CN110755453A - 一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法 - Google Patents
一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，所述冻干粉通过含有过表达hEGF基因的生产用干细胞的培养上清液冻干制备而成；所述培养上清液的细胞浓度≥1×107个/ml；所述冻干粉中包含过表达的hEGF、人角质细胞生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子和纤维连接蛋白。本发明公开了一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，工艺设计合理，操作简单，制备得到的冻干粉不仅能够应用于烧烫伤患者和久治不愈溃疡创面等创口的修复治疗，而且方法简便易行，适用于不同来源的干细胞培养上清冻干粉的大规模生产，为干细胞应用于医学转化事业提供一条新的路径，具有较高的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法。
背景技术
皮肤创口愈合是指皮肤组织遭受外力作用后出现离断或缺损后的愈复过程，包括了皮肤组织再生，肉芽组织增生及瘢痕形成的复杂组合，表现出各种修复过程的协同作用。皮肤创伤包括皮肤擦伤、皮肤烧烫伤和慢性溃疡创面等。烧伤主要是对皮肤和黏膜以及深层皮肤组织，通过热力、化学物质、电能、放射线等方式引起的严重损害，其中比较常见的就是皮肤热力烧伤。相关统计结果显示，每年因为意外伤害致死排在首位的是交通事故，其次就是烧伤，而且在交通事故中，也有很多伤员是因为合并烧伤更损害，我国每年有1.5％-25％的人是由于烧伤致病的，也就是说每年发生不同程度烧伤的人数在2000万人，其中有5％的烧伤患者需要入院接受治疗。目前治疗普通烧汤伤的常用临床药物是以消炎药和中药药膏为主，但对于大面积烧烫伤需要进行皮肤移植，可是无论是自体或异体皮肤移植，均会受到供体来源和免疫排斥反应的限制。因此，寻找无排斥反应、促进皮肤损伤修复、促进皮肤再生的治疗方法显得特别重要，随着生物技术的发展，生物治疗逐渐受到大家的重视。
干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞，医学界称之为“万用细胞”。按照干细胞的分化潜能，分化层次及其所具有的功能，大致可分为三种类型：胚胎干细胞、组织干细胞和专能干细胞。干细胞具有多种生物学特性，最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能力。脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymalstem cells)主要是起源于新生儿出生后，被抛弃的脐带组织，具有很强的自我更新能力以及向脂肪细胞、骨细胞、神经细胞、肝细胞及肌细胞分化潜能。由于其获取途径比较方便，不会造成创伤，而且具有很低的免疫原性，增殖能力比较强，不会出现伦理性争义，因此在修复组织和器官中具有十分强大的优势，在再生医学中得到广泛运用。
针对上述情况，我们需要设计一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，应用于皮肤烧烫伤创面、残余创面、供皮区创面和慢性溃疡创面的修复治疗，这是我们亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，以解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，所述冻干粉通过含有过表达hEGF基因的生产用干细胞的培养上清液冻干制备而成。
较优化地，所述培养上清液的细胞浓度≥1×107个/ml。
较优化地，所述冻干粉中包含过表达的hEGF、人角质细胞生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子和纤维连接蛋白。
本发明公开了一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，该冻干粉富含人表皮生长因子(hEGF)，本发明中使用常规分离获得的干细胞，经分子克隆技术“过表达”人表皮生长因子(Human Epidermal growth factor,hEGF)，将干细胞培养上清制备成冻干粉，应用于皮肤烧烫伤创面、残余创面、供皮区创面和慢性溃疡创面的修复治疗。
本发明采用分子克隆技术将人表皮生长因子(hEGF)基因克隆至生产用干细胞中，经筛选亚克隆后，获得稳定表达分泌人表皮生长因子的干细胞株，加上该细胞株本身可自分泌FGF2，从而维持细胞的干细胞特性，避免其发生横向或纵向分化，使之成为具有长期传代和稳定表达细胞因子能力的工程细胞株，以保障生产用干细胞的稳定性和可持续性，从而达到产品质量的稳定。同时由于该产品是其表达产物，经后续工艺处理纯化后，无活体细胞进入，可作为外用制剂应用于美容等产品。
较优化地，所述冻干粉制备步骤如下：
1)间充质干细胞的制备；
2)将hEGF基因导入步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；
