CN105586300B - 路德维希肠杆菌bg10-1及其在黄曲霉菌生物防治中的应用 - Google Patents

路德维希肠杆菌bg10-1及其在黄曲霉菌生物防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及路德维希肠杆菌BG10‑1及其在黄曲霉菌生物防治中的应用。路德维希肠杆菌BG10‑1于2016年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M 2016014，分类命名：Enterobacter Ludwiggi BG10‑1。路德维希肠杆菌BG10‑1是从广西贺州八步镇花生荚果中分离获得。经室内对峙拮抗实验、活体抑菌解毒实验和田间防治试验发现，该菌株对黄曲霉菌抑菌能力较强，容易培养，无污染，对环境安全。施用本微生物菌肥能有效防治黄曲霉菌对花生的污染。

Description

路德维希肠杆菌BG10-1及其在黄曲霉菌生物防治中的应用
技术领域
本发明涉及一株路德维希肠杆菌BG10-1及其在黄曲霉菌生物防治中的应用。
背景技术
由曲霉属真菌(特别是黄曲霉)引起的毒素污染统称曲霉菌毒素污染，寄主范围广。曲霉特别是黄曲霉给花生、玉米、水稻及大豆等作物的安全生产带来严重危害，每年导致的经济损失高达数百亿美元。曲霉属真菌特别是黄曲霉菌能产生毒性极强的真菌毒素。黄曲霉毒素是广泛污染农产品的一类强致癌、剧毒性真菌毒素，包括B、G和M族，其中B1最普遍且毒性最强。人或动物食用受毒素污染的食品或饲料后会导致机体病变甚至死亡，严重威胁消费者健康与生命安全，制约农业产业发展与国际贸易。因此，加强我国花生、玉米及水稻等农产品中黄曲霉及毒素污染的防控刻不容缓。
目前，在对黄曲霉菌的防治中，化学防治占据重要的地位。化学防治不但成本高，且易污染环境，在防控病原菌的同时病原菌也易对化学药剂产生耐药性甚至抗药性。因此，加强黄曲霉菌生物防控的研究对我国农业产业及经济效益具有重要的意义。
发明内容
本发明的发明目的之一是针对花生中黄曲霉菌污染的问题及现有技术的不足，提供一株对黄曲霉菌有较好防效的路德维希肠杆菌菌株。
本发明的另一发明目的是提供由该菌株制备的微生物有机肥制剂、制备方法及其在黄曲霉菌生物防治中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
提供路德维希肠杆菌BG10-1，已于2016年1月7日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M 2016014，分类命名：EnterobacterLudwigii BG10-1。路德维希肠杆菌BG10-1是从广西贺州八步镇花生荚果中分离获得。经室内对峙拮抗实验、活体抑菌解毒实验和田间防治试验发现，该菌株对黄曲霉菌抑菌能力较强，容易培养，无污染，对环境安全。
路德维希肠杆菌BG10-1菌株的分离及筛选方法如下：
选取罹病花生田中健康花生植株，连同花生植株及土壤一同带回实验室分离。超净工作台上将花生植株上部长有叶片的茎秆剪掉，轻轻抖掉荚果上附着且结合程度低的土壤，将健康荚果及其上附着牢固的土壤一起放入无菌水中，震荡30分钟，获得土壤悬浮液。将荚果从上述土壤悬浮液中无菌操作取出，用吸水纸吸干后用镊子夹至无菌天平上称重。将称重后 的花生荚果用自来水及牙刷洗净表面土壤至眼睛看不见为止，然后在无菌三角瓶中用3％次氯酸钠溶液浸泡10分钟，最后无菌水冲洗5次，沥干水分。用镊子夹出花生荚果，无菌操作掰开荚果，将果壳用无菌剪刀平均分成5等份，分别放置在牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基平板中，于28℃恒温培养，每天观察菌落生长状况，并及时挑取特征差异明显、分离良好的单菌落，进一步纯化获得纯菌株，在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上保藏备用。进行室内对峙拮抗实验、活体抑菌解毒实验和田间防治试验，从中筛选获得路德维希肠杆菌BG10-1。
