CN113930393A - 一种脐带干细胞来源外泌体的提取及水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带干细胞来源外泌体的提取及水凝胶的制备方法，属于干细胞加工技术领域，解决了现有脐带间充质干细胞的分离操作和外泌体水凝胶的制备工艺较为复杂的问题，包括以下步骤：脐带间充质干细胞的原代培养；分段收集脐带间充质干细胞的培养基，离心过滤后得到上清液，将上清液离心超滤后得到人脐带间充质干细胞外泌体；将提取的人脐带间充质干细胞外泌体和氯化钙溶液加入海藻酸钠溶液中，静置孵育，形成人脐带间充质干细胞外泌体的海藻酸盐水凝胶，本发明通过对现有脐带干细胞来源外泌体的提取及水凝胶的制备方法进行优化改进，有效提高了脐带间充质干细胞的提取效率和纯度，工艺简单，具有良好的经济效益和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞加工技术领域，更具体的是涉及脐带干细胞来源外泌体的提取及水凝胶制备技术领域。
背景技术
脐带间充质干细胞(Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells，ucMSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。
目前出现了一些脐带间充质干细胞外泌体的提取和外泌体应用的方法，如申请号为202011184764.2的中国发明专利公开了《一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备及外泌体乳霜的制备方法》，其制备方法包括：将人脐带间充质干细胞置于培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养；直到细胞达60％-70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12-16h；将无血清的饥饿培养液换为含有表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF的DMEM/F12培养液，培养至细胞处于对数生长期，收集细胞培养上清液，梯度离心，将离心所得的上清液用滤器过滤；将得到的人脐带间充质干细胞外泌体提取液与乳霜基础配方配置得到乳霜。其制备的乳霜能够改善细胞***并分泌出大量的细胞外基质帮助完成肌肤细胞的更新，改善细胞状态。
再如申请号为202010225566.X的中国发明专利公开了《一种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法》，其包括间充质干细胞外泌体和水凝胶，其中水凝胶由普朗尼克F127和普朗尼克F68组成；分别配制普朗尼克F127和普朗尼克F68的生理盐水溶液，及间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液，在4℃条件下将上述溶液混合，即可得到外泌体水凝胶伤口敷料。相对于单独采用间充质干细胞外泌体和水凝胶，其制备得到的伤口敷料更能促进皮肤创面细胞再生，缩短伤口愈合时间。
此外申请号为201910623484.8的中国发明专利公开了《一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法》，其中所述水凝胶材料是含有包含人脐带间充质干细胞外泌体、纳米羟基磷灰石、透明质酸-己二酸二酰肼衍生物和主链具有醛基的海藻酸衍生物，其制备方法包含人脐带间充质细胞的分离、外泌体的提取、纳米羟基磷灰石制备、海藻酸钠透明质酸衍生物制备及复合水凝胶制备等步骤，该技术方案为骨缺损治疗提供了一种新的修复方法，具有广阔的应用前景和理想的修复效果。
上述专利文献均存在以下问题：1.脐带间充质干细胞的分离操作步骤复杂，提取的外泌体浓度较低；2.外泌体水凝胶的制备工艺复杂，成分较多，不利于后续复合制剂的形成。因此，对现有脐带干细胞来源外泌体的提取及水凝胶的制备方法进行优化改进对于当前脐带间充质干细胞的获取、间充质干细胞库的建立和临床应用具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种脐带干细胞来源外泌体的提取及水凝胶的制备方法。
本发明为了实现上述目的具体采用了以下技术方案：
一种人脐带间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：将海藻酸钠粉末溶解在PBS缓冲液中，配置成质量浓度为2％的海藻酸钠溶液；
S2：在海藻酸钠溶液中加入人脐带间充质干细胞外泌体，搅拌均匀；
S3：将质量浓度为1％的氯化钙溶液加入海藻酸钠溶液中，并在37℃下孵育10min，形成浓度为0.2μg/μL的人脐带间充质干细胞外泌体的海藻酸盐水凝胶。
所述氯化钙溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1:4。
所述步骤S2中人脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，包括以下步骤：
S201：将人脐带间充质干细胞置于培养箱中，用DMEM/F12基础培养基在37℃、5％CO2条件下进行培养；
S202：当细胞达80％汇合时，将人脐带间充质干细胞在无血清的培养基中培养24～72h，分段收集培养基；
S203：将收集的培养基在4℃下1000×g离心15min，去除细胞碎片和死亡细胞，获取上清液，上清液在4℃下12000×g再离心30min，以进一步消除细胞碎片，收集上清液，过滤后备用；
S204：将过滤后的上清液在4℃下150000×g离心1.5h，离心后立即吸出上清液，沉淀用PBS进行洗涤，并在150000×g和4℃条件下再次离心1.5h，收集上清液，将两次离心后收集的上清液合并后进行超滤，得到人脐带间充质干细胞外泌体；
S205：将得到的人脐带间充质干细胞外泌体重新悬浮在PBS中，得到人脐带间充质干细胞外泌体提取液。
