CN116381222A - 一种血清素发光免疫检测方法及血清素检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种血清素发光免疫检测方法及血清素检测试剂盒。本发明提供一种血清素快速定量检测方法，本发明采用的竞争法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的血清素含量，本发明有效消除了免疫反应中的钩状效应，无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用，为临床检测样本中的血清素提供了一种更准确、方便和快捷的方法。

Description

一种血清素发光免疫检测方法及血清素检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种血清素发光免疫检测方法及血清素检测试剂盒。
背景技术
血清素又称5-羟色胺(5-HT)，在人体内合成路径是人体必需的氨基酸之一的色氨酸经过羟基化得到，这个过程主要在小肠上皮和大脑神经元细胞内完成，是一种重要的神经递质。
血清素由肠嗜铬细胞分泌并储存，经由活化后分泌入血，在血液中大部分被血小板吸附储存，在人的肠道中存在大量的五羟色胺的受体，文献报道，肠易激综合征患者胃肠功能紊乱和肠道高敏感性均与血清素关系密切，一方面血清素水平增加使内脏神经和传导神经的敏感性增加，另一方面可激活多种神经活性物质参与到此过程中。血清素神经元是痛觉反应体系的重要组成成分，在痛阈调节及中枢镇痛方面发挥重要作用，血清素分泌异常与多种肠道疾病相关。在中枢***血清素的作用更加重要，其在中枢神经***功能的异常可能与厌食、紧张、精神***、癫痫、***等有关，在帕金森病、阿尔兹海默症病发现有血清素神经元的退化。脑中血清素增多可造成情感障碍，血清素水平低下者有***念头。未经治疗的精神***症患者血清素水平增高，经精神抑制药治疗后降低。
目前已知的血清素检测方法主要有放射免疫测定法(radioimmunoassay，RIA)、高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱和质谱联用法(GC-MS)。但是，这些方法都存在一定的缺陷，RIA法污染大、ELISA法自动化程度低且操作复杂繁琐，高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱和质谱联用法不适合广泛用于临床检测。
因此，目前尚需一种污染小、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、特异性好、成本低的血清素快速定量检测方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明第一方面提供一种血清素发光免疫检测试剂盒。根据本发明的实施方案，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、血清素解离剂、发光底物液；
其中，所述试剂A包括血清素偶联载体蛋白磁微粒缓冲溶液；
所述试剂B包括标记物标记的血清素抗体溶液；
所述标记物包括生物酶、荧光素、化学发光标记物中的任意一种；
所述发光底物液包括能催化试剂B发光的底物缓冲溶液。
本发明提供的血清素含量的磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的血清素含量，确保了检测的灵敏度，由于利用该试剂盒采用竞争法不存在HOOK效应，无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明提供的试剂盒为临床检测人血清中的血清素提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
根据本发明的实施方案，所述载体蛋白包括选自钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、BSA中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述血清素偶联载体蛋白磁微粒的粒径不大于10μm。
根据本发明的实施方案，所述血清素偶联载体蛋白磁微粒的粒径为0.5-10μm。
根据本发明的实施方案，所述标记物为生物酶，所述生物酶包括辣根过氧化物美、碱性磷酸酶中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、异鲁米诺及其衍生物中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述血清素解离剂包括选自Triton x-100、十二烷基硫酸钠、NP-40中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述血清素解离剂为Triton x-100。
根据本发明的实施方案，所述试剂盒中含有的缓冲溶液包括选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述试剂盒进一步包括校准品和/或质控品，
其中，所述校准品包含不同浓度梯度的血清素偶联载体蛋白；
所述质控品包括确定浓度的血清素缓冲溶液。
本发明第二方面提供第一方面所述的血清素发光免疫检测试剂盒在血清素检测中的用途。
本发明第三方面提供一种血清素发光免疫检测方法。根据本发明的实施方案，所述检测方法包括利用第一方面所述的血清素发光免疫检测试剂盒对待测样品进行血清素检测。
本发明第四方面提供一种血清素发光免疫检测方法。根据本发明的实施方案，所述检测方法包括：
