CN113975297A

CN113975297A - 一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物及其制备方法

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Publication number: CN113975297A
Application number: CN202010730908.3A
Authority: CN
Inventors: 杜焕青; 沈继广; 刘云龙; 杨艳浩; 杜婷
Original assignee: Origen Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: Origen Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date: 2020-07-27
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2022-01-28

Abstract

本发明属于生物与新医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物，所述组合物中包括以下活性成分：玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液，所述干细胞培养上清液来源于人源脐带间充质干细胞。该组合物的制备方法，包括如下步骤：(1)将玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液分别按照质量百分含量为：1‑3％、2‑6％、0.1‑2％、2‑20％、20‑30％计算称量，其余用灭菌注射用水补足100％；(2)将上述组分充分混合，进行无菌灌装入2ml无菌无热源的管中。本发明的有益效果是：该产品见效时间短，可以治疗多种皮肤问题，有效率高，不易反复。

Description

一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物及其制备方法。

背景技术

激素脸，学名叫做激素依赖性皮炎，是长期不当的在面部使用含激素的护肤品或药物引起的。主要症状是在面部出现大片的潮红斑片，斑片边界明显，颜色呈粉红色到深红色，红斑表面可有丘疹、水疱，严重时可有脓疱和渗出，红斑处皮肤萎缩、变薄，可见明显的红血丝，会伴有明显的灼热和瘙痒感，严重者可有明显的疼痛感。这个病皮肤比较敏感，饮食辛辣刺激的食物、激动、受热或皮肤用不耐受的护肤品后皮肤会明显变红，不适感也会加重，夏季也会严重。外用糖皮质激素后症状会立刻好转，但是停用激素后会很快恢复原状，甚至比原先症状更严重。

长期面部长痘痘的现象叫做“痘痘肌”，多是由于机体内分泌激素紊乱刺激面部皮肤表面的毛囊分泌过多的皮脂，引发细菌繁殖并出现感染的现象，表现为局部皮肤充血、疙瘩***，严重会有疤痕形成。

目前针对激素脸和痘痘肌的治疗方式，痘痘肌的治疗方式按照功能来分有消炎，杀菌类，平衡油脂类以及收敛控油类。

间充质干细胞是一类具有自我复制与多向分化能力的一种多能干细胞，具有强大的组织修复能力和免疫调节能力，目前在多种难治性疾病如神经损伤、退行性疾病、自身免疫性疾病等方面获得不错的临床效果。间充质干细胞来源很广泛，从脐带、胎盘、骨髓、牙髓、脂肪等组织中均可分离获得间充质干细胞。

干细胞上清是通过培养脐带间充质干细胞，富集得到干细胞集落，经过体外专业处理，制成精华悬液，干细胞上清中含有大量的细胞活性因子、调控因子、抑炎因子等，可以减轻面部炎症，加速伤口的愈合，减少疤痕的形成。

市场上大多数治疗痘痘肌和激素脸的组合物个体针对性不强，治疗时间长，治疗效果不佳，治疗后容易反复。而干细胞分泌的因子可提供细胞生长和分化所需要的各种营养和物质信息，可快速激活人体的修护***，根据不同肌肤问题进行智能修护。因此，开发一种有效治疗皮肤问题的组合物是亟待解决的问题。

发明内容

针对面部滥用激素导致的激素脸与痘痘肌等面部问题，本发明提供一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物及其制备方法，该产品见效时间短，可以治疗多种皮肤问题，有效率高，不易反复。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物，其特征在于所述组合物中包括以下活性成分：玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液，所述干细胞培养上清液来源于人源脐带间充质干细胞。

所述组合物中玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量比为1-3：2-6：0.1-2：2-20：20-30。

所述组合物中玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量百分比为：1-3％：2-6％：0.1-2％：2-20％，20-30％，其余为灭菌注射用水。

所述干细胞培养上清液为人源脐带间充质干细胞培养2-6代时收集的上清液。

所述干细胞培养上清液含干细胞分泌的细胞因子，生长因子，趋化因子，抑炎因子中的至少一种。

一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液分别按照质量百分含量为：1-3％、2-6％、0.1-2％、2-20％、20-30％计算称量，其余用灭菌注射用水补足100％；(2)将上述组分充分混合，进行无菌灌装入2ml无菌无热源的管中。

