CN108676722B - 提高根瘤菌剂存活率的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域。为提高根瘤菌的存活率，本发明公开了一种提高根瘤菌剂存活率的保存方法，包括如下步骤：选育根瘤菌菌种：将根瘤菌菌种经培养和选育得到选育的根瘤菌菌种；将所述的选育的所述根瘤菌菌种进行发酵；将大豆拉丝蛋白灭菌后作为吸附剂；将发酵后的根瘤菌菌种加入到所述的吸附剂中，阴凉保存。本发明方法大大提高了根瘤菌的存活率。

Description

提高根瘤菌剂存活率的保存方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高根瘤菌剂存活率的保存方法。

背景技术

本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。

豆科植物在我国植物库中占据着举足轻重的作用，具有极大的经济及社会价值。根瘤菌作为一种革兰氏阴性的短杆菌，菌体进入豆科植物的根系后会与豆科植物共生形成根瘤。豆科植物与根瘤菌共生具有固氮能力强、固氮量大、抗逆性强的优点，是生物固氮中最高效的体系，固氮量约占生物固氮总量的65％。根瘤菌肥料能使结瘤,进行生物固氮，不但应用效果好,而且生产成本低，施用后能减少生产中的化肥使用量，提高产量和品质，对无公害农作物生产以及降低农民投人,保护环境等具有十分重要的作用。自1895年首次在德国出现了以“Nitragin”为商品名的根瘤菌接种剂以来，前苏联、英国、美国和法国等相继实现了根瘤菌剂的工业化生产和大面积推广。目前，在美国等发达国家和巴西等发展中国家，接种根瘤菌面积一般都占播种面积的30％～50％，既改善了土壤，保护了环境，又有利于维持氮素平衡。根瘤菌剂质量的高低一直是其应用效果的一个突出问题。

发明内容

本发明实施例的目的是一种提高根瘤菌剂存活率的保存方法，本发明方法可以大大提高根瘤菌的存活率。

本发明实施例的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明实施例提供了一种提高根瘤菌剂存活率的保存方法，包括如下步骤：

选育根瘤菌菌种：将根瘤菌菌种经培养和选育得到选育的根瘤菌菌种；

将所述的选育的所述根瘤菌菌种进行发酵；

将大豆拉丝蛋白提纯、干燥灭菌后作为吸附剂；

将发酵后的根瘤菌菌种加入到所述的吸附剂中，阴凉保存。

进一步的，所述的培养包括如下步骤：

将根瘤菌进行活化后,接种于根瘤菌YMA液体培养基中,用摇瓶培养法在28℃培养条件下180rpm摇床中培养至发酵液菌体密度为80亿/ml以上后,置于4℃的冰箱中低温保存备用。

进一步的，所述的发酵采用的参数为：

将上述活化菌种接种到种子发酵罐进行三级发酵，发酵罐的参数设定为转速220rpm，罐压0.06rpm,培养温度为28℃,发酵过程中培养基的pH控制在7.0-7.4，发酵完成每毫升含活根瘤菌80-100亿。

进一步的，所述的提纯采用物理提纯法：将所述的大豆拉丝蛋白用纯净水浸泡，去除杂质、油脂和可溶于水物质，再将大豆拉丝蛋白通过离心分离方法取得纯度高的大豆拉丝蛋白。。

进一步的，所述的干燥采用低温烘干干燥法：将所述的提纯后的大豆拉丝蛋白，投入烘干机，60℃低温干燥，干燥后含水量2％。干燥后再粉碎成细度为70目的微小颗粒。

进一步的，所述的大豆拉丝蛋白的灭菌采用钴源照射灭菌法，取大豆拉丝蛋白分装于聚丙烯塑料袋中,即将上述装好大豆拉丝蛋白的聚丙烯塑料袋折叠卷起可以起到很好的密封防止杂菌效果,置于钴源室中照射灭菌。

进一步的，所述的吸附采用无菌喷淋吸附，其步骤如下：

将所述的灭菌干燥后的大豆拉丝蛋白转移至无菌喷淋接种罐，将所述根瘤菌发酵液通过无菌管道与接种罐链接，以喷淋搅拌方式接种到大豆拉丝蛋白中，接种量20％，搅拌器转速60rpm，喷淋流量0.06m3/h。