(A)将血清素与载体蛋白偶联后，包被在磁性微粒表面，制备血清素偶联载体蛋白磁微粒缓冲溶液；
(B)制备标记物标记的血清素抗体溶液；
(C)将待测样品、所述血清素解离剂、血清素偶联载体蛋白磁微粒缓冲溶液、血清素抗体溶液混合，进行免疫反应，形成免疫复合物；
(D)将所述免疫复合物与未结合的其他物质进行磁分离，收集磁性微粒沉淀；
(E)向所述磁性微粒沉淀中加入发光底物液，检测发光强度，以便获取所述待测样品中的血清素含量。
本发明采用的竞争法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的血清素含量，确保了检测的灵敏度，由于实验采用竞争法不存在HOOK效应，无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明为临床检测人血清中的血清素提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
根据本发明的实施方案，所述检测方法进一步包括：
利用校准品绘制血清素浓度-发光值标准曲线，其中，所述校准品包含不同浓度梯度的血清素偶联载体蛋白。
根据本发明的实施方案，所述检测方法进一步包括：
(1)以校准品为待测样品，实施步骤(A)-(E)，测定不同浓度对应的发光强度，其中，所述校准品包含不同浓度梯度的血清素偶联载体蛋白；
(2)根据所述发光强度绘制血清素浓度-发光值标准曲线；
(3)根据所述血清素浓度-发光值标准曲线，获取未知待测样品中的血清素含量。
根据本发明的实施方案，所述载体蛋白包括选自钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、BSA中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述磁性微粒的粒径不大于10μm。
根据本发明的实施方案，所述磁性微粒的粒径为0.5-10μm。
根据本发明的实施方案，所述标记物包括生物酶、荧光素、化学发光标记物中的任意一种。
根据本发明的实施方案，所述标记物为生物酶，所述生物酶包括辣根过氧化物美、碱性磷酸酶中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、异鲁米诺及其衍生物中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述血清素解离剂包括选自Triton x-100、十二烷基硫酸钠、NP-40中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述血清素解离剂为Triton x-100。
根据本发明的实施方案，所述缓冲溶液包括选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的至少之一。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明一个实施例中血清素发光免疫检测方法流程示意图；
图2显示了本发明一个实施例中血清素磁微粒分离化学发光免疫检测方法流程图；
图3显示了本发明一个实施例中高效液相色谱-串联质谱相关性。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本发明中，术语“钩状效应”即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。
在本发明中，术语“载体蛋白”是指某些不具有免疫原性的小分子物质可以与抗体结合，如果将其结合到具有免疫原性的大分子蛋白上就可诱导针对小分子物质的抗体应答，小分子物质赖以附着的蛋白质分子称为载体蛋白。
在本发明中，术语“标记抗体”指抗体经过酶标记、铁蛋白标记或通过胶体金标记获得标记抗体，是免疫电镜样品制备的一种方法，用于观察抗原抗体免疫复合物方面研究的手段。免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应***中抗原或抗体的性质与含量。抗体标记主要是用于抗原的定位分析，在某些情况下，也可以对混杂有大量其他分子的样本中的抗原进行定量检测。由于抗体与其相应抗原具有很高的亲和力，因此带有易识别标记物的抗体可以定位分析抗原，并且是一种理想的快速价廉的定量测定方法。
在本发明中，术语“碱性磷酸酶”(Alkaline Phosphatase,ALP)分子量140,000Da,在分子生物学和蛋白质研究中的主要应用是从DNA中去除5'-磷酸基团或作为免疫分析的报告***。在免疫分析测试中，酶通常与特定的一级或二级抗体结合，其活性用显色(或发光)底物检测。
在本发明中，术语“磁性微粒”是指可均匀分散于一定基液中的胶态复合材料。因其具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性。因此，将抗原/抗体、酶、核酸/寡核苷酸、小分子药物等固定在其表面。
在本发明中，术语“放射免疫测定”(radioimmunoassay，RIA)是利用放射性核素的测量方法与免疫反应的基本原理相结合的一种放射性核素体外检测法。
在本发明中，术语“高效液相色谱法”(High Performance LiquidChromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液***，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
一种血清素发光免疫检测方法
根据本发明的一些实施例，本发明提供了一种血清素发光免疫检测方法，包括免疫竞争法，应用磁微粒分离技术与化学发光免疫分析***相结合定量检测样本中血清素的含量。
根据本发明的一些更具体的实施例，所述血清素发光免疫检测方法如图1所示，具体包括：
