CN113929525A

CN113929525A - 一种微生物炭基肥、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113929525A
Application number: CN202111255000.2A
Authority: CN
Inventors: 王永红; 闫志强; 他永全; 赵玥萱; 张璟; 陈光友; 冯俊涛; 马志卿
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2022-01-14

Abstract

本发明公开了一种微生物炭基肥、制备方法及其应用。以生物炭对解淀粉芽孢杆菌生长影响为指标，筛选到最优生物炭为小麦秸秆生物炭和水稻稻壳生物炭，并对其理化性质进行测定。进一步条件优化发现，两种生物炭对解淀粉芽孢杆菌B1408(CGMCCNo.15110)吸附的最佳粒径是180‑200目，最佳吸附时间是48h，最佳振荡速度是170rpm/min，最佳配比是菌悬液：生物炭＝20:1。然后，采用吸附和掺混两种工艺流程探索，制备得到小麦生物炭吸附B1408(WSBX)、小麦生物碳掺混(WSBC)、水稻生物炭吸附(RSBX)和水稻生物炭掺混(RSBC)四种解淀粉芽孢杆菌B1408微生物炭基肥。最终，发现四种微生物炭基肥在黄瓜促生及黄瓜枯萎病病害防治具有较好的效果，具有良好的开发应用前景。

Description

一种微生物炭基肥、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于肥料技术领域，具体涉及一种微生物炭基肥、制备方法及其应用。

背景技术

化肥、农药作为重要的农业生产资料在保障国家粮食安全方面发挥了重要作用，但其大量不合理使用引起的农产品质量安全、环境污染等问题日益严重，化肥、农药减施增效已成为促进农业高质量发展的一项国家战略。微生物农药(肥料)具有较好的环境相容性，在推进化肥、农药减施增效，促进植物健康方面具有独特的优势，其产品研发日益受到重视。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus sp.)B1408(CGMCC No.15110)是本课题组从健康黄瓜根际土壤中分离得到的一株具有防病、促生功能的生防菌，对小麦全蚀病和黄瓜枯萎病具有很好的防治作用，并且表现出良好的促生作用。

作为一种可持续且低成本的炭基材料，生物碳是由一系列可再生生物废弃物通过热化学处理所得到的。生物碳特性会根据原材料、热化学方法、过程和条件的变化而变化。丰富的微孔结构、芳香官能团以及表面积能够调节土壤物理特性，包括孔隙度、密度和颗粒度分布，从而改变氧气浓度、储水量及养分条件。生物炭独特的吸附能力能够通过富集养分和微生物来进行进行碳固定以及土壤健康和生产力。生物碳也被认为是新型有效载体或养分储存中高潜力的环境保护技术，并有助于环境清洁。研究报道生物炭富集土壤微生物，提高土壤矿化和生物氧化。同时，为细菌的代谢提供额外的场所，从而通过养分利用性的改变来影响微生物的活性。尽管生物炭可通过增强渗透性、保持水分和养分、提高肥力来有利于土壤健康，但是单独使用生物炭无法形成完整的肥料来为作物提供丰富的营养物质，更好的选择是生物碳作为载体与功能微生物菌株相结合，从而建立多重联系或交互作用来提高功能微生物的效率。

鉴于此，进行解淀粉芽孢杆菌B140的微生物炭基肥的研制，及其对黄瓜的促生作用以及黄瓜枯萎病防效的评价，旨在进一步优化解淀粉芽孢杆菌B1408菌株的防病、促生能力，以期能够解决目前防病促生菌株以及现有微生物药肥施用后微生物菌株定殖率低、活性差等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物炭基肥、制备方法及其应用，微生物炭基肥在黄瓜促生及黄瓜枯萎病病害防治具有较好的效果，具有良好的开发应用前景。

具体包括：

解淀粉芽孢杆菌B1408(Bacillus sp.)，保藏编号为CGMCC No.15110，保藏日期为：2017年12月21日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国、北京、朝阳区北辰西路1号院邮编:100101电话:64807355；解淀粉芽孢杆菌B1408用于制备微生物炭基肥或防治植物土传病害药物的应用。

一种微生物炭基肥，所述的微生物炭基肥包括生物炭及附着于生物炭上的微生物；所述的微生物为解淀粉芽孢杆菌B1408，保藏编号为CGMCC No.15110。

可选的，所述的生物炭呈碱性，C含量为65％～66％，灰分为70％～71％，比表面积为60～62m²/g。

可选的，所述的生物炭为小麦秸秆生物炭、玉米秸杆生物炭或水稻稻壳生物碳；

生物炭粒径为180～200目。

可选的，解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液或发酵液通过吸附、浸渍或掺混的方法将解淀粉芽孢杆菌B1408附着于所述的生物炭上；