所述步骤S201中人脐带间充质干细胞是以脐带组织块为原代，脐带组织经无菌PBS和75％酒精洗涤后切割成1～3mm大小糊状组织，再置于DMEM/F12基础培养基上进行培养。
所述步骤S202中人脐带间充质干细胞的传代次数少于5次。
所述步骤S202中分段收集培养基的培养时间分别为24h、48h和72h。
本发明的有益效果如下：本发明对脐带间充质干细胞来源的外泌体的提取方法中细胞提取过程进行了优化，使得脐带间充质干细胞的提取效率更高、纯度更高，同时在获取更多细胞的前提下，能够保证外泌体的获取量，工艺简单，具有良好的经济效益和广阔的应用前景，对于当前脐带间充质干细胞的获取、间充质干细胞库的建立和临床应用具有非常重要的意义。
附图说明
图1是本发明脐带间充质干细胞来源外泌体粒径分析示意图；
图2是本发明脐带间充质干细胞来源外泌体标志物鉴定图；
图3是本发明脐带间充质干细胞来源外泌体透射电镜图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种人脐带间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：
S1：脐带间充质干细胞的原代培养
S101：取足月剖宫产术后无疾病的健康产妇新鲜脐带，无菌PBS冲洗数次后，75％酒精洗涤，无菌PBS冲洗干净后用灭菌眼科剪成1-3mm大小糊状组织。置于含有DMEM/F12(GibcoDulbecco's Modified Eagle Medium：F-12)基础培养基中在37℃、5％CO2条件下培养；
S102：当达到80％汇合时，细胞被胰蛋白酶消化用于传代；
S103：将传代次数少于5次的人脐带间充质干细胞在无血清的培养基中培养24～72h后，分段收集培养基；
S2：hUCMSC外泌体提取
S201：将传代次数少于5次的人脐带间充质干细胞在无外泌体血清的培养基中培养，连续收集24h、48h、72h培养基；
S202：将分段收集的培养基在4℃下1000×g离心15min，去除细胞碎片和死亡细胞，获取上清液，上清液在4℃下12000×g再离心30min，以进一步消除细胞碎片，收集上清液，将收集的上清液再用0.2μm的滤器过滤后备用；
S203：将过滤后的上清液在4℃下150000×g离心1.5h，离心后立即吸出上清液，沉淀用PBS洗涤，并在150000×g和4℃下再次离心1.5h，分离上清液和沉淀物，将两次离心后收集的上清液合并后用3KD超滤管进行超滤，收集3KD超滤管上附着物，合并附着物和沉淀物，得到人脐带间充质干细胞外泌体，将得到的人脐带间充质干细胞外泌体重新悬浮在PBS中并提取以供后续使用；
S3：人脐带间充质干细胞外泌体水凝胶制备
S301：在室温下将海藻酸钠粉末溶解在PBS缓冲液中，配置成质量浓度为2％海藻酸钠溶液；
S302：将200μg的hUCMSC外泌体添加到海藻酸钠溶液中搅拌均匀；
S303：将质量浓度为1％的氯化钙溶液以1:4的体积比加入海藻酸钠溶液中，并在37℃下孵育10min，形成终浓度为0.2μg/μL的hUCMSC外泌体的海藻酸盐水凝胶。
Claims (6)
1.一种人脐带间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将海藻酸钠粉末溶解在PBS缓冲液中，配置成质量浓度为2％的海藻酸钠溶液；
S2：在海藻酸钠溶液中加入人脐带间充质干细胞外泌体，搅拌均匀；
S3：将质量浓度为1％的氯化钙溶液加入海藻酸钠溶液中，并在37℃下孵育10min，形成浓度为0.2μg/μL的人脐带间充质干细胞外泌体的海藻酸盐水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于：所述氯化钙溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1:4。
3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中人脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，具体包括以下步骤：
S201：将人脐带间充质干细胞置于培养箱中，用DMEM/F12基础培养基在37℃、5％CO2条件下进行培养；
S202：当细胞达80％汇合时，将人脐带间充质干细胞在无血清的培养基中培养24～72h，分段收集培养基；
S203：将收集的培养基在4℃下1000×g离心15min，去除细胞碎片和死亡细胞，获取上清液，上清液在4℃下12000×g再离心30min，以进一步消除细胞碎片，收集上清液，过滤后备用；
S204：将过滤后的上清液在4℃下150000×g离心1.5h，离心后立即吸出上清液，沉淀用PBS进行洗涤，并在150000×g和4℃条件下再次离心1.5h，收集上清液，将两次离心后收集的上清液合并后进行超滤，得到人脐带间充质干细胞外泌体；
S205：将得到的人脐带间充质干细胞外泌体重新悬浮在PBS中，得到人脐带间充质干细胞外泌体提取液。
4.根据权利要求3所述的一种人脐带间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S201中人脐带间充质干细胞是以脐带组织块为原代，脐带组织经无菌PBS和75％酒精洗涤后切割成1～3mm大小糊状组织，再置于DMEM/F12基础培养基上进行培养。
5.根据权利要求3所述的一种人脐带间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S202中人脐带间充质干细胞的传代次数少于5次。
6.根据权利要求3所述的一种人脐带间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S202中分段收集培养基的培养时间分别为24h、48h和72h。
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