技术是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项新的免疫测定技术。它将化学发光分析的高灵敏度与抗原抗体反应的高特异性相结合，与目前常用的其他免疫分析法相比具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、测量线性范围宽、稳定性好，可实现自动化、使用简便、安全、无放射性污染等诸多优点，因此倍受人们的青睐，该技术已广泛应用于传染性疾病、肥胖及相关疾病、内分泌***、遗传病、肿瘤的早期诊断、动植物检验检疫等众多领域。

目前，化学发光免疫分析技术在人MPO免疫分析产品的应用方面仍是空白。本发明所述试剂盒可供开放式化学发光分析仪使用，方法简便快捷，成本低廉，易于在临床诊断和科研工作中推广使用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒，包括以下组份：

1）人髓过氧化物酶标准品；

2）包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体；

3）酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体；

4）上述酶所作用的化学发光底物；

5）浓缩洗涤液，

其中，所述包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体经过以下步骤制备：

1）采用pH值为9.6的50mM碳酸盐缓冲液为溶剂与人髓过氧化物酶单克隆抗体混合，配成浓度为5μg/mL的混合液，负载于载体上；

2）用pH值为7.3-7.5的PBS或用pH值为7.3-7.5的PBST清洗载体；

3）将pH值为7.2-7.5的封闭液负载于清洗后的载体上；所述封闭液用下述方法制成：取8gNaCl、1.43g无水Na₂HPO₄、0.24g无水KH₂PO₄、0.2g KCl、10g BSA、25g蔗糖及0.5mL Proclin300，加水1000mL；

4）将封闭液倒掉，干燥，得到包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体。

人髓过氧化物酶标准品是用下述方法制成：将0.02mol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液与胎牛血清按体积比4:1的比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将人髓过氧化物酶稀释成浓度为0、25、64、160、400、1000ng/mL。

所述载体为微孔板、磁性颗粒、塑料管或塑料珠。

步骤3）用于标记的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺，（金刚烷）-1，2-二氧乙烷、3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3’-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

所述浓缩洗涤液是用下述方法制成：取24g三羟甲基氨基甲烷、160g NaCl、0.5mLTween-20，0.5mL Proclin300加水至1000mL，调节pH值为7.2-7.5。

本发明的试剂盒采用的是“双抗体夹心一步法”的反应模式，可以对病人血清样本中的人髓过氧化物酶（MPO）分子进行非常专一的定量检测。它既有效地利用了化学发光技术原理，又在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，提高了检测的灵敏度，同时也具有稳定性高、特异性好、准确性佳、操作简单及无放射性污染的优点，可为动脉粥样硬化（AS）、急性冠脉综合征（ACS）、冠心病（CAD）等心血管疾病的临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

附图说明

图1为实施例1所制备的试剂盒中标准品线性图。

图2说明了本发明的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒临界值的确定。

图3显示了本发明的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒和德国IBL公司MPO酶联免疫测定试剂盒检测103例心血管病人相关性的结果。

其中，IBL试剂盒测定的值为X轴，本发明的试剂盒的测定值为Y轴，结果经统计学处理得相关系数r＝0.9866，y＝0.9775x+11.633。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

1）人髓过氧化物酶标准品；

2）包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板；

3）碱性磷酸酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体；

4）上述酶所作用的化学发光底物AMPPD；

5）浓缩洗涤液；

6）半成品及成品组成；

其中：

1．人髓过氧化物酶标准品用下述方法制成：将0.02mol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液与胎牛血清按体积比4:1的比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将人髓过氧化物酶分别稀释成浓度为0、25、64、160、400、1000ng/mL。

2．包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板的制备步骤为：

1）采用pH值为9.6的50mM碳酸盐缓冲液为溶剂与人髓过氧化物酶单克隆抗体混合，配成浓度为5μg/mL的混合液，加入微孔板各孔中，每孔120μL，4℃放置24h；

2）用pH值为7.4的PBS清洗微孔板，清洗3次，每孔每次用300μL；

3）将pH值为7.3的300μL封闭液加入每个清洗后的微孔板中，4℃放置过夜，甩掉封闭液，在吸水纸上拍干，室温除湿干燥24h后立即真空封装，保存于4℃；

所述封闭液是用下述方法制成：取8g NaCl、1.43g无水Na₂HPO₄、0.24g无水KH₂PO₄、0.2gKCl、10g BSA、25g蔗糖及0.5mL Proclin300，加去离子水至1000mL；