S110、将血清素与载体蛋白偶联后，包被在磁性微粒表面，制备成血清素偶联载体蛋白磁微粒缓冲溶液；
S120、制备血清素标记抗体；
S130、将待测样本、血清素解离剂、步骤S110中溶液、步骤S120中抗体按比例混合后进行免疫反应；
S140、反应完全后，用磁场收集磁性微粒沉淀，并加入使步骤S120中标记抗体发光的底物，获得血清素浓度-发光值标准曲线；
S150、根据标准曲线计算所述血清素含量。
磁微粒连接的血清素偶联载体蛋白同待测样本或校准品或质控品中的血清素与血清素标记抗体发生免疫竞争反应。随后在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质磁分离。去上清后清洗沉淀的复合物，加入底物溶液。底物在酶作用下被催化裂解发光，发光强度与样本中血清素的浓度成反比，使用四参数方程拟合可计算出样本中血清素的含量。
根据本发明的一些实施例，所述磁微粒包括三氧化二铁或四氧化三铁磁性纳米颗粒与有机高分子材料形成的复合微球，所述复合微球表面通过改性带有一种或多种活性基团，所述活性基团能够与所述血清素偶联载体蛋白的氨基或羧基通过酰胺键进行交联形成血清素偶联载体蛋白包被的磁微粒。
根据本发明的一些实施例，所述血清素偶联载体蛋白可以通过所述血清素偶联载体蛋白的氨基或羧基直接或通过中间链接化合物偶联在磁珠表面，如磁珠—链霉亲和素偶联—生物素—生物素载体蛋白间接包被的方法包被于磁微粒上，也可以以抗体溶液的形式在反应中连接于磁性微粒上。
根据本发明的一些实施例，步骤S130中，可以将待测样本、血清素解离剂、步骤S110中溶液、步骤S120中抗体同时混合后进行免疫反应，也可以先将待测样本、血清素解离剂混合后，再将混合液与步骤S110中溶液、步骤S120中抗体混合后进行免疫反应。根据本发明的一些实施例，每毫克磁微粒标记的血清素偶联载体蛋白浓度优选为1-20μg之间，血清素偶联载体蛋白的磁微粒粒径优选为0.5-10μm之间，磁微粒的浓度优选为0.1-2mg/ml之间。
根据本发明的一些实施例，由于血清素约90％合成和分布于肠嗜铬细胞，通常与ATP等物质一起储存于细胞颗粒内，在刺激因素作用下，5-HT从颗粒内释放、弥散到血液，并被血小板摄取和储存。利用本发明特定的血清素解离剂，能够使储存在血小板或细胞颗粒内的血清素完全释放出来。
根据本发明的一些实施例，所述血清素标记抗体中的标记物，包括本领域已知的任何可对抗体进行标记的物质，比如生物素标记、酶标记，具体的，当采用碱性磷酸酶(ALP)标记时，所用的底物溶液包括0.005％-0.05％浓度的9,10-二氢吖啶衍生物或0.005％-0.05％浓度的金刚烷衍生物，当所述底物在所述碱性磷酸酶(ALP)作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。
根据本发明的一些实施例，所述血清素标记抗体中的血清素抗体，包括本领域已知的任意方法获得的单克隆抗体或多克隆抗体，例如，以血清素与钥孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)偶联后免疫动物产生的单克隆抗体或多克隆抗体。
根据本发明的一些实施例，所述标记物与所述血清素抗体通过酰胺键偶联形成的标记物-血清素抗体偶联物。
根据本发明的一些更具体的实施例，所述标记物-血清素抗体偶联物的偶联方法包括本领域已知任意方法获得，例如，在所述血清素抗体加入本领域常用活化剂2-Iminothiolane hydrochloride(2-IT)，在所述标记物中加入本领域常用活化剂Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)，活化后的标记物与血清素抗体的混合比例优选为1:0.5-2。
一种血清素发光免疫检测试剂盒
根据本发明的一些实施例，本发明提供一种测定血清素含量的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、校准品、质控品、血清素解离剂、发光底物液。其中，所述试剂A包括血清素偶联载体蛋白磁微粒缓冲溶液，所述试剂B包括血清素标记抗体溶液，所述发光底物液包括能催化试剂B发光的底物缓冲溶液，所述校准品包含一系列浓度的血清素偶联载体蛋白抗原，所述质控品包括定浓度血清素的缓冲液，所述血清素解离剂包括表面活性剂，优选为含0.1-2％的Triton x-100缓冲溶液。
根据本发明的一些实施例，所述试剂A、试剂B、校准品、质控品、血清素解离剂、发光底物液的缓冲液包括选自10-100mM，pH6.0-9.0的磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸盐缓冲液的一种或几种组合。
根据本发明的一些实施例，所述试剂A中磁微粒包括三氧化二铁或四氧化三铁磁性纳米颗粒与有机高分子材料形成的复合微球，所述符复合微球表面通过改性带有一种或多种活性基团，所述活性基团能够与所述血清素偶联载体蛋白的氨基或羧基通过酰胺键进行交联形成血清素偶联载体蛋白包被的磁微粒。
根据本发明的一些实施例，所述试剂A中血清素偶联载体蛋白可以通过所述血清素偶联载体蛋白的氨基或羧基直接或通过中间链接化合物偶联在磁珠表面，如磁珠—链霉亲和素偶联—生物素—生物素载体蛋白间接包被的方法包被于磁微粒上，也可以以抗体溶液的形式在反应中连接于磁性微粒上。
根据本发明的一些实施例，每毫克磁微粒标记的血清素偶联载体蛋白浓度优选为1-20μg之间，血清素偶联载体蛋白的磁微粒粒径优选为0.5-10μm之间，磁微粒的浓度优选为0.1-2mg/ml之间。