吸附、浸渍或掺混的时间为48h，振荡速度为170rpm/min，菌悬液或发酵液V：生物炭W＝20:1；

菌悬液或发酵液的微生物细胞含量至少为10⁸CFU/mL。

可选的，所述的解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液的制备包括：

将活化的菌株接种LB培养基，于28℃，170r/min培养12h制得种子液；以2％的接种量接种于LB培养基，在28℃，170r/min培养48h；将收获的细胞重悬于无菌水，调节菌液浓度至10⁸CFU/mL制得菌悬液。

一种微生物炭基肥的制备方法，生物炭吸附、浸渍或掺混解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液或发酵液；

生物炭的粒径是180～200目；吸附、浸渍或掺混的时间是48h，振荡速度是170rpm/min，菌悬液或发酵液V：生物炭W＝20:1；

菌悬液或发酵液的微生物细胞含量至少为10⁸CFU/mL。

可选的，所述的解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液的制备包括：

一种防治植物土传病害的药物，所述的药物含有解淀粉芽孢杆菌B1408。

可选的，所述的药物还含有生物炭，解淀粉芽孢杆菌B1408附着于生物炭上；

解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液或发酵液通过吸附、浸渍或掺混的方法将解淀粉芽孢杆菌B1408附着于所述的生物炭上；

菌悬液或发酵液的微生物细胞含量至少为10⁸CFU/mL。

本发明以生物炭对解淀粉芽孢杆菌生长影响为指标，筛选到最优生物炭为小麦秸秆生物炭和水稻稻壳生物炭，并对其理化性质进行测定。进一步条件优化发现，两种生物炭对B1408吸附的最佳粒径是180-200，最佳吸附时间是48h，最佳振荡速度是170rpm/min，最佳配比是菌悬液：生物炭＝20:1。然后，采用吸附和掺混两种工艺流程探索，制备得到小麦生物炭吸附B1408(WSBX)、小麦生物碳掺混(WSBC)、水稻生物炭吸附(RSBX)和水稻生物炭掺混(RSBC)四种解淀粉芽孢杆菌B1408微生物炭基肥。最终，发现四种微生物炭基肥在黄瓜促生及黄瓜枯萎病病害防治具有较好的效果，具有良好的开发应用前景。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是本发明实施例2提供的三种生物炭中性处理及其对解淀粉芽孢杆菌B1408生长的影响；(A)自然生物炭；(B)经过中性处理的生物炭；(C)自然生物炭与中性处理生物炭48h后B1408的菌体量；

图2-6是本发明实施例3提供的不同生物炭类型、生物碳粒径、吸附时间、振荡速度以及生物碳使用量对解淀粉芽孢杆菌B1408吸附量的影响；原始菌悬液浓度：log10CFU/mL＝9.32；图3不同粒径生物炭对B1408的吸附量的影响，(A)小麦秸秆生物炭；(B)水稻秸秆生物炭(原始菌悬液浓度：log10CFU/mL＝9.85)；图4生物炭不同吸附时间对B1408吸附量的影响，(A)小麦秸秆生物炭；(B)B1408水稻秸秆生物炭(原始菌悬液浓度：log10CFU/mL＝10.27)；图5摇床转速对生物炭吸附B1408的影响，(A)小麦秸秆生物炭；(B)水稻秸秆生物炭(原始菌悬液浓度：log10CFU/mL＝9.81)；图6菌悬液和生物炭的配比对生物炭吸附B1408的影响，(A)小麦秸秆生物炭；(B)水稻秸秆生物炭(原始菌悬液浓度：log10CFU/mL＝10.47)；

图7，8是本发明实施例4提供的小麦、水稻两种生物炭扫描电镜和红外光谱图；(A)水稻秸秆生物炭；(B)小麦秸秆生物炭；

图9，10是本发明实施例5提供的吸附法和掺混法两种制备微生物生物炭基肥的制备工艺；

图11-14是本发明实施例6提供的四种微生物炭基肥表观、微观、缓释效果以及货架期等国标指标的评价；图11不同工艺炭基微生物肥料外观图，(A)掺混法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料(WSBC)；(B)掺混法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料(RSBC)；(C)吸附法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料(WSBX)；(D)吸附法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料(RSBX)；图12不同工艺炭基微生物肥料的扫描电镜图，(A)掺混法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料(WSBC)；(B)掺混法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料(RSBC)；(C)吸附法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料(WSBX)；(D)吸附法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料(RSBX)；图13炭基微生物肥料的缓释效果；图14炭基微生物肥料在不同储存条件下的有效活菌数，(A)4℃条件下炭基微生物肥料的有效活菌数；(B)常温条件下炭基微生物肥料的有效活菌数；