3．碱性磷酸酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体

人髓过氧化物酶的单克隆抗体用戊二醛交联法与碱性磷酸酶偶联，用pH值为7.3的PBS缓冲液充分透析，在透析后的结合物溶液中加入等体积的甘油，用20％牛血清酶稀释液进行稀释至酶标抗体的浓度为1:10000，-20℃以下保存；

所述20％牛血清酶稀释液的配方为：

4．上述酶所作用的化学发光底物3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3’-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）

所述AMPPD化学发光底物的配方为：

5．浓缩洗涤液

所述浓缩洗涤液的配方为：

溶解后混合均匀，调整pH至7.3。

6．半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。随机抽取三份进行特异性、精密度、灵敏度及稳定性检验，合格后组装为人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。

实验证明：用塑料管替代实施例1步骤2的微孔板，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。

用磁性颗粒或塑料珠替代实施例1步骤2中的微孔板，并在所述试剂盒中放入空白微孔板或塑料管，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；

实验证明：用pH值为7.3或7.5的PBS，或7.3、7.4或7.5的PBST替代实施例1步骤2的pH值为7.4的PBS，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；

实验证明：用pH值为7.2、7.4或7.5的封闭液替代实施例1步骤2的pH值为7.3的封闭液，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；

实验证明：用（金刚烷）-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star替代实施例1步骤4的3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3’-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；

实验证明：用pH值为7.2、7.4或7.5的浓缩洗涤液替代实施例1步骤5的pH值为7.3的浓缩洗涤液，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。

实施例2

1.人髓过氧化物酶标准品（同实施例1）

2.包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的微孔板（同实施例1）

3.辣根过氧化物酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体

溶解4mg辣根过氧化物酶（HRP）于1mL去离子水中，加入0.4mL浓度为50mM的过碘酸钠水溶液，室温摇动30min，经1mM醋酸钠缓冲液（pH值为4.4）透析过夜，加入6mg MPO的单克隆抗体，2-8℃震荡过夜，用400μL浓度为200mM的NaBH4进行还原，后经pH值为7.4的0.02M PBS透析过夜，用HPLC二次纯化，收集蛋白峰并加入等体积甘油，于-20℃条件下保存。

4.上述酶所作用的化学发光底物鲁米诺

所述鲁米诺化学发光底物的配方为：

1）化学发光底物A液：

溶解后混合均匀，调整pH至8.0。

2）化学发光底物B液：

溶解后混合均匀，调整pH至7.6。

5．浓缩洗涤液（同实施例1）

6．半成品及成品组成（同实施例1）

实验证明：用塑料管替代实施例2步骤2中的微孔板，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。

用磁性颗粒或塑料珠替代实施例2步骤2中的微孔板，要在所述试剂盒中放入空白微孔板或塑料管，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；

实验证明：用pH值为7.3或7.5的PBS，或7.3、7.4或7.5的PBST替代实施例2步骤2的pH值为7.4的PBS，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；

实验证明：用pH值为7.2、7.4或7.5的封闭液替代实施例2步骤2的pH值为7.3的封闭液，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；

实验证明：用异鲁米诺替代实施例2步骤4的鲁米诺，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒；

实验证明：用pH值为7.2、7.4或7.5的浓缩洗涤液替代实施例2步骤5的pH值为7.3的浓缩洗涤液，其它同实施例1，可以制备出相应的人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒。

实施例3本发明的试剂盒的使用方法

以实施例1制备的人MPO化学发光免疫检测试剂盒的使用，具体操作如下：

1）自4℃冰箱中取出本发明的试剂盒，平衡至室温；

2）取一块实施例1步骤2制备的微孔板进行编号，所有实验均做双孔重复；

3）在所述微孔板的孔中分别加入浓度为0、25、64、160、400、1000ng/mL的校准品和待测样本各25μL，每次实验设空白一孔，随后除空白孔外每孔各加入实施例1步骤3制备的酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体100μL；