所述干细胞培养上清液的制备过程为：

a：将脐带用75％酒精消毒、生理盐水冲洗后，剪成1-2cm的小段，用生理盐水排血，弃去废液；

b：将脐带小段剪成1-2mm³的脐带块，均匀接种于细胞培养瓶中，加入含10％胎牛血清的gibco培养基，放于5％CO₂、37℃培养箱内进行培养；

c：至上述需要传代的细胞的细胞融合度达到80％-90％时，进行传代培养；

d：收集第2代至第6代的培养上清，用滤膜过滤后存放在4度环境下备用。

所述传代培养过程为：在含有符合细胞融合度要求细胞的培养瓶中加入胰酶消化，直至有大片细胞脱离瓶壁，镜下观察细胞呈球状并已基本悬浮时，加入胎牛血清终止消化；加生理盐水将得到的细胞悬浮液置于离心管中离心，吸弃上清液；向离心管内加入含10％胎牛血清的gibco培养基，充分混匀后计数，根据计数结果调整细胞浓度为1.5×10⁶/ml；在培养瓶加入上述细胞悬液，补足含10％胎牛血清的gibco培养基，保证每个培养瓶培养体系为体积相同的完全培养液；置于5％CO₂、饱和湿度、37℃培养箱培养至细胞长满瓶底后再次传代；每2-3天传代一次，传至2-6代时收集细胞培养上清。

所述gibco培养基为DMEM/F12培养基。

所述第2-6代的细胞培养上清，要求符合间充质干细胞的国际标准CD73、CD90、CD105呈阳性，阳性率不低于95％；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，阳性率不高于2％。

一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物的使用方法，其特征在于使用滚针或微针将组合物导入皮肤，滚针或微针导入深度为0.5-1.0微米。

本发明的有益效果是：

(1)本发明中制备的治疗激素脸与痘痘肌的组合物，选取2-6代的细胞培养上清，组合物中的成分有利于保持干细胞培养上清中的因子的活性，缩短单独使用干细胞培养上清的见效时间，组合物中的玻尿酸成分有利于面部皮肤的保湿效果，本发明中的组合物使用一周，60-70％以上受试者即有改善，根据面部情况使用3-5次，80-90％以上受试者即有显著改善。

(2)本发明中含有的干细胞活性因子有利于充盈皮肤细胞，恢复皮肤弹性能力，逐渐减少皮肤细纹，皮肤暗斑变浅至消失。增强皮肤细胞抗衰老能力，增强皮肤营养及水分摄取能力，炎症性皮肤改善，皮肤微损伤的修复。

(3)本发明中治疗激素脸与痘痘肌的组合物使用方法为配合滚针或者微针使用，受试者使用前将面部清洁消毒，用专业工具将脓包去除，滚针深度0.5-1.0微米，有利于组合物中活性成分到达浅皮层，持续发挥作用。

附图说明

图1为间充质干细胞表面标志物数据图；

图2-6为组合物滚针导入后试验者效果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1制备干细胞培养上清液

通过脐带制备干细胞培养上清液，脐带取自产妇，对产妇的具体要求为：(1)妊娠36-42周，发育、营养正常；(2)无传染性疾病，需提供1管5mL母血，进行母血检测，EBV、HCMV、HIV、HBV、HCV、梅毒应为阴性；(3)无恶性肿瘤；(4)妊娠期内无严重合并症；(5)无遗传性疾病家族史。

本发明得到的脐带外观颜色均匀，表面光滑无透明胶质，无褶皱或水肿，有弹性。

按照无菌技术的管理规程清洁、消毒生物安全柜，准备实验所需的试剂及材料，瓶子的外表面用75％酒精由瓶盖向下擦拭后立即放入生物安全柜。

下面介绍干细胞培养上清液的制备方法。

步骤1：将脐带放入装有50ml 75％酒精的烧杯中，消毒20-30s，用100ml生理盐水冲洗3-5次。

步骤2：在平皿中加入20ml生理盐水，将上述用生理盐水冲洗后的脐带放入平皿中去除表面血污，然后用手术剪将脐带剪成1-2cm的小段，进一步排血，弃去废液。

步骤3：将脐带小段放入盛有50ml生理盐水的烧杯中，反复冲洗3-5次。

步骤4：用止血钳挤掉脐带小段内的水分，置于干燥无菌的玻璃烧杯中，用手术剪将其剪成约1-2mm³的小块。

步骤5：使用双头药匙将烧杯中的脐带块均匀接种于细胞培养瓶中，每个细胞培养瓶约接种脐带组织200-300块，加入4-15ml含10％胎牛血清的gibco培养基，放于5％CO₂、37℃培养箱内进行培养。