路德维希肠杆菌BG10-1形态学特征：
对BG10-1细胞形态和菌落特征进行观察，均为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，好氧，菌落圆形，较小，边缘整齐，表明湿润粘稠，菌落乳白色。
生理生化特征：
各项生理生化鉴定项目包括：革兰氏染色、氧化酶反应、过氧化氢酶反应、葡萄糖发酵、V.P检测、MR检测、纤维素分解、柠檬酸盐利用、酪蛋白水解、硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、硝化反应及硫化氢反应等。路德维希肠杆菌的主要生物学特性为见表1。
表1路德维希肠杆菌BG10-1生理生化特征
生防菌BG10-1分子鉴定为路德维希肠杆菌，其16srDNA基因序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表中的SEQ.ID.NO.1。
路德维希肠杆菌BG10-1菌株的生物活性测定：
⑴路德维希肠杆菌BG10-1对黄曲霉菌的抑制作用：采用对峙培养法对黄曲霉菌内生拮抗细菌进行筛选。将预先准备好的黄曲霉菌菌碟置于PDA平板中央，然后用高温灭菌的牙签蘸取内生细菌，等距离(距病原菌2cm处)对称点接到PDA平板上，于28℃黑暗培养，3—7d观察抑菌带的有无及大小，重复3次。选出抑菌带较宽的内生细菌菌株在花生颗粒上进行复筛。表2指出所应用的效果较好的生防菌对黄曲霉菌的抑制率，所实验的325株菌株中，BG10-1菌株对黄曲霉菌的抑制作用最强，抑制率达到72.5％(图1)。
表2路德维希肠杆菌BG10-1等生防菌株对黄曲霉菌的抑制率(％)
注：表中的实验数据为三次重复的平均值。
⑵菌株BG10-1等生防菌活体生防效果实验
①拮抗菌发酵液的准备：用挑针挑取离体试验中具有抑菌活性的拮抗细菌菌株BG10-1等菌株的单菌落，转移至装有50mL NB培养液的三角瓶中，于28℃、150r·min-1振荡培养ld。吸1mL培养液转接至装有50mL NB培养液的三角瓶中，28℃、150r·min-1振荡培养2d，获得拮抗菌株的发酵液。
②拮抗细菌的活体筛选：把上述发酵2天的拮抗菌发酵液(孢子最终浓度为3.0×106孢子·mL-1)和培养7天生长旺盛的黄曲霉菌菌悬液(孢子最终浓度为3.0×106孢子·mL-1)分别浸泡花生种30min，阴凉处被干后放入无菌平板，每板20粒花生，放入光照培养箱培养10d。培养箱培养条件为：温度28℃，湿度70-80％，光照为12h黑暗/12h光照。以不浸黄曲霉菌液为空白对照，每处理设3次重复。表3指出菌株BG10-1抑制率及抑毒率最高，分别达到65.0％及90.5％，该菌株有进一步研究的潜力(表3和图2)。抑毒率(％)＝(对照毒素量－处理毒素量)/对照毒素量×100％；抑制率(％)＝(对照发病数－处理发病数)/对照发病数×100％。
表3 7株拮抗菌对黄曲霉菌的防治效果及抑毒率
注：数据为三次重复的平均值
提供一种由上述路德维希肠杆菌BG10-1制成的防治花生黄曲霉菌的微生物有机肥制剂，拮抗菌含量在5×108cfu/g以上，有机质含量为35-40wt％。
其生产方法包括：
将路德维希肠杆菌BG10-1发酵液和木薯渣与畜禽粪便混合物高温腐熟料进行固体发 酵，发酵两天后进行翻料，以后每天进行翻堆，5-7天即可发酵结束,低温干燥(≤60℃)，使其含水量≤18％即可得到包装成品固体发酵微生物有机肥，固体发酵微生物有机肥中拮抗菌含量达5×108cfu/g以上,有机质含量为35-40wt％。
按上述方案，木薯渣与畜禽粪便混合物高温腐熟料：发芽指数≥98％，有机质含量35-40wt％，含水量15-20wt％。