根据本发明的一些实施例，所述试剂B中血清素标记抗体的标记物，包括本领域已知的任何可对抗体进行标记的物质，比如生物素标记、酶标记，具体的，当采用碱性磷酸酶(ALP)标记时，所用的底物溶液包括0.005％-0.05％浓度的9,10-二氢吖啶衍生物或0.005％-0.05％浓度的金刚烷衍生物，当所述底物在所述碱性磷酸酶(ALP)作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。
根据本发明的一些实施例，所述试剂B中血清素标记抗体的血清素抗体，包括本领域已知的任意方法获得的单克隆抗体或多克隆抗体，例如，以血清素与钥孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)偶联后免疫动物产生的单克隆抗体或多克隆抗体。
根据本发明的一些实施例，所述试剂B中标记物与血清素抗体通过酰胺键偶联形成的标记物-血清素抗体偶联物。
根据本发明的一些更具体的实施例，所述试剂B中标记物-血清素抗体偶联物的偶联方法包括本领域已知任意方法获得，例如，在所述血清素抗体加入本领域常用活化剂2-Iminothiolane hydrochloride(2-IT)，在所述标记物中加入本领域常用活化剂Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)，活化后的标记物与血清素抗体的混合比例优选为1:0.5-2。
根据本发明的一些具体实施例，所述校准品为浓度从低到高，范围在0μg/ml～4μg/ml之间的多个不同浓度点用于建立标准曲线，优选浓度为0μg/ml，0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml。
根据本发明的一些具体实施例，所述质控品为浓度从低到高范围在0μg/ml～4μg/ml之间的最少一个浓度点，优选浓度为0.1μg/ml，2.0μg/ml。
根据本发明的一些具体实施例，所述标准曲线由以下方法获得，如图2所示，包括：
(1)免疫反应：将不同浓度的50μl的校准品或质控品分别与50μl试剂A、50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；
(2)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(3)读值：加入发光底物液200μl，碱性磷酸酶催化底物发光后采用全自动化学发光免疫分析仪SMART 500H测定相对发光强度；
(4)根据检测的数值使用四参数方程拟合，获得血清素浓度-发光值标准曲线。
血清素发光免疫检测试剂盒在血清素检测中的用途
根据本发明的一些具体实施例，所述检测试剂盒在血清素检测中的具体步骤包括：
(1)免疫反应：将待测样品或质控品、50μl试剂A、50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；
(2)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(3)读值：加入发光底物液200μl，碱性磷酸酶催化底物发光后采用自研化学发光检测仪测定相对发光强度，通过计算得到样本中的血清素的含量。
本发明提供的血清素发光免疫检测试剂盒及其检测方法所具有的有益效果为：本发明采用的竞争法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的血清素含量，确保了检测的灵敏度，由于实验采用竞争法不存在HOOK效应，无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明为临床检测样本中的血清素提供了一种更准确、方便和快捷的方法。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明检测试剂盒中的所有组分均能通过商业途径从生物试剂或化学试剂公司购买得到。本发明中所用标记碱性磷酸酶(ALP)抗体为thermo fisher scientific公司生产，货号为MA5-12111；抗原为abcam公司生产，CAS编号153-98-0；碱性磷酸酶(ALP)购自英国BBI公司，型号为：ALPI12G；SMCC购自thermo fisher scientific公司，货号为：22360；2-IT购自thermo fisher scientific公司，CAS：4781-83-3；货号为:26101；羧基修饰微粒购自thermo fisher scientific公司；EDC购自SIMGA公司，CAS：25952-53-8，货号：E7750。发光底物和血清素解离剂来自北京巴瑞医疗器械有限公司成品试剂盒。
实施例1：磁微粒标记血清素抗体
取20mg羧基修饰微粒溶液，将具有超顺磁性，粒径均匀，表面含有羧基(COOH-)活性基团的磁微粒在磁场作用下沉降(磁分离)10分钟，去上清，沉降的磁微粒用活化缓冲液摩尔浓度0.05M的(2-(N-***啉)乙磺酸)MES，pH6.0缓冲液清洗3次，每次用量2ml。
将洗涤后磁微粒用1.0ml活化缓冲液摩尔浓度0.05M的(2-(N-***啉)乙磺酸)MES，pH6.0的缓冲液充分混悬后加入活化剂1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)，室温混悬反应30分钟，EDC反应摩尔浓度为7.5mM。
取1.0mg的血清素偶联载体蛋白抗原，浓缩至2.5mg/mL。
将浓缩至2.5mg/mL的血清素偶联载体蛋白抗原按1.0mg的血清素偶联载体蛋白抗原加入20mg活化后的磁微粒溶液混合，轻摇混匀，在4℃混悬条件下反应6.5小时，使得血清素抗体被共价偶联在磁微粒表面，制得试剂A。
实施例2：碱性磷酸酶标记血清素抗体
