CN110887968A - 一种甲胎蛋白的定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种甲胎蛋白的定量检测方法，包括：生物素标记的甲胎蛋白抗体、链霉亲和素磁微粒悬浮液、吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体、标准品、清洗液、稀释液、化学发光底物液A、化学发光底物液B；链霉亲和素与生物素具有高特异性的结合能力，链霉亲和素与生物素标记的高纯度抗体非共价键特异性结合，具有级联放大的作用，其反应呈高度专一性；本发明将抗体‑抗原反应的高度特异性与吖啶酯发光的高度灵敏性结合起来，利用吖啶酯捕捉反应产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。

Description

一种甲胎蛋白的定量检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种甲胎蛋白的定量检测方法。
背景技术
甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，它属于白蛋白家族，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成。甲胎蛋白在胎儿血液循环中具有较高的浓度，出生后则下降，至生后2～3月甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中较难检出，故在成人血清中含量极低。甲胎蛋白具有很多重要的生理功能，包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、T淋巴细胞诱导凋亡等。甲胎蛋白与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中均可表现出较高浓度，可作为多种肿瘤的阳性检测指标。目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。
因此，对AFP的临床分子诊断显得十分重要，尤其是灵敏度检测对及早发现肿瘤并制定治疗方案极为重要。目前，测定AFP免疫检测方法较多，最常用的血清检测方法有：酶免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)、化学发光法以及时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA)。其中，酶标法为半定量试剂，在准确性、灵敏度上存在很大的局限性，并且对于酶的活性极易受标记反应以及温度、pH值及溶液中离子浓度等因素的影响、线性范围窄、费时等缺点；放射性免疫法操作带放射性以及标志物放置时间短，试剂有效期较短等缺点；磁微粒化学发光技术是将免疫磁珠体系、化学发光体系与免疫反应体系相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。它既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫操作的简便、快速特点，易于自动化操作，在测试中不使用有害的试剂，试剂保质期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甲胎蛋白的定量检测方法，灵敏度高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高。
为实现上述目的，本发明的技术方案提供一种甲胎蛋白的定量检测方法，包括生物素标记的甲胎蛋白抗体、链霉亲和素磁微粒悬浮液、吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体、标准品、清洗液、稀释液、化学发光底物液A、化学发光底物液B。
所述链霉亲和素磁微粒悬浮液为包被链霉亲和素的磁微粒溶液。
所述生物素标记的甲胎蛋白抗体为单克隆抗体。
所述稀释液为含有解离剂的PBS缓冲液，解离剂为2-甲氧基***。
所述标准品为含不同浓度甲胎蛋白抗原的PBS缓冲液。
所述清洗液为浓度0.025mol/L的Tris-HCl缓冲液，其中含浓度0.15mol/L的NaCl及0.05％Tween-20。
所述化学发光底物液A由质量分数为1.5％的H2O2和浓度为0.1mol/L的HNO3组成。
所述化学发光底物液B为由0.1mol/L的Triton X-100和0.35mol/L的NaOH混合液组成。
一种甲胎蛋白试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)取样本20ul加入反应管中，再依次加入生物素标记的甲胎蛋白抗体30ul和吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体30ul，于37℃孵育15min，最后加入链霉亲和素磁微粒悬浮液30ul，于37℃孵育15min；
2)将孵育反应完成的反应管放在磁分离架上分离2min，去上清，加上清洗液500ul，放在磁分离架上清洗1min；去上清，加上清洗液300ul，放在磁分离架上清洗1min；
3)在反应管中加入100ul化学发光底物液A，1min后加入100ul化学发光底物液B，37℃避光孵育5min后，测量发光值。
本发明具有有益效果：
本发明提供的甲胎蛋白化学发光检测试剂盒为吖啶酯化学发光体系，吖啶酯发光体系简单，不需要催化剂，置于H2O2溶液中即可发光，无需催化过程、增强剂，所以降低了背景发光，提高了灵敏度且干扰作用小。吖啶酯的光释放快速集中，发光峰值在0.4s，半衰期为0.8s，发光效率高且强度大。且吖啶酯易于蛋白质联结，分子量小，对联结后抗体构象影响小，标记稳定性好。
链霉亲和素与生物素具有高特异性的结合能力，链霉亲和素与生物素标记的高纯度抗体非共价键特异性结合，具有级联放大的作用，其反应呈高度专一性。因此，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰，而且结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。本发明将抗体-抗原反应的高度特异性与吖啶酯发光的高度灵敏性结合起来，利用吖啶酯捕捉反应产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。
附图说明
图1为实施例2制备的链霉亲和素磁微粒在电子显微镜下的成像图。
图2为本试剂盒检测不同浓度甲胎蛋白标准品的标准曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种甲胎蛋白磁微粒化学发光试剂盒，包括生物素标记的甲胎蛋白抗体、链霉亲和素磁微粒悬浮液、吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体、标准品、清洗液、稀释液、化学发光底物液A、化学发光底物液B；
所述链霉亲和素磁微粒悬浮液为包被链霉亲和素的磁微粒溶液。
所述生物素标记的甲胎蛋白抗体为单克隆抗体。
所述清洗液为浓度0.025mol/L的Tris-HCl缓冲液，其中含浓度0.15mol/L的NaCl及0.05％Tween-20。
