CN109106727B - 稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液及制备方法和用途 - Google Patents

稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液及制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液及制备方法和用途，其方法为：(1)用完全培养基对分离得到的间充质干细胞进行培养至P3‑P5代：(2)取获得的同一代次的同种异体来源的4‑8株间充质干细胞分别复苏，取4‑8株等细胞数量进行混合,在完全培养基中培养，待融合度为60％‑90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养，收集上清，并得到培养后的细胞；上清过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。本发明培养液中未添加血清，且整个制备过程中未添加抗生素和激素类产品，从而保证了最终得到的细胞条件培养液的安全性，防止因异种蛋白过敏或抗生素以及激素过敏而引发的安全性问题。

Description

稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液及制备方法和 用途
技术领域
本发明涉及一种细胞条件培养液及制备方法，具体涉及一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液及制备方法和用途。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，源于早期的中胚层和外胚层，具有高度自我更新能力和多项分化潜能。目前，因间充质干细胞具有造血支持，促进干细胞植入，高度的分化能力和免疫调控等功能，越来越受到人们的广泛关注。间充质干细胞存在于全身的多组织中，可以在体外进行扩增培养在特定的诱导条件下，可以分化为成硬骨、软骨、脂肪、神经心肌、内皮等多种其他类型的细胞。在体外能进行连续培养，可以作为理想的种子细胞用于病变和衰老引起的组织器官损伤修复。
胎盘、脐带间充质干细胞主要来源有孕妇产后的脐带，胎盘等组织，所以其取材方便，无道德伦理问题的限制。胎盘、脐带间充质干细胞能够分泌多种因子，能维系干细胞的增殖，分化和存活。
目前，亟需一种利用间充质干细胞制备稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液。
本发明的第二个目的是提供一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的用途。
本发明的第四个目的是提供包含一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的组合物。
本发明的技术方案概述如下：
稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法，包括如下步骤：
(1)用完全培养基对分离得到的间充质干细胞进行培养至P3-P5代：
(2)取步骤(1)获得的同一代次的同种异体来源的4-8株间充质干细胞分别复苏，取4-8株等细胞数量进行混合,在完全培养基中培养，待融合度为60％-90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12-24小时，收集上清，并得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。
上述方法还包括如下步骤：
(1)将所述培养后的细胞换完全培养基进行培养15-24小时后，消化传代，待融合度为60％-90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12-24小时，收集上清，再得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液；
(2)重复步骤(1)1次。
完全培养基是由体积比9:1的DMEM/F12和血清组成。
间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、表皮间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或毛囊间充质干细胞。
上述方法制备的稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液。
上述稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液在制备治疗角膜炎药物、制备修复创伤药物或在制备化妆品中的应用。
一种含有稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的组合物，包括下述组分；稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液，丙三醇、丁二醇，透明质酸钠、维生素C，柠檬酸和人血白蛋白。
上述组合物，还可以包括下述组分：稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液50mL，丙三醇1-3mL，丁二醇1-3mL，透明质酸钠1-2.5g，维生素C 0.1-1.5g，柠檬酸0.1-2.5g，人血白蛋白0.5-2g，用去离子水补至100mL，溶解混匀后，-20℃保存。
本发明的优点：
1.本发明的一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液中未添加细胞培养常用到的血清，且整个制备过程中未添加抗生素和激素类产品，从而保证了最终得到的细胞条件培养液的安全性，防止因异种蛋白过敏或抗生素以及激素过敏而引发的安全性问题；
2.本发明的培养液在收集后在无菌环境行下经过了0.22μm的无菌混合纤维滤膜，从而保证最终收集到的培养液上清没有有害微生物残留以及细胞或大型碎片残留，保证了该培养液在实际应用中的安全性。