取1.0mg的血清素抗体，浓缩至2.5mg/mL，加入浓度为13.76mg/mL的活化剂2-Iminothiolane hydrochloride(2-IT)溶液5μL，室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的抗体。
取1.2mg碱性磷酸酶，浓缩至2.5mg/mL，加入浓度为6.69mg/mL的活化剂Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)溶液12μL，室温反应15分钟。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶。
将活化后血清素抗体与碱性磷酸酶按1.0mg的血清素抗体加入1.0mg碱性磷酸酶的比例混合，放置4℃下反应18小时。
使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的血清素抗体和碱性磷酸酶，将连接物保存于4℃，制得试剂B。
实施例3：血清素磁微粒分离化学发光免疫检测方法
(1)免疫反应：将实施例1的50μl的校准品系列(浓度分别为0μg/ml，0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml)或质控品分别与实施例1的50μl试剂A、实施例2的50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；
(2)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(3)读值：加入发光底物液200μl，碱性磷酸酶催化底物发光后采用自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)；
(4)根据检测的数值使用四参数方程拟合，获得血清素浓度-发光值标准曲线。
(5)将50μl的待测样品与实施例1的50μl试剂A、实施例2的50μl试剂B依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；
(6)磁分离：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200-500μl清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次，以去除未结合的抗体和杂质；
(7)读值：加入发光底物液200μl，ALP催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)；
(8)将待测样本的发光强度与步骤(4)的标准曲线比对，使用四参数方程拟合可计算出待测样本中血清素的含量。
实施例4：试剂盒性能测试
检测本试剂盒的线性范围、空白限、准确性、精密度。具体操作步骤如下：
(1)剂量-反应曲线线性：用试剂盒最高浓度点校准品和该项目校准品稀释液倍比稀释到接近该项目分析灵敏度，形成0-5μg/mL范围内的血清素溶液浓度点样本。试剂盒定标后测试梯度样本，每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数(r)。
Figure BDA0004144021710000111
表1本发明试剂盒剂量-反应曲线线性检测
Figure BDA0004144021710000112
表1结果表明，0-5μg/mL范围内试剂盒剂量-反应曲线的r值>0.9900。
(2)空白限：用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的相对发光强度值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，M-2SD(负反应)的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值。
表2本发明试剂盒的空白限
Figure BDA0004144021710000121
表2结果表明，试剂盒的空白限为是2.3ng/ml，满足要求。
(3)精密度：用高、低两个水平浓度的样本和本试剂盒，重复测试10次，按以下公式计算测定结果的均值
Figure BDA0004144021710000122
和变异系数(CV)。
Figure BDA0004144021710000123
Figure BDA0004144021710000124
式中：Xi──待测样本的测定结果；
Figure BDA0004144021710000126
──待测样本的均值；n──测定次数，此处为10。
表3本发明试剂盒的精密度
Figure BDA0004144021710000125
/>
Figure BDA0004144021710000131
表3结果表明，利用本发明的试剂盒重复测试10次的值均比较接近，试剂盒的变异系数均小于8％，表明本发明试剂盒的精密度比较高。
(4)交叉反应性：配制一定浓度的交叉反应物色氨酸和5-羟色氨酸作为样本用试剂盒进行检测，检测结果与样本配制浓度的比值(％)即为对该样本的交叉反应率。
表4本发明试剂盒的交叉反应
Figure BDA0004144021710000132
表4结果表明，本发明试剂盒和主要交叉物质交叉率均小于0.05％，交叉物质对本发明试剂盒无干扰。
(5)本试剂盒与高效液相色谱-串联质谱法相关性：用本发明试剂盒和高效液相色谱-串联质谱同时测定35例临床诊断抑郁症、双相情感障碍、精神***症等血液样本，与高效液相色谱-串联质谱相关性见图3：y＝0.9808x-6.5977，R2＝0.9906，说明本试剂盒可以用来对相关精神疾病的及时诊断和治疗提供帮助。
