CN109486707A - 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用，所述枯草芽孢杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16569；保藏时间为：2018年10月10日。本发明实施例还提供了一种含有所述枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。本发明实施例提供的一种枯草芽孢杆菌菌株能够对炭黑曲霉、黑曲霉、产黄青霉进行有效抑制，而炭黑曲霉、黑曲霉、产黄青霉是葡萄易生的霉菌，因此含有枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液能够有效延长葡萄贮存期，具有高效、安全和环保等特点，有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明实施例涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，具有防止生物氧化，颉抗致病微生物、改善体内外生态环境、增强动物免疫功能、产生多种消化酶和营养物质的作用。枯草芽孢杆菌生长过程中可产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显抑制作用的活性物质。肠道当中的枯草芽孢杆菌因其可以快速消耗游离的氧，从而可以降低肠道氧，使有益的厌氧菌较好的存活而抑制部分致病菌。有研究证明在鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌能使鸡盲肠中沙门氏菌的平均水平显著减少58％，这不仅仅降低了生命体感染的风险，而且还有助于改善食品安全。因此具有高抗真菌活性的枯草芽孢杆菌无论在帮助改善人体健康状态还是在保障食品安全方面都有着重要作用。枯草芽孢杆菌，作为一种***，长期以来一直被用来发酵大豆食品、广泛用于工业酶和化学品的生产。
但是现有的枯草芽孢杆菌罕有发现在抑制炭黑曲霉、黑曲霉、产黄青霉中取得较好效果的菌株。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用，以解决现有技术中罕有发现在抑制炭黑曲霉、黑曲霉、产黄青霉中取得较好效果的菌株的问题。
为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：
在本发明的实施方式的第一方面中，提供了一种枯草芽孢杆菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16569；保藏时间为：2018年10月10日。
在本发明的实施方式的第二方面中，提供了一种含有所述枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
在本发明的实施方式的第三方面中，提供了一种所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，包括：
菌种种子液制备：将所述枯草芽孢杆菌活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于培养基上，之后进行封胶并放入培养箱中培养，得到活化的菌株，将活化的菌株转入培养基中培养，即制得所述的菌种种子液；
发酵液的制备：将所述的菌种种子液接种在装有高密度培养基的容器中培养，制得菌悬液，将所述菌悬液离心后收集上清液，上清液过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
在本发明的一个实施例中，所述菌种种子液的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于NA培养基上，之后进行封胶并倒置于温度为33℃培养箱重培养24h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在温度为33～50℃，转速为180～300r/min的条件下培养24～50h，制得所述的菌种种子液；
在本发明的一个实施例中，所述的菌种种子液于温度为-1～4℃的环境下保存备用。
在本发明的一个实施例中，所述NA平板培养基或NA培养基的原料包括：蒸馏水、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂；其中，每1000mL蒸馏水对应3.0g牛肉浸膏、7.0g蛋白胨、10.0g葡萄糖、15.0g琼脂；
和/或，所述LB培养基的原料包括：蒸馏水、氯化钠、酵母提取物和胰蛋白胨；其中，每1000mL蒸馏水对应10.0g氯化钠、5.0g酵母提取物、10.0g胰蛋白胨。
在本发明的一个实施例中，所述发酵液的制备方法包括：将所述的菌种种子液以接种量为3～6％的体积比接种于装有高密度培养基的三角瓶中，在温度为33～50℃、转速为180～300r/min的条件下培养24～48h，获得菌悬液，所述菌悬液在转速为10000r/min的离心机中离心后取上清液，上清液用微孔滤膜过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
在本发明的一个实施例中，所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液于温度为4℃的环境下保存备用。
在本发明的一个实施例中，所述高密度培养基的原料包括：蒸馏水、黄豆粉、玉米粉、酵母膏、NaCl、CaCl2和MnSO4·H2O；其中，每1000mL蒸馏水对应20.03g黄豆粉、24.41g玉米粉、12.69g酵母膏、3g NaCl、2g CaCl2、2g MnSO4·H2O。
在本发明的实施方式的第四方面中，提供了上述枯草芽孢杆菌高密度发酵液于抑制炭黑曲霉、黑曲霉、产黄青霉中的应用。
在本发明的实施方式的第四方面中，提供了一种葡萄保鲜剂，其包含所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
根据本发明的实施方式，具有如下优点：