步骤6：取需要传代的细胞，在显微镜下观察细胞形态，确定细胞融合度是否达到80％-90％，将符合要求的细胞进行传代培养。

步骤7：弃培养瓶中原有培养上清，向培养瓶内缓缓加入20-30ml生理盐水清洗(注意不要将细胞吹打起来)，弃生理盐水。重复上述步骤一次。

步骤8：每个T175培养瓶加入2-5ml 0.25％胰酶，轻轻摇匀，使溶液铺满整个瓶底，静置消化2-5分钟，之后若仍有贴壁细胞，可轻轻拍打或左右摇晃帮助细胞消化，直至有大片细胞脱离瓶壁，镜下观察细胞呈球状并已基本悬浮即可，加入2-5ml胎牛血清终止消化。注意：加液和混匀操作要迅速，以保证各培养瓶消化过程同步进行，避免细胞消化过度。

步骤9：每个T175培养瓶加入10-20ml生理盐水适度吹打至细胞完全悬浮后将各培养瓶中的细胞悬液加入到50ml离心管中，再以10-20ml生理盐水依次冲洗培养瓶后加入到50ml离心管中。

步骤10：平衡后室温条件下，300G离心5-8分钟。

步骤11：离心结束，吸弃上清液。向离心管内加入含10％胎牛血清的gibco培养基，充分混匀后计数，根据计数结果调整细胞浓度为1.5×10⁶/ml。本发明选用的gibco培养基为DMEM/F12培养基，该培养基的组分、各组分含量及配置方法均为已知技术。

步骤12：将每个T175培养瓶加入2-5ml上述细胞悬液，补足含10％胎牛血清的gibco培养基，保证每个培养瓶培养体系为35ml完全培养基。

步骤13：置于5％CO₂，饱和湿度，37℃培养箱培养至细胞长满瓶底后再次传代。

步骤14：每2-3天传代一次，传至2-6代时收集细胞培养上清，以备后用，取4.5*10^6个细胞，1200rpm离心5min。弃上清，2ml 1XPBS重悬。取10支试管，标记为1～10管，分别依次加入Mouse IgG1-FITC、CD19-FITC、CD34-FITC、Mouse IgG1-PE、CD11b-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD45-PE、CD105-PE、HLA-DR-PE。抗体加入量均为5μL，分别加入间充质细胞悬液80μL，震荡混匀，室温避光孵育20min。

步骤15：每管加3ml 1X PBS洗涤，1200rpm离心5min。弃上清，200μL 1X PBS重悬，混匀后，使用BD FACSCalibur流式细胞仪上机检测。Mouse IgG1-FITC、Mouse IgG1-PE作为标准对照，得到的间充质干细胞表面标志物数据图如图1所示。将图1所得的结果列于表1中。

表1间充质干细胞表面标志物数据

表面标志	标准规定	检验结果	结果判定
				CD73	≧95％	100.00％	符合要求
CD90	≧95％	98.56％	符合要求
				CD105	≧95％	98.75％	符合要求
CD11b	≦2％	0.02％	符合要求
				CD19	≦2％	0.01％	符合要求
CD34	≦2％	0.10％	符合要求
				CD45	≦2％	0.07％	符合要求
HLA-DR	≦2％	0.14％	符合要求

从表1可以看出，测量结果符合间充质干细胞的标准规定：CD73、CD90、CD105呈阳性，阳性率不低于95％；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，阳性率不高于2％。

步骤16：收集第2代至第6代的培养上清，用0.22微米的滤膜进行过滤，去掉细胞碎片，存放在4度环境备用。

实施例2用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物的制备

在A级洁净度的环境下将玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液分别按照质量百分含量为：1-3％、2-6％、0.1-2％、2-20％、20-30％计算称量，灭菌注射用水补足100％；然后将上述组分充分混合后，进行无菌灌装入2ml无菌无热源的管中。