图15-17是本发明实施例7提供的使用四种微生物炭基肥后黄瓜枯萎病的病情指数统计结果以及防病促生盆栽结果；图15炭基微生物肥料对黄瓜幼苗枯萎病发病率的影响，CK,清水对照；FOC,黄瓜枯萎病菌；Car+FOC,多菌灵+黄瓜枯萎病菌；WSB+FOC,小麦秸秆生物炭+黄瓜枯萎病菌；WSBC+FOC，掺混法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料+黄瓜枯萎病菌；WSBX+FOC，吸附法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料+黄瓜枯萎病菌；RSB+FOC，水稻秸秆生物炭+黄瓜枯萎病菌；RSBC+FOC，掺混法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料+黄瓜枯萎病菌；RSBX+FOC，吸附法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料+黄瓜枯萎病菌；图16解淀粉芽孢杆菌微生物炭基肥对黄瓜植株接种枯萎病原菌后植株生长的影响，CK,清水对照；FOC,黄瓜枯萎病菌；Car+FOC,多菌灵+黄瓜枯萎病菌；WSB+FOC,小麦秸秆生物炭+黄瓜枯萎病菌；WSBC+FOC，掺混法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料+黄瓜枯萎病菌；WSBX+FOC，吸附法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料+黄瓜枯萎病菌；RSB+FOC，水稻秸秆生物炭+黄瓜枯萎病菌；RSBC+FOC，掺混法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料+黄瓜枯萎病菌；RSBX+FOC，吸附法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料+黄瓜枯萎病菌；图17解淀粉芽孢杆菌微生物炭基肥对黄瓜植株的促生作用，CK,清水对照；WSBX，吸附法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料；WSBC，掺混法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料；WSB，小麦秸秆生物炭；RSBX，吸附法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料；RSBC，掺混法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料；RSB，水稻秸秆生物炭。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的解淀粉芽孢杆菌B1408微生物炭基肥中解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液或发酵液或发酵产物也是本发明保护的范围。

四种解淀粉芽孢杆菌B1408微生物炭基肥中小麦秸秆生物炭和水稻稻壳生物碳吸附解淀粉芽孢杆菌B1408的最佳粒径是180-200，最佳吸附时间是48h，最佳振荡速度是170rpm/min，最佳配比是菌悬液：生物炭＝20:1，这些优化得到的最佳工艺参数也是本发明保护的范围。

四种解淀粉芽孢杆菌B1408微生物炭基肥中小麦秸秆生物炭和水稻稻壳生物炭呈碱性(pH＝11)、C含量约为65％、灰分约为70％、比表面积为61m²/g、吸附能力强等基本性质也是本发明保护的范围。

四种解淀粉芽孢杆菌B1408微生物炭基肥中所使用的吸附及掺混工艺流程及方法也是本发明保护的范围。

四种解淀粉芽孢杆菌B1408微生物炭基肥所表现出的明显的吸附效果；在0-60d期间释放解淀粉芽孢杆菌B1408较强缓释效果以及在室温及4℃储存180d后活菌数高达10⁷-10⁹的较长货架期等也是本发明保护的范围。

四种解淀粉芽孢杆菌B1408微生物炭基肥在黄瓜生长促进剂黄瓜枯萎病害防治中的应用也是本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。特别是生物炭的获得方法，均采用本领域常规方法获得。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中得到。

实施例1解淀粉芽孢杆菌B1408种子液及菌悬液的制备

将活化的菌株B1408接种LB培养基，于28℃，170r/min在恒温振荡器上培养12h制得种子液，然后以2％的接种量接于含100mL LB培养基中，在28℃，170r/min培养48h。然后，以8000r/min离心10min后收集沉淀细胞，将收获的细胞重悬于无菌水，调节菌液浓度至10⁸CFU/mL制得菌悬液。

实施例2三种生物炭中性处理及其对解淀粉芽孢杆菌B1408生长的影响

将3种生物质炭用0.1mol/L的HCl浸泡过夜，再用去离子水反复冲洗至pH呈中性，抽滤，烘干，分别制成中性的小麦秸秆生物炭、水稻秸秆生物炭、玉米秸杆生物炭，分别记做WSB(中性)、RSB(中性)、CSB(中性)。