所述化学发光底物液A由质量分数为1.5％的H2O2和浓度为0.1mol/L的HNO3组成。
所述化学发光底物液B为由0.1mol/L的Triton X-100和0.35mol/L的NaOH混合液组成。
所述标准品是用含有0.5-5.0％BSA的Tris-HCl缓冲液为基质，加入甲胎蛋白抗原配制而成，标准品浓度梯度为：0ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml。
所述稀释液为含有解离剂的缓冲液，解离剂为2-甲氧基***。
一种甲胎蛋白磁微粒化学发光试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)取样本或标准品50ul加入反应管中，再依次加入生物素标记的甲胎蛋白抗体50ul和吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体50ul，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物，于37℃孵育15min，最后加入链霉亲和素磁微粒悬浮液50ul，复合物在链霉亲和素和生物素相互作用下形成固相，于37℃孵育10min；
2)将孵育反应完成的反应管放在磁分离架上分离3min，去上清，加上清洗液500ul，放在磁分离架上清洗3min；去上清，加上清洗液300ul，放在磁分离架上清洗3min；
3)在反应管中加入100ul化学发光底物液A，1min后加入100ul化学发光底物液B，37℃避光孵育5min后，测量发光值。
实施例2
本发明中公布了链霉亲和素磁微粒的制备方法，具体步骤为：
a.制备纳米磁微粒：将FeSO4.7H2O和FeCL3.6H2O溶液按物质的量比1:2的比例混合，铁盐总浓度为0.5mol/L，加入三角瓶中，再加入200mL蒸馏水，温度保持在30℃，通入氮气，用0.25mol/LNaOH调整PH为10，70℃快速搅拌30min，70℃静止晶化2h，磁性分离，得四氧化三铁颗粒，再用蒸馏水清洗3次，无水乙醇清洗3次，得到四氧化三铁纳米磁微粒。
b.磁微粒的表面修饰：将四氧化三铁纳米磁微粒与无水乙醇以体积比1:8的比例混合，加入APTES试剂，室温下搅拌6-8小时，磁分离，得硅烷化四氧化三铁纳米磁珠；用无水乙醇溶液洗涤硅烷化四氧化三铁纳米磁珠2-3次，得到硅烷化四氧化三铁纳米磁珠无水乙醇混合液；再用PBS缓冲液洗涤硅烷化四氧化三铁纳米磁珠无水乙醇混合液2-3次，得磁微粒混合液；向磁微粒混合液中加入戊二醛溶液,室温下振荡交联1.5-2.5小时，再磁分离，弃去上清液，得氨基化四氧化三铁纳米磁微粒混合液
c.链霉亲和素磁微粒的制备：用链霉亲和素包被氨基化四氧化三铁纳米磁微粒混合液，室温下振荡固定6小时，磁分离，得包被后纳米磁微粒混合液，用蒸馏水和PBS缓冲液先后分别洗涤3-4次，得免疫纳米磁微粒，最后将链霉亲和素磁微粒分散在5ml PBS溶液中，4℃保存待用。
本发明的制备的链霉亲和素磁微粒粒径40-60纳米，纳米磁微粒具有超顺磁性，即在外加磁场中有较强的磁响应性，而撤去磁场后，磁微粒的磁性马上消失，也就是没有剩磁，重新均匀分散于溶液中。图1为本实施例制备的链霉亲和素磁微粒在电子显微镜下的成像，从图1中可以看出，链霉亲和素磁微粒粒径均匀、球形规整、尺寸均一。
实施例3
利用标准品对本发明试剂盒进行检测，检测结果如表1所示，灵敏度最低检出值2ng/ml；根据化学发光值与浓度作校准曲线，如图2所示，线性系数r2＝0.9937，线性范围1～250ng/ml。
表1
Figure BDA0002311816050000071
实施例3
本发明还进行了重复试验，以验证本试剂盒的准确性。
取浓度为10ng/ml的甲胎蛋白标准品进行10次试验，利用线性方程y＝10.187x+19.141，计算检测浓度值。
检测结果如表3所示，测定的平均值分别为10.041ng/ml，标准偏差为0.122，批内变异系数为1.2％，本试剂盒检测结果准确度高、线性关系良好，可作为辅助诊断肝癌的重要工具。
表2
甲胎蛋白标准品(10ng/ml)
第一次 9.87
第二次 10.11
第三次 10.09
第四次 9.95
第五次 10.28
第六次 9.89
第七次 10.06
第八次 10.11
第九次 9.98
第十次 10.07
平均值 10.041
标准偏差 0.122
批内变异系数 1.2％
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种甲胎蛋白的定量检测方法，其特征在于，包括生物素标记的甲胎蛋白抗体、链霉亲和素磁微粒悬浮液、吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体、标准品、清洗液、稀释液、化学发光底物液A、化学发光底物液B。
2.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述链霉亲和素磁微粒悬浮液为包被链霉亲和素的磁微粒溶液。
3.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述生物素标记的甲胎蛋白抗体为单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述稀释液为含有解离剂的PBS缓冲液，解离剂为2-甲氧基***。
5.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述标准品为含不同浓度甲胎蛋白抗原的PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述清洗液为浓度0.025mol/L的Tris-HCl缓冲液，其中含浓度0.15mol/L的NaCl及0.05％Tween-20。
7.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述化学发光底物液A由质量分数为1.5％的H2O2和浓度为0.1mol/L的HNO3组成。
8.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述化学发光底物液B为由0.1mol/L的Triton X-100和0.35mol/L的NaOH混合液组成。
9.一种甲胎蛋白试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取样本20ul加入反应管中，再依次加入生物素标记的甲胎蛋白抗体30ul和吖啶酯标记的甲胎蛋白抗体30ul，于37℃孵育15min，最后加入链霉亲和素磁微粒悬浮液30ul，于37℃孵育15min；
2)将孵育反应完成的反应管放在磁分离架上分离2min，去上清，加上清洗液500ul，放在磁分离架上清洗1min；去上清，加上清洗液300ul，放在磁分离架上清洗1min；
3)在反应管中加入100ul化学发光底物液A，1min后加入100ul化学发光底物液B，37℃避光孵育5min后，测量发光值。
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