实施例3组合物的效果测试

随机选取20位激素脸与痘痘肌经现有手段难以治愈的患者，先将滚针进行75％酒精消毒(时间：≥20min)，清洁面部，使用碘伏给面部进行消毒，后用生理盐水擦拭干净。疼痛敏感者可使用麻药敷于面部(但麻药会造成过敏，会灼伤皮肤，影响皮肤代谢)，对面部痘痘处理后再进行组合物护理。

用滚针在脸部轻轻走一遍空针，再把组合物均匀涂在脸部(分区域涂抹，不要一次性涂抹)开始滚，滚的区域分为：额头、脸颊，下巴。滚针的走向是米字形，即横向，竖向和对角线。每个方向4-5次，力度中度或轻度，不要太用力，特别是敏感肌肤。滚完一遍之后用组合物涂于面部再滚一次，一共两次。使用医用冷敷面膜15分钟，可以同时用瓷娃美肌照光。根据个人的皮肤情况，每周治疗1次，使用3-5次。

参与者每天早晨素颜进行拍照，选取5位试验者在导入组合物前后进行对比，图2-6为组合物滚针导入后5位试验者的效果图，分别对应的试验者编号为1#-5#，观察组合物对激素脸与痘痘肌的治疗效果。将观察结果列于表2中。

表2 5位试验者导入组合物前后效果对比

本发明中的组合物使用1周后，60-70％以上受试者即有改善，根据面部情况使用3-5次，80-90％以上受试者即有显著改善。本发明解决了现有治疗手段难以治愈的激素脸与痘痘肌的问题，长期使用对痘印的淡化也有明显效果。

以上对本发明的实例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims

1.一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物，其特征在于所述组合物中包括以下活性成分：玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液，所述干细胞培养上清液来源于人源脐带间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物中玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量比为1-3：2-6：0.1-2：2-20：20-30。

3.根据专利要求2所述的组合物，其特征在于所述组合物中玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量百分比为：1-3％：2-6％：0.1-2％：2-20％，20-30％，其余为灭菌注射用水。

4.根据专利要求1所述的组合物，其特征在于所述干细胞培养上清液为人源脐带间充质干细胞培养2-6代时收集的上清液。

5.根据专利要求1所述的组合物，其特征在于所述干细胞培养上清液含有干细胞分泌的细胞因子，生长因子，趋化因子，抑炎因子中的至少一种。

6.一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将玻尿酸、甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液分别按照质量百分含量为：1-3％、2-6％、0.1-2％、2-20％、20-30％计算称量，其余用灭菌注射用水补足100％；(2)将上述组分充分混合，进行无菌灌装入2ml无菌无热源的管中。

7.根据专利要求6所述的制备方法，其特征在于所述干细胞培养上清液的制备过程为：

8.根据专利要求7所述的制备方法，其特征在于所述传代培养过程为：在含有符合细胞融合度要求的细胞培养瓶中加入0.25％浓度的胰酶消化，直至有大片细胞脱离瓶壁，镜下观察细胞呈球状并已基本悬浮时，加入与胰酶同体积的胎牛血清终止消化；加生理盐水将得到的细胞悬浮液置于离心管中离心，吸弃上清液；向离心管内加入含10％胎牛血清的gibco培养基，充分混匀后计数，根据计数结果调整细胞浓度为1.5×10⁶/ml；在培养瓶加入上述细胞悬液，补足含10％胎牛血清的gibco培养基，保证每个培养瓶培养体系为体积相同的完全培养液；置于5％CO₂、饱和湿度、37℃培养箱培养至细胞长满瓶底后再次传代；每2-3天传代一次，传至2-6代时收集细胞培养上清。

9.根据专利要求7所述的制备方法，其特征在于所述gibco培养基为DMEM/F12培养基；所述第2-6代的细胞培养上清，要求符合间充质干细胞的国际标准CD73、CD90、CD105呈阳性，阳性率不低于95％；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，阳性率不高于2％。

10.一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物的使用方法，其特征在于使用滚针或微针将组合物导入皮肤，滚针或微针导入深度为0.5-1.0微米。