称取自然pH的三种生物炭和经过中性处理的三种生物炭各0.1g，在121℃下湿热灭菌25min。

将100mL的LB培养基装入250mL的三角瓶中，在121℃下湿热灭菌25min，冷却后接种制备好的B1408种子液，接种量为培养基的2％。同时将灭菌的生物炭接入到培养基中，在28℃，170rpm/min培养60h。在0h、6h、24h、36h、48h、60h的不同时间点取样，利用稀释涂布平板法进行计数，以不加生物炭作为对照，每个处理重复三次。

由图1(A)可以看出解淀粉芽孢杆菌B1408的生长速率高于未添加生物炭的培养基。由图1(B)可知，B1408在添加3种生物炭和经过中性处理的生物炭的培养基中生长走势基本一致。在培养48h后，添加经过中性处理的生物炭与未经中性处理生物炭培养基中菌体数量都出现了下降，但添加生物炭的下降速度明显低于对照。生物炭对解淀粉芽孢杆菌的生长没有影响。且经过中性处理和未经过中性处理的生物炭对解淀粉芽孢杆菌B1408的最大生长量没有显著性差异如图1(C)。考虑到后续对B1408的吸附试验和制剂加工程序的简化，在吸附试验和肥料加工采用未中性处理的生物炭，即自然生物炭。

实施例3生物炭吸附解淀粉芽孢杆菌B1408的条件优化

(1)不同种类生物炭对B1408菌体吸附的影响

选择100-120目的小麦秸秆生物炭、水稻秸秆生物炭、玉米秸杆生物炭进行生物碳类型的筛选。

(2)生物炭的不同粒径对生物炭吸附的影响

在(1)中所得到的吸附能力最好的生物炭的基础上进行40-60目、100-120目、180-200目三种不同粒径范围的筛选。

(3)吸附时间对生物炭吸附的影响

在(1)中吸附能力最好、(2)中最佳吸附粒径的基础上，对生物炭进行6、12、24、48、60和72h不同吸附时间的筛选。

(4)振荡速度对生物炭吸附的影响

在(1)吸附能力最好、(2)中最佳粒径以及(3)中最佳时间的基础上，对生物碳进行80、110、140、170和200r/min不同震荡速度的筛选。

(5)生物炭量对生物炭吸附的影响

在以上四种最优条件的基础上，进一步对添加生物碳2.5、5、10和25g对菌体吸附的影响进行筛选。

在上述条件筛选中，(1)-(4)所用菌悬液体积均为100mL，所用生物碳的量为5g，(5)所用菌悬液体积为50mL。所有实验中所用容器为250mL的三角瓶，培养温度为28℃。所有实验中统一采用涂布计数法进行生物碳吸附菌体数量的测定，具体为：分别取1mL吸附后的菌悬液进行梯度稀释，吸取100μL的稀释液涂布到NA培养基的平板上，在28℃的生化培养箱中进行培育，24-48h后进行计数。每个处理重复三次。生物炭的吸附菌体数量＝菌悬液吸附前的菌体数-菌悬液吸附后的菌体数。

生物碳种类筛选结果表明(图2)，三种生物炭对B1408的吸附量均可达到10¹¹CFU/mL且无显著性差异，但小麦秸秆生物炭和水稻秸秆生物炭对B1408的吸附量大于玉米秸秆生物炭对B1408的吸附量，后续吸附实验将采用小麦秸秆生物炭和水稻秸秆生物炭作为吸附载体。

生物碳粒径范围筛选结果表明(图3)，吸附在小麦秸秆生物炭(图3A)和水稻秸秆生物炭(图3B)上的B1408数量随着颗粒尺寸的减小而增加。这可能是由于较小的颗粒增加了生物炭对细菌细胞的接触面积，从而进一步增加了生物炭B1408的吸附能力。后续的吸附试验中将选用180-200目的生物炭进行吸附试验。

生物碳吸附时间筛选结果表明(图4)，小麦秸秆生物炭(图4A)和水稻秸秆生物炭(图4B)对B1408的吸附量随着时间的变化出现上下的波动，均在36h出现吸附量的下降，但随后在48h吸附量出现最大值，48h后又出现吸附量的下降，而且趋于稳定。故选择48h作为两种生物炭的最佳吸附时间。