1、本发明实施例提供的一种枯草芽孢杆菌菌株能够对炭黑曲霉、黑曲霉、产黄青霉进行有效抑制，而炭黑曲霉、黑曲霉、产黄青霉是葡萄易生的霉菌，因此含有枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液能够有效延长葡萄贮存期，具有高效、安全和环保等特点，有广阔的应用前景。
2、本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌菌株能够有效降低葡萄表面微生物数量，果粒硬度高，葡萄梗的颜色更为鲜绿，葡萄营养物质流失率小，外观新鲜度和口感得到很好的保持，整体葡萄的保鲜期要延长7～10天。
本申请提供的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.16569；保藏时间为：2018年10月10日。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法包括如下步骤：
1)菌种种子液制备：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取单菌落划线于NA培养基上，封胶倒置于33℃培养箱培养24h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在41.5℃，240r/min的条件下，培养37h，制得的菌种种子液于1.5℃保存备用；
2)高密度发酵液的制备：将步骤1)备好的菌种种子液，以4.5％(V/V)的接种量接种于高密度培养基的三角瓶中，在温度为41.5℃、240r/min条件下，培养36h，枯草芽孢杆菌CGMCC NO.16569活菌数达到3.27×1011CFU/mL。获得菌悬液，将菌悬液经10000r/min离心后取上清液，用微孔滤膜过滤除菌，得到高密度发酵液于4℃保存备用。
实施例2
本实施例提供了一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法包括如下步骤：
1)菌种种子液制备：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取单菌落划线于NA培养基上，封胶倒置于33℃培养箱培养24h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在33℃，180r/min的条件下，培养24h，制得的菌种种子液于-1℃保存备用；
2)高密度发酵液的制备：将步骤1)备好的菌种种子液，以3％(V/V)的接种量接种于高密度培养基的三角瓶中，在温度为33℃、180r/min条件下，培养24h，枯草芽孢杆菌CGMCC NO.16569活菌数达到3.41×1011CFU/mL。获得菌悬液，将菌悬液经10000r/min离心后取上清液，用微孔滤膜过滤除菌，得到高密度发酵液于4℃保存备用。
实施例3
本实施例提供了一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法包括如下步骤：
1)菌种种子液制备：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取单菌落划线于NA培养基上，封胶倒置于33℃培养箱培养24h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在50℃，300r/min的条件下，培养50h，制得的菌种种子液于4℃保存备用；
2)高密度发酵液的制备：将步骤1)备好的菌种种子液，以6％(V/V)的接种量接种于高密度培养基的三角瓶中，在温度为50℃、300r/min条件下，培养48h，枯草芽孢杆菌CGMCC NO.16569活菌数达到3.60×1011CFU/mL。获得菌悬液，将菌悬液经10000r/min离心后取上清液，用微孔滤膜过滤除菌，得到高密度发酵液于4℃保存备用。
实施例4
在采取实施例1—3中任一技术方案的情况下，NA平板培养基或NA培养基的组成为：每1000mL蒸馏水对应3.0g牛肉浸膏、7.0g蛋白胨、10.0g葡萄糖、15.0g琼脂；LB培养基的组成为：每1000mL蒸馏水对应10.0g氯化钠、5.0g酵母提取物、10.0g胰蛋白胨；高密度培养基的组成为：每1000mL蒸馏水、20.03g黄豆粉，24.41g玉米粉，12.69g酵母膏，3g NaCl，2gCaCl2，2g MnSO4·H2O。
应用例1枯草芽孢杆菌对炭黑曲霉、黑曲霉和产黄青霉的抗菌作用
为了进一步说明枯草芽孢杆菌编号对真菌的抗性作用，本发明研究了该菌种对常存于葡萄表面的炭黑曲霉、黑曲霉和产黄青霉的抗菌作用并做了以下检验，方法如下：
首先活化菌株并制备三种霉菌的菌悬液，将炭黑曲霉、黑曲霉和产黄青霉等连续两次传代接种于PDA培养基平板，将炭黑曲霉、黑曲霉和产黄青霉菌培养物分别在PDA和czapek培养基上于25℃生长5天。挑取一环直径≥2mm的菌落接入5ml无菌生理盐水中，用接种环将其打碎并震荡5min，使其均匀分布于无菌生理盐水中形成菌悬液。移取少许菌悬液于血细胞计数板上，在显微镜下观察计数，调整浓度控制在1～5×106CFU/mL。
将制备好的三种孢子悬浮液(100μL)涂布在PDA培养基上。使用牛津杯将200μL的枯草芽孢杆菌液体培养物的高密度上清液和无菌蒸馏水分别滴加到相同的分别含有炭黑曲霉、黑曲霉和产黄青霉菌的PDA培养基上，并在25℃下孵育。使用交叉条纹法在5天后测量抑制区的直径。
如表1实验结果表明，培养液能够有效的抑制真菌生长。炭黑曲霉的抑菌圈为24.3mm，黑曲霉的抑菌圈为20.3mm，产黄青霉的抑菌圈为27.5mm。
表1.高密度发酵液对微生物的抑制作用
应用例2枯草芽孢杆菌在葡萄保鲜剂的作用
本实施例所涉及的菌种在培养过程中产生的培养物可以应用于涂膜保鲜葡萄等浆果，具体方法如下：
将颜色和大小均匀、无损伤的葡萄串浸入枯草芽孢杆菌的高密度发酵液中1分钟，在无菌气流下表面干燥，放入将纸板箱中，之后置于冰箱中保存即可，最佳保存温度为-1至0℃。
为了检测该菌种的培养物用于葡萄等食品上是否会对其造成营养品质与感官品质上的不良影响，本发明进行了对经过高密度发酵液处理的葡萄的营养与感官评价。
将使用该菌种处理的葡萄做实验组，没有经过处理的葡萄作为对照组。经实验检验，实验组葡萄失重率、腐烂率和落粒率明显低于对照组。