按上述方案，将路德维希肠杆菌BG10-1接种到液体培养基中进行发酵生产，发酵生产的条件为：培养温度32-35℃，pH 7.0-7.2，搅拌速度180-220rpm，发酵后使发酵液中菌体量达到≥1×1010cfu/ml。
按上述方案，每吨木薯渣与畜禽粪便混合物高温腐熟料中加入路德维希肠杆菌发酵液15-35L。
按上述方案，所用的液体培养基配制方法为：玉米粉3.0-3.5wt％、蛋白胨1.5-2.0wt％、K2HPO4+KH2PO4(1:1)0.4-0.5wt％，水1000ml，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
路德维希肠杆菌BG10-1生物菌肥田间防效、抑毒率及促生作用
田间试验小区随机设计，3个重复，每个小区的面积为15m×3m。将生防制剂以每亩50公斤，于花生播种时随肥料施入，设置化学防治方法(70％甲基托布津可湿性粉剂0.5g/棵)及对照，农药的施用方法同生防制剂。花生收获后每处理随机调查4个点，每点10株。表4指出菌株BG10-1促生率及抑毒率最高，分别达到6.5％及70.5％，该菌株有进一步研究的潜力，其次是BH9-5，分别达到3.1％及64.5％(表4和图3)。抑毒率(％)＝(对照毒素量－处理毒素量)/对照毒素量×100％；促生率(％)＝(对照株高－处理株高)/对照株高×100％。
表4拮抗菌对黄曲霉菌产毒抑制率及对花生促生效果
提供一种上述防治花生黄曲霉菌的微生物有机肥在田间防治花生上黄曲霉菌中的应用，应用方法为：将防治花生上黄曲霉菌的微生物有机肥制剂以每亩40-60公斤，于花生播种时随肥料施入。
本发明的有益效果：本发明所提供的路德维希肠杆菌BG10-1对黄曲霉菌具有明显的抑菌活性，该菌株制备的菌肥能有效防治黄曲霉菌对花生的污染。
附图说明
图1为路德维希肠杆菌BG10-1对黄曲霉菌的平板拮抗；
图2为路德维希肠杆菌BG10-1在花生粒上对黄曲霉拮抗作用；
图3为双抗菌株BG10-1的存活周期。
具体实施方式
实施例1：路德维希肠杆菌BG10-1微生物菌肥的制备
本发明中涉及到的路德维希肠杆菌BG10-1，已于2016年1月7日被保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M 2016014，分类命名：EnterobacterLudwigii BG10-1。其是从广西贺州八步镇花生荚果中分离筛选到.经室内对峙拮抗实验、活体抑毒实验发现，该菌株抑菌较强，抑菌解毒效果好且稳定，容易培养，无污染，对环境安全。
路德维希肠杆菌BG10-1菌株的生物菌肥制备方法如下：
1)将路德维希肠杆菌BG10-1接种到液体培养基中，进行发酵生产，发酵生产的条件为：培养温度32-35℃，pH 7.0-7.2，搅拌速度180-220rpm，发酵后使发酵液中菌体量达到≥1×1010cfu/ml。液体培养基配方为：玉米粉3.5-4.0％、蛋白胨1.5-2.0％、K2HPO4+KH2PO4(1:1)0.4-0.5％，水1000ml，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
2)将木薯渣与畜禽粪便混合堆积发酵10-15天得到木薯渣与畜禽粪便混合物高温腐熟料，木薯渣与畜禽粪便混合物高温腐熟料：发芽指数≥98％，有机质含量35-40wt％，含水量15-20wt％，然后加入路德维希肠杆菌BG10-1发酵液与木薯渣与畜禽粪便混合物高温腐熟料进行固体发酵，调节含水量，每吨固体有机物料中加入发酵菌液20L，发酵两天后进行翻料，以后每天进行翻堆，5-7天即可发酵结束，低温干燥(≤60℃)使其含水量≤18％即可得到包装成品固体发酵微生物有机肥。成品中拮抗菌含量达5×108cfu/g以上，有机质含量为35-40％。
路德维希肠杆菌BG10-1生物菌肥田间防效、抑毒率及促生作用试验：