3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达hEGF的生产用干细胞；
4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，置于冻干机真空冷冻干燥，保存，即得成品。
较优化地，所述冻干粉制备步骤如下：
1)间充质干细胞的制备：步骤1)中进行充质干细胞的制备，一般通过组织块贴壁法制备得到分离后的间充质干细胞；
2)将hEGF基因导入步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；步骤2)先构建hEGF-pEGFP-N1真核表达质粒，将含有人表皮生长因子的表达质粒导入间充质干细胞中，使得间充质干细胞中具有过表达的人表皮生长因子的基因；
a)构建hEGF-pEGFP-N1真核表达质粒；
b)通过脂质体Lipofectamine2000分别包裹已构建好的hEGF-pEGFP-N1真核表达质粒，再转染至步骤1)获得的间充质干细胞中；
c)更换含800μg/mlG418的opti-MEM换液，继续培养；
d)48小时后倒置显微镜下观察，检测间充质干细胞中hEGF的表达，得到转染后的过表达干细胞；步骤d)
中将培养的间充质干细胞倒置显微镜下观察，通过检测hEGF的表达情况来确定转染步骤是否成功；
3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达hEGF的生产用干细胞；步骤3)中通过筛选亚克隆，再进行培养，以获得稳定表达分泌人表皮生长因子(hEGF)的干细胞株；
a)取步骤2)获得的过表达干细胞，0.25％胰蛋白酶进行常规消化，收集细胞悬液；
b)用血球计数板进行计数，并采用有限稀释法将细胞稀释为105个/ml，每孔接种100μl于96孔细胞培养板中，用含1600μg/mlG418选择培养基100μl/孔，进行选择培养；
c)培养7天后，再用0.25％胰蛋白酶进行消化，并扩增至24孔板；
d)进行扩增传代，并逐步减少G418用量至10μg/ml，继续培养，直至扩增量达到所需数量，得到生产用干细胞；
e)常规收集，洗涤，加入干细胞冻存液，分装并作好标记，并采用程序降温法冻存生产用干细胞于-196℃液氮中；
4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，置于冻干机真空冷冻干燥，保存，即得成品。
较优化地，所述步骤4)中，具体操作步骤为：
a)将步骤3)获得的生产用干细胞扩增传代二十代，直至细胞数量≥1010；
b)换成新鲜的无血清干细胞培养基，继续培养生产用干细胞3天；
c)收集生产用干细胞培养上清液，混匀；
d)采用ELISA检测试剂盒测定培养上清液中hEGF的表达情况；
e)将收集到的培养上清液分装为含纤维连接蛋白10μg/支，冷冻干燥，即得成品。
步骤4)中将生产用干细胞进行扩增，收集培养上清液，再进行冷冻干燥，即得到所需要的成品冻干粉，该冻干粉中含有过表达的人表皮生长因子、人角质细胞生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子和纤维连接蛋白，能够应用于创口修复治疗。
较优化地，所述步骤1)中的干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。
较优化地，所述脐带间充质干细胞的制备步骤如下：
a)无菌条件下取近胎儿端脐带20cm，两端各剪去2cm，先用含200U青链霉素的生理盐水漂洗脐带4-5次，至无血迹，再用无双抗的生理盐水漂洗，放含少许DMEM/F12培养基的培养皿中，剪成2-3cm的小段，将小段纵向剪开，剔除脐带内动、静脉血管，用组织镊将组织块撕成细条状，放入含少量DMEM/F12培养基的培养皿中，用眼科剪剪成1-2mm3的碎块，整个过程在冰浴中进行；
b)将剪碎的组织块蘸上少许血清，移入透气T25培养瓶中，每瓶20个，加入1.5ml含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h后换液，待有细胞贴壁后更换培养基，培养约8-12天，去除组织块；培养约20天，细胞长至80％融合，经胰酶消化收集细胞，得到间充质干细胞。
较优化地，按上述任意一种方案制备的冻干粉在烧烫伤和溃疡皮肤创面的修复药物中的用途。
较优化地，上述任意一种方案制备的冻干粉在外伤创面修复及预防疤痕的药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
干细胞还具有分泌多种细胞因子的能力，包括人表皮生长因子(EGF)、人角质细胞生长因子(KGF)、人成纤维细胞生长因子(FGF)、人血小板样衍生生长因子(PDGF)、纤维连接蛋白(FN)等。表皮表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种由53个氨基酸残基所组成的小分子多肽，分子量大约为6kD，是一种强力的细胞***促进因子，具有激活RNA、启动DNA和激活蛋白质合成等多种生理功能，研究发现，EGF能促进上皮细胞、成纤维细胞的增殖；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化，使肌肤各组成成份保持最佳生理状态；刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原白等)的合成与分泌、滋润皮肤，是决定肌肤活力和健康的源泉。其他三种细胞生长因子均具有促进皮肤细胞的生长与更新，提升皮肤组织的生理活性与新陈代谢水平，增强皮肤细胞的免疫力与自我修复能力。