4）振荡器上振荡30s混匀；

5）用封口膜封板，于37℃孵育45分钟；

6）甩去反应液，自动洗板机或手工洗板5次，每次加入稀释好的洗涤液300μL，在吸水纸上拍干；

所述浓缩洗涤液的稀释方法为：使用时与去离子水按1：19体积比进行稀释。

7）每孔各加100μL实施例1步骤4制备的化学发光底物液，在振荡器上充分振荡混匀，室温（20-27℃）避光反应20分钟；

8）在化学发光测量仪上依次测量各孔的发光强度（RLU），测量时间为1秒/孔；

9）以标准品浓度值为横坐标，RLU值为纵坐标绘制标准曲线（参见附图1）。以各待测样本的RLU值在建立的双对数曲线上查出该样本的MPO浓度。

实施例4本发明的试剂盒的方法学鉴定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果见表1：

表1

检验项目	检验标准	检验结果
			灵敏度	≤1.63ng/mL	符合标准
精密度CV(％)	批内＜10％，批间＜15％	符合标准
			准确性	平均回收率101.83％±1.32％	符合标准
特异性	与类似物的交叉反应率≤0.01％	符合标准
			稳定性	各试剂组分置于37℃至少3天，仍保持稳定	符合标准

说明本发明的人MPO化学发光免疫检测试剂盒相关技术指标符合国家体外诊断试剂规范。

实施例5正常人血清样本中的MPO含量及临界值的确定

从国内某医院收集200例健康人血清，随机平均分成两组，分别用实施例1、2中制备的“人MPO化学发光免疫检测试剂盒”测定，结果如下：

200例健康人血清，求得出健康人测定值的平均值为193.6ng/mL，标准偏差为59.7ng/mL，计算出的平均值加上2倍的标准偏差所对应的浓度值作为临界值，其结果为313.0ng/mL（参见附图2）。

实施例6本发明的人MPO化学发光免疫检测试剂盒的临床应用与IBL试剂盒比较

使用本发明实施例1中制备的试剂盒和IBL试剂盒同时检测心血管病人103份，比较两种试剂盒之间的相关性。

一、临床血清标本的来源

从国内部分医院收集临床心血管病人血清标本103份，其中动脉粥样硬化患者42例，急性冠脉综合征患者38例，冠心病患者23例。正常人血清标本300份。

二、用本发明实施例1的试剂盒(按实施例5操作)和IBL试剂盒(按其说明书操作)分别对103份血清标本进行检测，结果经统计学分析处理，表明两种方法检测的结果高度相关，如附图3所示。

三、结果

使用“人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒”和IBL试剂盒检测相同血清标本的对比数据表明，两种方法高度相关，相关系数r＞0.98，P值小于0.01。说明两种方法具有同等的使用价值。但本发明的方法制备的一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒操作简便快捷，成本低廉，更易于在临床诊断和科研工作中推广使用。

本发明的试剂盒的稳定性通过37℃老化实验和2-8℃低温冷藏储存实验确定，结果显示，2-8℃可有效放置6个月，37℃可有效放置3天，试剂盒各项指标均符合稳定性要求。

Claims

1.一种人髓过氧化物酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征包括以下组份：

1）人髓过氧化物酶标准品；

2）包被有人髓过氧化物酶单克隆抗体的载体；

3）酶标记的人髓过氧化物酶的单克隆抗体；

4）上述酶所作用的化学发光底物；

5）浓缩洗涤液，

2）用pH值为7.3-7.5的PBS或用pH值为7.3-7.5的PBST清洗载体；

3）将pH值为7.2-7.5的封闭液负载于清洗后的载体上；所述封闭液用下述方法制成：取8gNaCl、1.43g无水Na₂HPO₄、0.24g无水KH₂PO₄、0.2g KCl、10g BSA、25g蔗糖及0.5mL Proclin300，加水至1000mL；

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于人髓过氧化物酶标准品是用下述方法制成：将0.02mol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液与胎牛血清按体积比4:1的比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将人髓过氧化物酶稀释成浓度为0、25、64、160、400、1000ng/mL。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述载体为微孔板、磁性颗粒、塑料管或塑料珠。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于步骤3）用于标记的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺，（金刚烷）-1，2-二氧乙烷、3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3’-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液是用下述方法制成：取24g三羟甲基氨基甲烷、160g NaCl、0.5mL Tween-20，0.5mL Proclin300加水至1000mL，调节pH值为7.2-7.5。