3.本发明中所得的一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液选取同种异体来源的细胞进行混合培养，会使得所得到培养液中的所分泌的细胞因子含量更加的稳定，混合后可以持续传代3-4代，分泌细胞因子保持稳定状态，易于质量控制。
4.本发明所的一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液可以作为医用药品滴眼液的原料，可以改善治疗眼部疾病，改善视疲劳，以及眼部手术的恢复。
5.本发明所一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液作为生物美容用的原料等，添加到面膜，面霜，爽肤水，精华液等化妆品产品中，可以制备成相应的产品，由于其含有丰富的活细胞分泌因子，可以加速皮肤的新陈代谢，具有抗氧化和促进皮肤的修复再生的功能。
附图说明
图1间充质干细胞形态。
图2不同株细胞P4-P8代所分泌得不同因子的分析结果A B C D(Y轴单位pg/mL)。
图3不同株细胞进行重复饥饿培养后HGF因子分泌结果(Y轴单位pg/mL)。
图4干细胞条件培养液对大鼠皮损的治疗作用。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明，其具体实施例应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
实施例1
稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法,包括如下步骤：
(1)将分离得到的人脐带间充质干细胞接种至完全培养基中(完全培养基是由体积比9:1的DMEM/F12和血清组成)中，37℃，5％CO2培养箱内培养，细胞融合度到80％-90％的时候，进行传代培养，用0.25％W/V胰蛋白酶对原代培养的细胞进行酶解消化，时间为2分钟，酶解完成后加入配置好的完全培养液，终止酶解并吹打细胞，再按1:6的比例进行传代培养，培养装置为75cm2无菌塑料培养瓶，取少量进行流式分析，进行细胞表型鉴定，细胞培养到P4代进行冻存；
选取五株细胞进行流式分析，结果如下，实验证明按以上分离得到的细胞具有明显的间充质干细胞的特征(图1)。
表1、间充质干细胞的表面标记表达量
抗体类别 CD73 CD90 CD105 CD34 CD45 CD11b HLA-DR
MSC1 97.38％ 99.87％ 98.47％ 0.64％ 0.31％ 0.31％ 0.45％
MSC2 98.23％ 99.56％ 99.01％ 0.58％ 0.47％ 0.37％ 0.52％
MSC3 98.99％ 99.12％ 99.05％ 0.63％ 0.51％ 0.49％ 0.57％
MSC4 99.01％ 99.65％ 98.99％ 0.55％ 0.29％ 0.52％ 0.40％
MSC5 99.03％ 99.05％ 99.01％ 0.68％ 0.62％ 0.60％ 0.67％
(2)取获得的P4代同种异体来源的5株人脐带间充质干细胞分别复苏，取5株等细胞数量进行混合,，使得5株细胞总数1.2×106个细胞接种到含10mL完全培养基的T75cm2无菌培养瓶中培养，待融合度为80％；去细胞培养基，用DPBS溶液对细胞清洗一次，去掉残留的血清等，换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养24小时，收集上清，并得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。
(3)用上面的培养后的细胞换完全培养基进行培养20小时后，消化传代(P5代)，待融合度为80％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养24小时，收集上清，再得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液；
(4)重复步骤(3)1次(P6代)。
通过实验证明，步骤(2)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液能稳定表达细胞因子；步骤(4)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液能稳定表达细胞因子。当重复步骤(3)的次数为2次及以上时，细胞因子表达不稳定。
实施例2
稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法,包括如下步骤：
(1)将分离得到的人胎盘间充质干细胞接种至完全培养基中(完全培养基是由体积比9:1的DMEM/F12和血清组成)中，37℃，5％CO2培养箱内培养，细胞融合度到80％-90％的时候，进行传代培养，用0.25％W/V胰蛋白酶对原代培养的细胞进行酶解消化，时间为2分钟，酶解完成后加入配置好的完全培养液，终止酶解并吹打细胞，再按1:6的比例进行传代培养，培养装置为75cm2无菌塑料培养瓶，细胞培养到P3代进行冻存；
(2)获得的P3代同种异体来源的4株胎盘间充质干细胞分别复苏，取4株等细胞数量进行混合,使得4株细胞总数1.0×106个细胞接种到10ml完全培养基的T75cm2无菌培养瓶中培养，待融合度为90％；去细胞培养基，用DPBS溶液对细胞清洗一次，去掉残留的血清等，换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12小时，收集上清，并得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。
(3)用上面的培养后的细胞换完全培养基进行培养15小时后，消化传代(P4代)，待融合度为90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12小时，收集上清，再得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液；