田间试验小区随机设计，3个重复，每个小区的面积为15m×3m。将生防制剂(上述路德维希肠杆菌生产的防治花生上黄曲霉菌微生物有机肥制剂)以每亩50公斤，于花生播种时随肥料施入，设置化学防治方法(70％甲基托布津可湿性粉剂0.5g/棵)及对照，农药的施用方法同生防制剂。花生收获时每处理随机调查4个点，每点10株。计算拮抗菌抑毒率及对花生促生效果，结果见表4。表4指出菌株BG10-1促生率及抑毒率最高，分别达 到6.5％及70.5％。抑毒率(％)＝(对照毒素量－处理毒素量)/对照毒素量×100％；促生率(％)＝(对照株高－处理株高)/对照株高×100％。
表4拮抗菌对黄曲霉菌产毒抑制率及对花生促生效果
BH9-5，BG9-2，BG10-8，BL50-6，BH11-1和BS29-1为筛选分离BG10-1过程中室内对峙拮抗实验筛选的抑制效果较好的另外6株生防菌。
田间防治试验发现，BG10-1菌株对黄曲霉抑菌能力强，容易培养，无污染，对环境安全。
实施例2代谢物对黄曲霉菌的抑制作用
生防菌代谢产物的制备
生防菌BG10-1在LB斜面上活化后，取一环于LB培养液中，100mL/300mL装液量，37℃，160r/min振荡培养48h后，制备成以下处理液：上清液：培养液在12000r/min下离心15min，取上清，用0.22μm细菌过滤器过滤后得到无菌的上清液。
菌悬液：培养液在12000r/min下离心15min，弃上清，用无菌水清洗3次再离心，加入无菌水。
蛋白粗提液：培养液于4℃下12000r/min离15min弃沉淀，在上清液中加固体硫酸铵至70％饱和度，4℃静置过夜，于4℃下10000r/min离心20min，弃上清液，沉淀用1/25体积10mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液悬浮，然后用0.22μm细菌过滤器过滤除掉可能存在的细菌。
生防菌代谢产物对黄曲霉菌菌丝生长的影响
测定方法：取黄曲霉菌菌悬液1×106 5mL，放入温度降到45℃左右的PDA三角瓶中(100mL/350mL)，摇晃2min后，均匀的倒入培养皿中。用打孔器在PDA平板周围等距离打6个孔，用移液枪分别加入3mL上清液、过滤液、冷冻上清液、冷冻过滤液、培养液及蛋白粗提液，30℃培养5天待CK长满平板时检测各处理抑菌圈的半径，每个处理三个重复。同时，研究了生防菌上清液在40、50、60、70、80、100℃下的热稳定性实验。热稳定性实验在水浴锅中浸加热1h，121℃温度下处理20min。实验结果显示，菌株BG10-1培养液的抑菌直径可达13.5mm，其次是上清液的13.0mm及冷冻过滤液的9.0mm，抑制能力较强。同时，菌株BG10-1菌株上清液超过60℃即失去对黄曲霉菌的抑制能力，说明该菌株产生的代谢产物是蛋白质类或脂肽类物质。实验结果如表5和表6：
表5生防菌代谢产物对黄曲霉菌菌丝生长的抑制作用
表6热处理对生防菌代谢产物抑菌作用的影响
实施例3生防菌的定殖试验
Rif和Nal双抗标记菌株的制备
在LB液体培养基中37℃过夜摇培BG10-1菌株，5000rpm，离心2min，收集菌体，均匀的涂在含有Nal抗生素(终浓度为50μg/mL)的LB平板上，35℃静置培养。待平板上长出抗Nal的单菌落时，挑选出长势好的单菌落划线接种在含有Nal的LB平板上，连续转接3代，如果该菌落长势稳定且与野生型菌株差异不大，则选为诱导得到抗Nal的突变菌株，命名为BG10-1-N。
在含有Nal抗生素(终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基上35℃过夜摇培突变菌株BG10-1-N，5000rpm，离心2min收集菌体，均匀的涂在含有Nal+Rif抗生素(Nal，50ug/ml；Rif，150ug/ml)的LB双抗平板上，35℃静置培养。待平板上长出抗Nal+Rif的单菌落时，挑选出长势最好的单菌落划线接种在含有Nal+Rif的LB平板上，连续转接3代，如果该菌落长势稳定且与野生型菌株差异不大，则为诱导得到抗Nal+Rif的突变菌株，命名为BG10-1-NR。