本发明公开了一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，工艺设计合理，操作简单，制备得到的冻干粉含有过表达的人表皮生长因子，不仅能够应用于烧烫伤患者等创口具有快速修复皮肤创口的功效，并且对久治不愈的溃疡创面的依然具有修复治疗作用；同时本方案简便易行，适用于不同来源的干细胞培养上清冻干粉的大规模生产，为干细胞应用于医学转化事业提供一条新的路径，具有较高的实用性。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明制备时采用ELISA检测试剂盒测定培养上清液中hEGF的表达示意图，其中实验组为过表达hEGF基因的生产用干细胞的培养上清液，对照组为常规间充质干细胞培养上清液；
图2为本发明一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法的中构建pEGFp-N1质粒载体图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
S1：间充质干细胞的制备：
S11：无菌条件下取近胎儿端脐带20cm，两端各剪去2cm，先用含200U青链霉素的生理盐水漂洗脐带4-5次，至无血迹，再用无双抗的生理盐水漂洗，放含少许DMEM/F12培养基的培养皿中，剪成2-3cm的小段，将小段纵向剪开，剔除脐带内动、静脉血管，用组织镊将组织块撕成细条状，放入含少量DMEM/F12培养基的培养皿中，用眼科剪剪成1-2mm3的碎块，整个过程在冰浴中进行；
S12：将剪碎的组织块蘸上少许血清，移入透气T25培养瓶中，每瓶20个，加入1.5ml含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h后换液，待有细胞贴壁后更换培养基，培养约8-12天，去除组织块；培养约20天，细胞长至80％融合，经胰酶消化收集细胞，得到间充质干细胞。
S2：将hEGF基因导入间充质干细胞，得到过表达干细胞；
S21：构建hEGF-pEGFP-N1真核表达质粒；
S22：通过脂质体Lipofectamine2000分别包裹已构建好的hEGF-pEGFP-N1真核表达质粒，再转染至获得的间充质干细胞中；
S23：更换含800μg/mlG418的opti-MEM换液，继续培养；
S24：48小时后倒置显微镜下观察，检测间充质干细胞中hEGF的表达，得到转染后的过表达干细胞；
S3：利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达hEGF的生产用干细胞；
S31：取获得的过表达干细胞，0.25％胰蛋白酶进行常规消化，收集细胞悬液；
S32：用血球计数板进行计数，并采用有限稀释法将细胞稀释为105个/ml，每孔接种100μl于96孔细胞培养板中，用含1600μg/mlG418选择培养基100μl/孔，进行选择培养；
S33：培养7天后，再用0.25％胰蛋白酶进行消化，并扩增至24孔板；
S34：进行扩增传代，并逐步减少G418用量至10μg/ml，继续培养，直至扩增量达到所需数量，得到生产用干细胞；
S35：常规收集，洗涤，加入干细胞冻存液，分装并作好标记，并采用程序降温法冻存生产用干细胞于-196℃液氮中；
S4：将生产用干细胞扩增传代二十代，直至细胞数量≥1010；再换成新鲜的无血清干细胞培养基，继续培养生产用干细胞3天；收集生产用干细胞培养上清液，混匀；采用ELISA检测试剂盒测定培养上清液中hEGF的表达情况；
S5：将收集到的培养上清液分装为含纤维连接蛋白10μg/支，冷冻干燥，即得成品。
实验1：对烧伤创口愈合的治疗
选择10-12周龄的昆明鼠20只，随机分成两组，雄雌各半，用电烙铁在其腹壁两侧进行烫伤模型建立，两侧烫伤程度和面积均为2cm2左右。
次日开始，一侧用100μl培养用的培养基(新鲜，未曾接触细胞)涂抹，作为对照组；另一侧用100μl的无菌注射用水溶解冻干成品，并进行涂抹，作为实验组。
实验结果：实验组于第四天及开始结痂，第七天开始脱痂,十天100％痊愈；对照组第四天其创面依然有少许渗出液，十五天尚有3/10的小鼠创面依然未能愈合。
实验2：
实验1操作结束后，取对照组中三只未能愈合的小鼠，重新使用用100μl的无菌注射用水溶解的冻干成品，并进行涂抹。
实验结果：三天后这三只未能愈合的小鼠的创面均结痂，七天后开始脱痂，并愈合。
结论：本发明公开了一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，工艺设计合理，操作简单，制备得到的冻干粉不仅能够应用于烧烫伤患者等创口具有快速修复皮肤创口的功效，并且对久治不愈的溃疡创面的依然具有修复治疗作用具有较高的实用性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (10)