进一步的，所述的保存采用无菌包装，常温保存，其步骤如下：将所述接种后的大豆拉丝蛋白根瘤菌转移至无菌包装车间，采用自动包装机真空包装，阴凉干燥处常温保存。

进一步的，所述的大豆拉丝蛋白在干燥前进行穿孔处理，形成蜂窝状结构。

借由上述方案，本发明显示装置的控制装置及方法至少具有如下有益效果：

本发明通过采用大豆拉丝蛋白作为吸附剂，大大提高了根瘤菌保存期间的存活率。

附图说明

图1为本发明提高根瘤菌剂存活率的保存方法实施例中拉丝蛋白示意图；

图2为本发明提高根瘤菌剂存活率的保存方法实施例中载体吸附菌剂能力柱状图；

图3为本发明提高根瘤菌剂存活率的保存方法实施例中吸附载体上的菌剂存活率柱状图；

图4为本发明提高根瘤菌剂存活率的保存方法实施例中吸附后存活菌数柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的详细介绍，应当理解，附图和实施例是为了本领域技术人员更容易理解本发明的技术方案，而不能作为本发明保护范围的限定。

在下述介绍中，术语“第一”、“第二”仅为用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。下述介绍提供了本发明的多个实施例，不同实施例之间可以替换或者合并组合，因此本发明也可认为包含所记载的相同和/或不同实施例的所有可能组合。因而，如果一个实施例包含特征A、B、C，另一个实施例包含特征B、D，那么本发明也应视为包括含有A、B、C、D的一个或多个所有其他可能的组合的实施例，尽管该实施例可能并未在以下内容中有明确的文字记载。

本发明实施例提供了一种提高根瘤菌剂存活率的保存方法，包括如下步骤：

选育根瘤菌菌种：将根瘤菌菌种经培养和选育得到选育的根瘤菌菌种；

将所述的选育的所述根瘤菌菌种进行发酵；

将大豆拉丝蛋白提纯、干燥灭菌后作为吸附剂；

将发酵后的根瘤菌菌种加入到所述的吸附剂中，阴凉保存。

本发明实施例采用大豆拉丝蛋白为吸附剂，大大提高了根瘤菌保存期间的存活率，上述方案已经可以实现本发明提高根瘤菌存活率的目的，下面在此基础上给出优选方案：

在本发明的一些实施例中，所述的培养采用用摇瓶培养法在28℃培养条件下180rpm摇床中培养至发酵液菌体密度为80亿/ml以上后,置于4℃的冰箱中低温保存备用

这里要说明的是：28℃是根瘤菌的最佳培养温度，摇瓶培养法可控性强，培养条件稳定，能提高发酵液菌体密度。

本发明对培养的具体方法不做限定，只要可以完成对大豆根瘤菌菌种培养即可。

在本发明的另一些实施例中，根瘤菌的发酵采用发酵罐进行三级发酵，发酵罐的参数设定为转速220rpm，罐压0.06rpm,培养温度为28℃,发酵过程中培养基的pH控制在7.0-7.4，发酵完成每毫升含活根瘤菌80-100亿。

这里要说明的是：三级发酵可有效降低发酵过程中感染杂菌的概率，提高发酵液含菌量，28℃最适合根瘤菌的生长。

在本发明的另一些实施例中，大豆拉丝蛋白的提纯采用物理提纯法：将所述的大豆拉丝蛋白用纯净水浸泡过滤，去除杂质、油脂和可溶于水物质，再将大豆拉丝蛋白通过离心分离方法取得纯度高的大豆拉丝蛋白。

这里要说明的是：大豆拉丝蛋白不溶于水，用纯净水浸泡过滤可去除溶于水的杂质、油脂和其他物质且不会与大豆拉丝蛋白产生化学反应，大豆拉丝蛋白经过纯水浸泡，会变的更松散，有益于菌种的保存。

本发明对提纯的具体方法不做限定，只要可以完成对大豆拉丝蛋白的提纯即可。

在本发明的另一些实施例中，大豆拉丝蛋白的干燥采用低温烘干干燥法：将所述的提纯后的大豆拉丝蛋白，投入烘干机，60℃低温干燥，干燥后含水量2％。干燥后再粉碎成细度为70目的微小颗粒。

这里要说明的是：低温烘干干燥对，对大豆拉丝蛋白的品质影响非常小，干燥彻底，含水量可≤2％，将大豆拉丝蛋白粉碎成细度为70目的小颗粒，可增加吸附剂的表面积，增加孔隙度，提高单位吸附剂的吸附量。