生物炭吸附所需振荡速度筛选结果表明(图5)，震荡速度从80rpm/min增加到200rpm/min会对两种生物炭的吸附量出现波动，小麦秸秆生物炭(图5A)从140rpm/min增加到200rpm/min使吸附量不断增加，这可能是因为在低速时(即80rpm/min)，生物炭和B1408混合不足，无法达到最佳吸附效果，而在高速时，B1408能有效地附着在生物炭上；水稻秸秆生物炭(图5B)在不同转速下对吸附量没有显著性差异，但在170rpm/min下的吸附量最大.故综合选择两种生物炭的最佳吸附转速为170rpm/min。

生物碳使用量的筛选结果表明(图6)，B1408菌悬液中加入2.5g生物炭时，每克生物炭对B1408的吸附量最高。这是由于加入少量生物炭后，生物炭在菌悬液中的分散效果更好。菌悬液中生物炭的吸附量随着生物炭用量的减少而增加，对小麦秸秆生物炭(图6A)和水稻秸秆生物炭(图6B)的每克吸附量都是一致的。各比值间吸收有显著性差异。所以以细菌悬浮液与生物炭(v/w)的比值为20:1，得到了生物炭吸附细菌的最佳条件。

实施例4生物炭理化性质的测定

(1)pH测定：3种生物炭各称取1.0g分别溶于20mL蒸馏水中，振荡10min过滤，使用pH计测定滤液的pH。

(2)元素分析：使用元素分析仪在炉温1150℃测定生物炭的C、H、N、S的含量，采用差减法计算O的含量。

(3)比表面积：生物炭的比表面积采用BET法用比表面积测定仪进行测定。将样品送至青岛斯坦德检测股份有限公司进行测定。

(4)灰分：将样品送至青岛斯坦德检测股份有限公司进行测定。使用马弗炉800℃敞口煅烧2h以计算灰分。

(5)表面形态：生物炭的表面形态采用扫描电镜进行测定。

(6)官能团结构：采用傅里叶红外光谱仪对生物炭的官能团结构进行测定。

生物碳的基本性质表征结果表明(表1)，两种生物炭均为碱性，两种生物炭的元素含量都是C＞O＞H＞N，小麦秸秆生物炭和水稻秸秆生物炭的C含量分别达到了65.43％和65.57％，小麦秸秆生物炭和水稻秸秆生物炭的芳香性与吸水性差距不大。小麦秸秆生物炭和水稻秸秆生物炭的灰分分别达到了70.8％和70.3％，灰分含量较高，表明其含有丰富的矿物质。小麦秸秆生物炭和水稻秸秆生物炭的比表面积分别为60.460m²/g和61.609m²/g，比表面积较大，表明两种生物炭具有很强的吸附能力。

表1生物炭基本性质表征

WSB表示小麦秸秆生物炭；RSB表示水稻秸秆生物

生物炭的表面形态结果表明(图7)，水稻秸秆生物炭(图7A)和小麦秸秆生物炭(图7B)中管状结构密集分布且排列整齐，并且侧面具有繁多的褶皱。生物炭的管状直径远远大于细菌的长度。所以，生物炭的管状结构和表面结构可以吸附解淀粉芽孢杆菌B1408菌体，为菌体的生长和繁殖提供空间。菌体可能聚集在生物炭管状结构和侧向褶皱中，有利于菌体释放到土壤环境中。菌体大多附着在生物炭的管状结构中，生物炭的管状结构和横向褶皱适合于菌体的吸附，因此水稻秸秆生物炭和小麦秸秆生物炭是PGPR在农业应用中的合适载体。

傅里叶红外光谱分析结果表明(图8)，小麦秸秆生物炭(图8A)和水稻秸秆生物炭(图8B)主要吸收峰的位置出现在3422、1619、1420.69、792.25^cm-1附近。其中3422.44^cm-1附近宽的吸收峰，是分子间氢键-OH的伸缩振动峰，这些羟基可能来源于有机物中的碳水化合物；1619.80^cm-1附近是芳香环中C＝C、C＝O的伸缩振动以及－COO－的反对称伸缩振动；1420.69^cm-1附近是-CH-面内弯曲震动，是烷烃或烯烃官能团，792.25^cm-1附近为C-H面外弯曲振动峰，使生物炭具有明显的芳香结构。两种生物炭中的碳大多以双键、芳香环的结构存在，结构比较稳定，其表面丰富的羟基、羧基等化学官能团赋予了生物炭强大的吸附性能，使其能够作为吸附材料在肥料产业和环境污染防治方面得到广泛应用。