(4)重复步骤(3)1次(P5代)。
实验证明，步骤(2)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液能稳定表达细胞因子；
步骤(4)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液能稳定表达细胞因子。当重复步骤(3)的次数为2次及以上时，细胞因子表达不稳定。
实施例3
稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法,包括如下步骤：
(1)将分离得到的人牙髓间充质干细胞接种至完全培养基中(完全培养基是由体积比9:1的DMEM/F12和血清组成)中，37℃，5％CO2培养箱内培养，细胞融合度到80％-90％的时候，进行传代培养，用0.25％W/V胰蛋白酶对原代培养的细胞进行酶解消化，时间为2分钟，酶解完成后加入配置好的完全培养液，终止酶解并吹打细胞，再按1:6的比例进行传代培养，培养装置为75cm2无菌塑料培养瓶，细胞培养到P5代进行冻存；
(2)获得的P5代同种异体来源的8株人牙髓间充质干细胞分别复苏，取8株等细胞数量进行混合,，使得5株细胞总数1.5×106个细胞接种到10ml完全培养基的T75cm2无菌培养瓶中培养，待融合度为60％；去细胞培养基，用DPBS溶液对细胞清洗一次，去掉残留的血清等，换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养20小时，收集上清，并得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。
(3)用上面的培养后的细胞换完全培养基进行培养24小时后，消化传代(P6代)，待融合度为60％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养20小时，收集上清，再得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液；
(4)重复步骤(3)1次(P7代)。
实验证明，步骤(2)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液能稳定表达细胞因子；
步骤(4)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液能稳定表达细胞因子。当重复步骤(3)的次数为2次及以上时，细胞因子表达不稳定。
实施例4
实施例1获得的产品与单株细胞饥饿培养后不同代次细胞培养上清中因子的检测：
单株培养：取实施例1步骤(1)的5株P4代同种异体来源人脐带间充质干细胞进行分别复苏，以1.2×106个在含有10mL完全培养液的T75cm2无菌培养瓶中，分别进行培养。细胞融合度达到80％左右，去细胞培养基，用DPBS溶液对细胞清洗一次，去掉残留的血清等，换无血清无酚红的DMEM/F12培养基，饥饿培养24小时，收集上清(P4)。将细胞换细胞完全培养基培养24小时后，进行传代。连续饥饿培养4代(分别为P5-P8)，收集各个代次的饥饿培养上清进行因子检测。
混合培养：取实施例1步骤(2)-步骤(4)获得的(P4-P6)的饥饿上清，并将实施例1步骤(4)得到的细胞重复步骤(3)2次，获得饥饿培养的上清(P7-P8)。
分别收集不同组的P4-P8的饥饿培养上清，应用ELISA法对收集的不同细胞培养液进行各种因子含量的检测，实验选取主要四种典型的因子IL-6，IL-8，HGF,VEGF进行检测比较。相应的ELISA操作过程遵循其对应的ELISA试剂盒使用所明书。
对进行单株饥饿培养和混合饥饿培养的后的细胞培养上清培养基进行IL-6，IL-8,HGF,VEGF因子的检测，并对所得结果进行了对比分析结果如图2，对比实验结果，单独培养一株细胞随着代次的变化，所分泌的细胞因子的量高低不一，且存在个体差异；混合培养后持续的培养三代细胞分泌的因子的量比较稳定，后随着细胞生长速度的不同，会使得因子的分泌量有所变化。
表2、不同株细胞不同代次检测不同因子含量表(pg/mL)
Figure BDA0001801173430000051
注：表中数值表示平均106个细胞24小时的不同因子分泌量,单位(pg/mL)
实验证明，实施例2、实施例3制备的稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液，其上清中因子的检测结果与实施例1相似。
实施例5：相同代次混合与单株细胞多次饥饿培养后HGF因子检测：
(1)单株培养：取5株P5代细胞进行分别复苏，按照实施例4中的单株培养方法进行细胞上请收集，实验重复3次，收集上清进行HGF因子检测。
(2)混合培养：以上五株异体来源的P5代细胞复苏后，按照实施例1中的混合培养方法进行细胞上请收集。实验重复3次，收集上清进行HGF因子检测。
分别收集三次实验的不同组的P5代培养上清，应用ELISA法对收集的不同细胞培养液中HGF因子含量进行检测比较。相应的ELISA操作过程遵循其对应的ELISA试剂盒使用所明书。
对进行单株饥饿培养和混合饥饿培养的后的细胞培养上清培养基进行HGF因子的检测，并对所得结果进行了对比分析结果如图3，对比实验结果，单独培养一株细胞重复3次，因子的分泌量随细胞生长的差异高低不一，且存在异体差异，相同代次混合培养后因子的分泌量量较单独培养更加稳定。
表3、不同株细胞相同代次的HGF因子分泌量表(pg/mL)
细胞 MSC1 MSC2 MSC3 MSC4 MSC5 MSC MIX
实验一 2183.57 2358.00 2572.90 2423.57 2829.67 2360.83
实验二 1442.27 2045.27 1954.83 2820.90 2219.57 2373.50
实验三 1807.93 2615.00 2746.90 3147.23 2007.90 2435.23