1.一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述冻干粉通过含有过表达hEGF基因的生产用干细胞的培养上清液冻干制备而成。
2.根据权利要求1所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述培养上清液的细胞浓度≥1×107个/ml。
3.根据权利要求1所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述冻干粉中包含过表达的hEGF、人角质细胞生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子和纤维连接蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述冻干粉制备步骤如下：
1)间充质干细胞的制备；
2)将hEGF基因导入步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；
3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达hEGF的生产用干细胞；
4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，置于冻干机真空冷冻干燥，保存，即得成品。
5.根据权利要求4所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述冻干粉制备步骤如下：
1)间充质干细胞的制备：
2)将hEGF基因导入步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；
a)构建hEGF-pEGFP-N1真核表达质粒；
b)通过脂质体Lipofectamine2000分别包裹已构建好的hEGF-pEGFP-N1真核表达质粒，再转染至步骤1)获得的间充质干细胞中；
c)更换含800μg/mlG418的opti-MEM换液，继续培养；
d)48小时后倒置显微镜下观察，检测间充质干细胞中hEGF的表达，得到转染后的过表达干细胞；
3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达hEGF的生产用干细胞；
a)取步骤2)获得的过表达干细胞，0.25％胰蛋白酶进行常规消化，收集细胞悬液；
b)用血球计数板进行计数，并采用有限稀释法将细胞稀释为105个/ml，每孔接种100μl于96孔细胞培养板中，用含1600μg/mlG418选择培养基100μl/孔，进行选择培养；
c)培养7天后，再用0.25％胰蛋白酶进行消化，并扩增至24孔板；
d)进行扩增传代，并逐步减少G418用量至10μg/ml，
继续培养，直至扩增量达到所需数量，得到生产用干细胞；
e)常规收集，洗涤，加入干细胞冻存液，分装并作好标记，并采用程序降温法冻存生产用干细胞于-196℃液氮中；
4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，置于冻干机真空冷冻干燥，保存，即得成品。
6.根据权利要求4所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，具体操作步骤为：
a)将步骤3)获得的生产用干细胞扩增传代二十代，直至细胞数量≥1010；
b)换成新鲜的无血清干细胞培养基，继续培养生产用干细胞3天；
c)收集生产用干细胞培养上清液，混匀；
d)采用ELISA检测试剂盒测定培养上清液中hEGF的表达情况；
e)将收集到的培养上清液分装为含纤维连接蛋白10μg/支，冷冻干燥，即得成品。
7.根据权利要求4所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述脐带间充质干细胞的制备步骤如下：
a)无菌条件下取近胎儿端脐带20cm，两端各剪去2cm，先用含200U青链霉素的生理盐水漂洗脐带4-5次，至无血迹，再用无双抗的生理盐水漂洗，放含少许DMEM/F12培养基的培养皿中，剪成2-3cm的小段，将小段纵向剪开，剔除脐带内动、静脉血管，用组织镊将组织块撕成细条状，放入含少量DMEM/F12培养基的培养皿中，用眼科剪剪成1-2mm3的碎块，整个过程在冰浴中进行；
b)将剪碎的组织块蘸上少许血清，移入透气T25培养瓶中，每瓶20个，加入1.5ml含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h后换液，待有细胞贴壁后更换培养基，培养约8-12天，去除组织块；培养约20天，细胞长至80％融合，经胰酶消化收集细胞，得到间充质干细胞。
9.按权利要求1-8中任意一项所述的冻干粉在烧烫伤和溃疡皮肤创面的修复药物中的用途。
10.按权利要求1-8中任意一项所述的冻干粉在外伤创面修复及预防疤痕的药物中的用途。
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