实施例5解淀粉芽孢杆菌B1408炭基微生物肥料的制备工艺

基于操作可行性，本试验选择掺混法、吸附法2种方法进行炭基微生物肥料的研制，制备方法如下：

(1)吸附法

按实施例3实验结果筛选得到吸附性能最好的生物炭作为载体，以及最佳载体粒径，震荡速度，生物炭与菌悬液的比例和反应时间进行B1408吸附，方法同实施例3，吸附后进行抽滤，30℃低温干燥，制得成品，以小麦秸秆生物炭制得炭基微生物肥料标记为WSBX，以水稻秸秆生物炭制得的炭基微生物肥料标记为RSBX。吸附试验工艺流程图见图9。

(2)掺混法

将称取所需要的小麦秸秆生物炭和水稻秸秆生物炭装入大烧杯中，121℃高温高压湿热灭菌25min，冷却后，用去离子水湿润，揽拌，含水量达到“手握成团，触摸即散”，加入与生物炭等量的B1408菌悬液，使含菌量约为10¹¹CFU/g，充分搅拌混合后，30℃低温干燥，制得成品，以小麦秸秆生物炭制得炭基微生物肥料标记为WSBC，以水稻秸秆生物炭制得的炭基微生物肥料标记为RSBC。其工艺流程图如图10。

实施例6微生物炭基肥性质的测定

(1)表面结构分析

对四种微生物炭基肥进行表面结构的分析，可以直观看出不同工艺制备的生物炭对解淀粉芽孢杆菌B1408的吸附情况，本试验选择通过吸附法和掺混法加工的微生物炭基肥，采用扫描电子显微镜观察其表面结构，并记录图像。

(2)pH的测定

pH的测定采用复合电极法，称取1g的微生物炭基肥，以肥水质量比为1:20混合后，用pH计测定其pH值。

(3)微生物炭基肥货架期的测定

称取微生物炭基肥各30g，分三份放到自封袋中，分别置于室温和4℃条件下保存。在不同时间点(0、20、40、60、80、100、120、150d和180d)称取微生物炭基肥各0.1g，加入到0.9mL灭菌的蒸馏水充分混合确保所有菌体被分离出来，稀释涂布平板法进行计数。每个处理重复三次。

(4)微生物炭基肥的缓释效果

分别称取10g四种加工工艺的微生物炭基肥加到250mL三角瓶含有100mL的无菌水，然后将混合溶液在28℃、170rpm/min条件下振荡60d，在不同时期(0、10、20、30、40、50和60d)取溶液稀释涂布平板法进行计数。每个处理重复三次。

不同工艺制备的微生物炭基肥的外观图和扫描电镜图结果表明，吸附型微生物炭基肥与掺混型微生物炭基肥均为细粉末状(图11)图11中的A、B、C和D图分别表示((A)掺混法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料(WSBC)；(B)掺混法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料(RSBC)；(C)吸附法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料(WSBX)；(D)吸附法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料(RSBX))。由于肥料表面和孔隙吸附B1408菌体的原因，使得吸附型微生物炭基肥和掺混型微生物炭基肥的表面都出现斑点、凸起。掺混后生物炭的表面仍能清晰的看到生物炭的表面与孔隙，而吸附后的生物炭的表面和孔隙已经被菌体充分吸附，吸附型的微生物炭基肥具有更多的菌量(图12)图12中的A、B、C和D图分别表示((A)掺混法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料(WSBC)；(B)掺混法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料(RSBC)；(C)吸附法制备的小麦秸秆碳基微生物肥料(WSBX)；(D)吸附法制备的水稻秸秆碳基微生物肥料(RSBX))。微生物炭基肥的制备工艺不同，使生物炭吸附菌体的量存在很大差异。总体来说，吸附法制备的微生物炭基肥负载的菌体多于掺混法制备的微生物炭基肥。