综上所述，本发明采用的竞争法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的血清素含量，确保了检测的灵敏度，由于实验采用竞争法不存在HOOK效应，无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明为临床检测人血清中的血清素提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
本发明提供的血清素含量的磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (13)

1.一种血清素发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、血清素解离剂、发光底物液；
其中，所述试剂A包括血清素偶联载体蛋白磁微粒缓冲溶液；
所述试剂B包括标记物标记的血清素抗体溶液；
所述标记物包括生物酶、荧光素、化学发光标记物中的任意一种；
所述发光底物液包括能催化试剂B发光的底物缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白包括选自钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、BSA中的至少之一。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述血清素偶联载体蛋白磁微粒的粒径不大于10μm；
任选地，所述血清素偶联载体蛋白磁微粒的粒径为0.5-10μm。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述标记物为生物酶，所述生物酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的至少之一；
任选地，所述化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、异鲁米诺及其衍生物中的至少之一。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述血清素解离剂包括选自Triton x-100、十二烷基硫酸钠、NP-40中的至少之一；
任选地，所述血清素解离剂为Triton x-100。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有的缓冲溶液包括选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的至少之一。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括校准品和/或质控品，
其中，所述校准品包含不同浓度梯度的血清素偶联载体蛋白；
所述质控品包括确定浓度的血清素缓冲溶液。
8.权利要求1-7中任一项所述的血清素发光免疫检测试剂盒在血清素检测中的用途。
9.一种血清素发光免疫检测方法，其特征在于，所述检测方法包括利用权利要求1-7中任一项所述的血清素发光免疫检测试剂盒对待测样品进行血清素检测。
10.一种血清素发光免疫检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
(A)将血清素与载体蛋白偶联后，包被在磁性微粒表面，制备血清素偶联载体蛋白磁微粒缓冲溶液；
(B)制备标记物标记的血清素抗体溶液；
(C)将待测样品、所述血清素解离剂、所述血清素偶联载体蛋白磁微粒缓冲溶液、血清素抗体溶液混合，进行免疫反应，形成免疫复合物；
(D)将所述免疫复合物与未结合的其他物质进行磁分离，收集磁性微粒沉淀；
(E)向所述磁性微粒沉淀中加入发光底物液，检测发光强度，以便获取所述待测样品中的血清素含量。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法进一步包括：
利用校准品绘制血清素浓度-发光值标准曲线，其中，所述校准品包含不同浓度梯度的血清素偶联载体蛋白。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法进一步包括：
(1)以校准品为待测样品，实施步骤(A)-(E)，测定不同浓度对应的发光强度，其中，所述校准品包含不同浓度梯度的血清素偶联载体蛋白；
(2)根据所述发光强度绘制血清素浓度-发光值标准曲线；
(3)根据所述血清素浓度-发光值标准曲线，获取未知待测样品中的血清素含量。
13.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述载体蛋白包括选自钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白、BSA中的至少之一；
任选地，所述磁性微粒的粒径不大于10μm；
任选地，所述磁性微粒的粒径为0.5-10μm；
任选地，所述标记物包括生物酶、荧光素、化学发光标记物中的任意一种；
任选地，所述标记物为生物酶，所述生物酶包括辣根过氧化物美、碱性磷酸酶中的至少之一；
任选地，所述化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、异鲁米诺及其衍生物中的至少之一；
任选地，所述血清素解离剂包括选自Triton x-100、十二烷基硫酸钠、NP-40中的至少之一；
任选地，所述血清素解离剂为Triton x-100；
任选地，所述缓冲溶液包括选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的至少之一。
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