葡萄硬度与含水量有关，这会影响组织的膨胀压力和脆度。在对照和处理的样品中，葡萄硬度随着储存时间的增加而显着降低。水分损失增加了果胶酶、果胶酯酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性，导致果胶和多聚半乳糖醛酸降解，导致果实软化。从第5天到第30天，高密度发酵液处理过的葡萄比对照葡萄硬度更强。
可滴定酸含量是果蔬品质重要指标，实验证明，实验组葡萄与对照组葡萄没有显著性差异。说明，使用该菌种处理不会影响到葡萄的可滴定酸含量。
维生素C含量是果蔬营养价值的重要指标，也是果蔬贮藏效果评价的关键指标之一。实验证明，实验组与对照组一样，前15天呈现上升的趋势，而后呈现下降的趋势，且Vc含量也在同一水平上。这说明，该菌种高密度发酵液的使用会保持葡萄维生素C含量。
呼吸强度与果实的贮藏关系密不可分，呼吸强度的大小变化可以判断果蔬营养物质的消耗以及果蔬的衰老状态。通过抑制果蔬呼吸速率，可以延缓果蔬的衰老。对照组的呼吸率在储存的第一天为74.3mg/kg·h，但随着储存时间的增加而下降，从第十天的54.0mg/kg·h降至第三十天的31.0mg/kg·h。而实验组第十天与第三十天的呼吸频率分别为46.7mg/kg·h和21.3mg/kg·h。这些结果表明该菌种的高密度发酵液处理有效的降低了呼吸频率，能够有效的防止葡萄的失重与衰老，保持葡萄的品质。
该菌种应用于葡萄的保鲜中，一个月可以减少葡萄因腐烂而损失量的50％。以每亩种植300株，每株5串，每串两斤为标准，每亩产量3000斤左右，成本约1500元。以每斤15元计算，每个月每亩能够为农民减少损失11250元。以7月到10月4个月为收获季节，一年减少损失45000元。
综上，本申请提供的包含所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的葡萄保鲜剂能够有效对葡萄进行保鲜，并具有巨大的经济效益。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16569；保藏时间为：2018年10月10日。
2.一种含有如权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
3.一种权利要求2所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，包括：
菌种种子液制备：将所述枯草芽孢杆菌活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于培养基上，之后进行封胶并放入培养箱中培养，得到活化的菌株，将活化的菌株转入培养基中培养，即制得所述的菌种种子液；
发酵液的制备：将所述的菌种种子液接种在装有高密度培养基的容器中培养，制得菌悬液，将所述菌悬液离心后收集上清液，上清液过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
4.根据权利要求3所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，所述菌种种子液的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于NA培养基上，之后进行封胶并倒置于温度为33℃培养箱重培养24h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在温度为33～50℃，转速为180～300r/min的条件下培养24～50h，制得所述的菌种种子液；所述的菌种种子液于温度为-1～4℃的环境下保存备用。
5.根据权利要求4所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，所述NA平板培养基或NA培养基的原料包括：蒸馏水、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂；其中，每1000mL蒸馏水对应3.0g牛肉浸膏、7.0g蛋白胨、10.0g葡萄糖、15.0g琼脂；
和/或，所述LB培养基的原料包括：蒸馏水、氯化钠、酵母提取物和胰蛋白胨；其中，每1000mL蒸馏水对应10.0g氯化钠、5.0g酵母提取物、10.0g胰蛋白胨。
6.根据权利要求3所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，所述发酵液的制备方法包括：将所述的菌种种子液以接种量为3～6％的体积比接种于装有高密度培养基的三角瓶中，在温度为33～50℃、转速为180～300r/min的条件下培养24～48h，获得菌悬液，所述菌悬液在转速为10000r/min的离心机中离心后取上清液，上清液用微孔滤膜过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
7.根据权利要求6所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液于温度为4℃的环境下保存备用。
8.根据权利要求6所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，所述高密度培养基的原料包括：蒸馏水、黄豆粉、玉米粉、酵母膏、NaCl、CaCl2和MnSO4·H2O；其中，每1000mL蒸馏水对应20.03g黄豆粉、24.41g玉米粉、12.69g酵母膏、3g NaCl、2g CaCl2、2gMnSO4·H2O。
9.一种权利要求2所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液在抑制炭黑曲霉、黑曲霉、产黄青霉中的应用。
10.一种葡萄保鲜剂，其特征在于：包含权利要求2所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
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| CN109486707B (zh) | 2021-11-02 |
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