BG10-1-NR菌株孢悬液的制备及花生种子土壤处理
花生种子用1×108 CFU/ml BG10-1-NR菌株的孢悬液浸泡5min，种植于准备好的土壤中，两天后再用孢悬液灌根，每穴10ml。浇灌1天后采集第一次的样品，3天后第二次采集样品，以后每5天收集一次，连续检测6周。准确称取待测土样1克，放入装有9ml无菌水的试管中，涡旋振荡3min，使土壤中的微生物充分分散，静置1min，即为10-1稀释液，用10-3和10-4的稀释液涂双抗LB平板(Nal，12.5μg/mL；Rif，50μg/ml)，35℃培养48h，对 生防菌定殖量的数据进行分析。实验结果显示，接种生防菌23天后，细菌存活率显著降低，28天后，生防菌存活率保持在一定水平不变(图3)。
生防菌抗生素相关基因
结合生防细菌抗生素合成相关基因，研究对生防菌BG10-1、BL50-6、BG9-2、BG10-8、BH11-1及BH9-5抗生素相关基因进行PCR扩增，检测菌株是否含有抗生素合成基因。研究结果显示，对黄曲霉毒素污染防治较好菌株BG10-1主要含有溶杆菌素、脂肽及蛋白酶等与生防能力相关的重要基因。
表7生防菌抗生素合成基因的PCR检测结果。
注：+阳性；-阴性。

Claims (10)

1.路德维希肠杆菌BG10-1，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M 2016014。
2.一种由权利要求1所述的路德维希肠杆菌BG10-1制成的防治黄曲霉菌的微生物有机肥制剂。
3.根据权利要求2所述的微生物有机肥制剂，其特征在于：微生物有机肥制剂中拮抗菌路德维希肠杆菌BG10-1含量在5×108cfu/g以上，有机质含量为35-40wt%。
4.权利要求2所述的微生物有机肥制剂的生产方法，其特征在于：将路德维希肠杆菌BG10-1发酵液和木薯渣与畜禽粪便混合物高温腐熟料进行固体发酵，发酵两天后进行翻料，以后每天进行翻堆，5-7天即可发酵结束, 低温干燥，使其含水量≤18%得到包装成品固体发酵微生物有机肥，固体发酵微生物有机肥中拮抗菌路德维希肠杆菌BG10-1含量达5×108cfu/g以上,有机质含量为35-40%。
5.权利要求4所述的微生物有机肥制剂的生产方法，其特征在于：木薯渣与畜禽粪便混合物高温腐熟料：发芽指数≥98%，有机质含量35-40wt%，含水量15-20wt%。
6.权利要求4所述的微生物有机肥制剂的生产方法，其特征在于：将路德维希肠杆菌接种到液体培养基中，进行发酵生产，得到路德维希肠杆菌BG10-1的发酵液，发酵生产的条件为：培养温度32-35 ℃，pH 7.0-7.2，搅拌速度180-220 rpm，发酵后使发酵液中菌体量达到≥1×1010cfu/ml。
7.权利要求4所述的微生物有机肥制剂的生产方法，其特征在于：每吨木薯渣与畜禽粪便混合物高温腐熟料中加入路德维希肠杆菌BG10-1发酵液15-35L。
8.权利要求6所述的微生物有机肥制剂的生产方法，其特征在于：所用的液体培养基配制方法为：玉米粉3.0-3.5wt%、蛋白胨1.5-2.0wt%、K2HPO4和KH2PO4 质量比为1:1的K2HPO4+KH2PO4 0.4-0.5wt%，水 1000ml，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
9.一种权利要求1所述的路德维希肠杆菌BG10-1在黄曲霉菌生物防治中的应用。
10.一种权利要求2-3中任一项所述的微生物有机肥制剂在田间防治花生上黄曲霉菌中的应用，其特征在于：应用方法为：将微生物有机肥制剂以每亩40-60公斤于花生播种时随肥料施入。
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