不同工艺制备的微生物炭基肥的缓释结果表明(图13)，不同加工工艺制成的肥料的释放曲线不同，但总体释放趋势都是先增加后减少。释放试验开始后生物炭表面和孔隙附着的B1408菌体迅速进入无菌水，导致无菌水中菌体浓度在早期迅速增加。经掺混法制成的炭基肥WSBC、RSBC均在5d之前释放速率达到最大，5d之后菌体出现稳步下降趋势，可能是菌体的死亡速度大于菌体的释放速度。经吸附法制成的炭基肥WSBX和RSBX在前5d的释放趋势与WSBC、RSBC相似，但WSBX在5-10d出现明显的下降之后在10-20d出现了增加的趋势，而RSBX在20-30d出现了增加的趋势，这可能是因为前期生物炭表面的菌体开始释放，后期生物炭孔隙中的菌体开始释放，造成菌体浓度的增加。在60d后WSBX、WSBC、RSBX和RSBC释放到无菌水的菌体浓度还能分别达到5.00×10⁴、2.50×10³、5.00×10⁴和5.00×10³CFU/mL。所以，不同工艺加工的炭基微生物肥料都具有很好的缓释效果。

根据微生物肥料国家标准GB 20287-2006的规定，微生物肥料的保质期为6个月，所以本试验以180d为试验的终点。结果表明(图14)，不同储存条件下(A，4℃；B,常温)对碳基微生物肥料中的有效活菌数有较大的影响，在4℃条件下，四种微生物炭基肥中活菌数都出现下降趋势，在180d时，WSBX、WSBC、RSBX和RSBC的有效活菌数分别为1.20×10⁹、2.75×10⁸、6.00×10⁹、3.00×10⁷CFU/g，通过吸附方法制得的微生物炭基肥仍具有很高的活菌数，而RSBC的活菌数没有达到国家标准的大于等于2×10⁸CFU/g，WSBC活菌数达到了国家标准。在常温条件下，6个月后有效活菌数分别为7.00×10⁸、5.50×10⁸、2.50×10⁸、4.00×10⁸CFU/g，都达到了国家标准的有效活菌数。总之，在4℃和常温储存条件下除了RSBC没有达到国家标准的有效活菌数外，其他都达标了，但是总体而言4℃储存的有效活菌数都好于常温储存。

实施例7解淀粉芽孢杆菌B1408微生物炭基肥的防病促生效果评价

黄瓜枯萎病原菌FOC菌液的制备：将黄瓜枯萎病菌FOC接种到马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基中，在28℃，170rpm/min的摇床上培养7d，得到病原菌菌液，并用无菌水调节菌液菌体浓度为10⁸CFU/mL备用。

黄瓜种子(津研4号)用75％的酒精消毒30s，用无菌水清洗三次，再用1.5％的NaClO消毒5min，用无菌水清洗六次，晾干，放到湿润的纱布上在28℃恒温培养箱中黑暗催芽24h，然后将催芽后的种子播种到育苗盘中于西北农林科技大学陕西省生物源农药工程技术研究中心温室大棚培养。待子叶完全长出后挑选长势一致的幼苗移栽到含100g基质(10×10×9cm)的塑料花盆中，每盆一株。基质为经2mm过筛的土壤与营养土(1:1)混合土壤，待黄瓜长至俩片真叶时，进行黄瓜枯萎病的防病促生试验，设置处理：(1)CK，不做任何处理，只将20mL无菌蒸馏水灌根处理；(2)FOC，将20mL制备好的FOC菌悬液灌根处理；(3)FOC+WSBX；(4)FOC+WSBC；(5)FOC+RSBX；(6)FOC+RSBC；(7)FOC+WSB；(8)FOC+RSB；(9)FOC+Car，(3)-(6)处理为3％的各微生物炭基肥拌土处理，一周后将20mL制备好的FOC菌悬液灌根处理；(7)-(8)处理为3％的小麦秸秆生物炭和水稻秸秆生物炭拌土处理，一周后将20mL制备好的FOC菌悬液灌根处理；(9)为20mL药剂对照多菌灵灌根处理，一周后将20mL的FOC菌悬液灌根处理；同时进行微生物炭基肥的促生试验，(10)WSBX；(11)WSBC；(12)RSBX；(13)RSBC；(14)WSB；(15)RSB，(10)-(13)处理为3％的各微生物炭基肥拌土处理；(14)-(15)处理为3％的两种生物炭拌土处理，每个处理5个黄瓜植株，重复三次。FOC病原菌灌根处理后四周后进行病情指数、株高、茎粗、鲜重和干重的测量。

微生物炭基肥防病结果表明(图15)，生物炭、解淀粉芽孢杆菌生物炭基肥的病情指数显著低于阳性对照(只接种FOC)和多菌灵药剂对照，说明生物炭和解淀粉芽孢杆菌生物炭基肥对黄瓜枯萎病具有较好的防效，防效由强到弱依次是：