实施例6：稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液对眼部疾病的家兔的治疗作用
一种含有间充质干细胞因子的滴眼液，包括实施例1步骤(2)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液250mL，添加医用透明质酸至10g/L,视黄酸10g/L，生理盐水补足体积到500mL，调节pH＝7.0-7.3，进行过滤除菌即得(简称干细胞因子滴眼液)。
实验以眼部疾病家兔(见表4)为模型，并以医用生理盐水和市面在售抗菌滴眼液作为对照进行试验。实验过程中所选病例模型均在相同实验条件下进行,试验选取动物雌雄家兔各半，每组病例分三组，每组至少入组3例，每只动物模型，每天给药四次，每次给药3滴/眼，每滴间隔5秒，记录实验效果，以后的实际应用中需考虑个体差异和疾病程度进行治疗。
选取眼部疾病的家兔动物模型进行具体的实验情况：
表4、眼疾家兔动物模型治疗情况表
病例 生理盐水 抗菌眼药水 干细胞因子滴眼液
眼部手术伤口 7-8天修复 5-7天修复 疗效显著，3-5天修复
角膜炎 疗效低 疗效低 疗效显著，3天恢复
眼球浑浊 6天无变化 疗效低，5-6天恢复 疗效显著，3-5天恢复
实验证明，实施例2、实施例3制备的稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液，对眼疾家兔动物治疗作用与实施例1相似。
实施例7
含有稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的组合物，包括下述组分：
实施例1步骤(2)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液50mL，丙三醇1.5mL，丁二醇1.5mL，透明质酸钠1.25g，维生素C 0.75g，柠檬酸1.25g，人血白蛋白1g，用去离子水补至100mL，溶解混匀后，-20℃保存。
实施例8
含有稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的组合物，包括下述组分：
实施例2步骤(2)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液50mL，丙三醇1mL，丁二醇3mL，透明质酸钠1g，维生素C 1.5g，柠檬酸0.1g，人血白蛋白2g，用去离子水补至100mL，溶解混匀后，-20℃保存。
实施例9
含有稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的组合物，包括下述组分：
实施例3步骤(2)获得的稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液50mL，丙三醇3mL，丁二醇1mL，透明质酸钠2.5g，维生素C 0.1，柠檬酸2.5g，人血白蛋白0.5g，用去离子水补至100mL，溶解混匀后，-20℃保存。
实施例10
含有稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的组合物对大鼠皮损的治疗作用
选取大鼠作为动物模型，建立大鼠皮肤缺损模型，每只大鼠两个创面，模型创面直径1cm,造模后随机分组，实验分三组：阳性对照组：重组牛成纤维细胞生长因子凝胶，将成纤维细胞生长因子凝胶均匀涂于创面，用量为100μL/CM2/天；实验组(实施例7的组合物)，用量为100μL/CM2/天；空白组：生理盐水，每组入组创面3个，建模后连续三天给药，每天给药一次，每天对伤口进行直径测量，比较大鼠创面的恢复情况。实验结果显示，实验组的治疗效果在给药第4天开始效果显著，与阳性实验组的结痂和愈合时间相当，且效果创面的愈合速度明显和结痂速度较空白组快(图4)。
实验证明，实施例8、实施例9制备的含有稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的组合物，对大鼠皮损的治疗作用与实施例7的组合物相似。
制得间充质干细胞药物或化妆品，可根据实际应用添加到相应的护肤品中,也可单独作为护肤品使用。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (5)

1.稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法，其特征是包括如下步骤：
（1）用完全培养基对分离得到的间充质干细胞进行培养至P4或P5代：
（2）取步骤（1）获得的同一代次的同种异体来源的4-8株间充质干细胞分别复苏，取4-8株等细胞数量进行混合,在完全培养基中培养，待融合度为60%-90%；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12-24小时，收集上清，并得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将所述培养后的细胞换完全培养基进行培养15-24小时后，消化传代，待融合度为60%-90%；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12-24小时，收集上清，再得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液；
（2）重复步骤（1）1次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述完全培养基是由体积比9:1的DMEM/F12和血清组成。
4.权利要求1-3之一的方法制备的稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液。
5.权利要求4的稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液在制备修复皮肤创伤药物中的应用。
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