WSBX>RSB>RSBX>WSBC>RSBC>WSB。

解淀粉芽孢杆菌微生物炭基肥对黄瓜植株接种枯萎病原菌后植株生长影响的结果表明(表2，图16)，接种病原菌FOC著抑制了黄瓜的生长，而WSBX和RSBX两种微生物炭基肥能明显缓解黄瓜枯萎病原菌对黄瓜生长的抑制作用，效果与药剂对照多菌灵相比有显著优势。而WSBC和RSBC两种微生物炭基肥对FOC病原菌抑制黄瓜生长的缓解作用，但缓解效果不如WSBX与RSBX显著。

表2微生物炭基肥对黄瓜枯萎病原菌抑制黄瓜生长的缓解作用

CK：清水对照；FOC：黄瓜枯萎病原菌灌根处理；FOC+WSBX、FOC+WSBC、FOC+RSBX、FOC+RSBC为3％的各炭基微生物肥料拌土处理，一周后将20mL制备好的FOC菌悬液灌根处理；FOC+WSB、FOC+RSB为3％的两种生物炭拌土处理，一周后将20mL制备好的FOC菌悬液灌根处理；FOC+Car：20mL药剂对照多菌灵灌根处理，一周后将20mL FOC菌悬液灌根处理，多菌灵浓度为500mg/L。数据为平均值±标准值，试验重复3次。同一列不同的字母代表显著性差异(p<0.05)。

解淀粉芽孢杆菌微生物炭基肥对黄瓜植株的促生作用结果表明(表3，图17)，在未添加黄瓜枯萎病原菌FOC的情况下，小麦秸秆生物炭和水稻秸秆生物炭经过掺混法和吸附法制备的炭基微生物肥料WSBX、WSBC、RSBX、RSBC对黄瓜有不同程度的促生作用。与CK相比，RSBX炭基肥料使得黄瓜株高、茎粗、鲜重和干重分别增加了14.10％、9.36％、7.46％和9.62％，WSBX炭基肥料使得黄瓜株高、茎粗、鲜重和干重分别增加了5.77％、13.95％、8.87％和11.65％，但WSBC、RSBC炭基肥料对黄瓜的株高、鲜重和干重无明显的促生效果，对黄瓜茎粗有一定促进作用。除此之外，水稻秸秆生物炭对黄瓜植株也起到了较为明显的促生效果。

表3微生物炭基肥对黄瓜植株的促生效果

CK：清水对照；WSBX、WSBC、RSBX、RSBC为3％的各微生物炭基肥拌土处理；WSB、RSB为3％的两种生物炭拌土处理。数据为平均值±标准值，试验重复3次。同一列不同的字母代表显著性差异(p<0.05)。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims

1.解淀粉芽孢杆菌B1408(Bacillus sp.)，保藏编号为CGMCC No.15110，解淀粉芽孢杆菌B1408用于制备微生物炭基肥或防治植物土传病害药物的应用。

2.一种微生物炭基肥，其特征在于，所述的微生物炭基肥包括生物炭及附着于生物炭上的微生物；

所述的微生物为解淀粉芽孢杆菌B1408，保藏编号为CGMCC No.15110。

3.根据权利要求2所述的微生物炭基肥，其特征在于，所述的生物炭呈碱性，C含量为65％～66％，灰分为70％～71％，比表面积为60～62m²/g。

4.根据权利要求1或2所述的微生物炭基肥，其特征在于，所述的生物炭为小麦秸秆生物炭、玉米秸杆生物炭或水稻稻壳生物碳；

生物炭粒径为180～200目。

5.根据权利要求1或2所述的微生物炭基肥，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液或发酵液通过吸附、浸渍或掺混的方法将解淀粉芽孢杆菌B1408附着于所述的生物炭上；

菌悬液或发酵液的微生物细胞含量至少为10⁸CFU/mL。

6.根据权利要求1或2所述的微生物炭基肥，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液的制备包括：

7.一种微生物炭基肥的制备方法，其特征在于，生物炭吸附、浸渍或掺混解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液或发酵液；

菌悬液或发酵液的微生物细胞含量至少为10⁸CFU/mL。

8.根据权利要求7所述的微生物炭基肥的制备方法，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌B1408的菌悬液的制备包括：

9.一种防治植物土传病害的药物，其特征在于，所述的药物含有解淀粉芽孢杆菌B1408。

10.根据权利要求9所述的防治植物土传病害的药物，其特征在于，所述的药物还含有生物炭，解淀粉芽孢杆菌B1408附着于生物炭上；

菌悬液或发酵液的微生物细胞含量至少为10⁸CFU/mL。