本发明对干燥的具体方法不做限定，只要可以完成对大豆拉丝蛋白的干燥即可。

在本发明的另一些实施例中，大豆拉丝蛋白的灭菌采用钴源照射灭菌法，取大豆拉丝蛋白分装于聚丙烯塑料袋中,即将上述装好大豆拉丝蛋白的聚丙烯塑料袋折叠卷起可以起到很好的密封防止杂菌效果,置于钴源室中照射灭菌。

这里要说明的是：钴源照射法灭菌彻底，方便操作，成本低。

本发明对灭菌的具体方法不做限定，只要可以完成对大豆拉丝蛋白的灭菌即可。

所述的大豆拉丝蛋白在干燥前进行穿孔处理，形成蜂窝状结构，增大比表面积。

这里要说明的是：根瘤菌活化除采用YMA培养基外，还可以采用如下的特制培养基进行活化：

按以下配方配制超高菌体数量的高浓度培养基：牛肉膏2g；蛋白胨90g；可容性淀粉66g；葡萄糖50g；蔗糖5g；琼脂10g；NaCl 9g；KNO₃ 3g；蒸馏水1000ml。

本发明实施例采用的活化培养基中蛋白胨的含量很高，占到了7.29％，其中的金属离子仅有钠和钾两种强碱离子，渗透效果好，本发明实施例采用的培养基活化后得到的根瘤菌有利于与大豆拉丝蛋白的结合，本发明方法中采用28℃条件培养至浓度为80亿/ml后保存，可保证大豆拉丝蛋白吸附后得到的产品中单位重量或体积条件下有效根瘤菌数量增加，而且申请人经大量研究表明，与低浓度的根瘤菌相比，较大浓度的根瘤菌有助于提高保存时的存活率，尤其在保存较长时间后，效果更明显。

下面给出本方案中各参数确定的详细过程：

1根瘤菌菌种的选育：

菌株：根瘤菌菌种

培养基：YMA培养基

药品及设备：

药品：甘露醇，蔗糖，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠，酵母粉，硫酸钙硼酸，钼酸钠。琼脂由天津市化学试剂三厂生产。

所需设备如表1所示：

表1

方法：

将根瘤菌进行活化后,接种于根瘤菌液体培养基中,用摇瓶培养法在28℃培养条件下180rpm摇床中培养至发酵液菌体密度为80亿/ml以上后,置于4℃的冰箱中低温保存备用。

有效活菌数测定方法

血球板计数法结合平板稀释活菌计数法计算根瘤菌数量,革兰氏染色、常规染色进行根瘤菌生长状况检测及定性分析。

2根瘤菌发酵生产工艺

仪器设备如表2所示

表2

名称	型号	产地
			蒸汽发生器	YN18-0.7-D	上海
生化培养箱	MJP-150	北京路希
			恒温震荡培养箱	ZD-85	太仓
显微镜	XSP-44X.9	上海
			PH计	EC.TDS	天津
超净工作台	DL-CJ-2ND	北京
			冰箱	SC-287NE	北京
高压锅	LDZF-50KB	上海
			全自动发酵罐	HND-BJ-50L-500L	上海
真空封口机	V1	江苏

方法：

1)单菌落菌种的制备：分别在上述YMA培养基固体平皿上划线,制备根瘤菌菌种固体平皿单菌落菌种。

2)种子活化:挑取固体平皿平板上生长旺盛的单菌落分别接入到上述Y MA液体培养基(500ml三角瓶中装250ml的培养液)中,在28℃、180rmp的摇床中震荡培养后备用。

3)菌株发酵:将培养48h的各菌种种子液,按10％的接种量分别接入上述YMA培养基配方的发酵培养基培养液中,28℃,180rpm摇床中震荡培养。

4)根瘤菌生长状况的测定：将接种于培养基配方的摇瓶中的菌种在28℃、180rpm条件下的摇床中培养,分别在培养时间段取样,染色镜检检测其菌体生长状况,用血球计数板镜检计数法结合平板活菌计数法,测定各个时间条件下发酵液中的菌体密度及其菌体变化情况。

最佳发酵生产工艺参数确定

方法：

1)配制YMA根瘤菌培养基,加入到全自动三级发酵罐中,121℃条件下高温高压灭菌30min,培养基冷却至30℃备用。

2)将制备好的根瘤菌种子液按10％的接种量接入到培养基中,进行全自动发酵培养。

3)工艺参数的设定：发酵罐的参数设定为转速200rpm，罐压0.06rpm,培养温度为28℃,发酵过程中培养基的PH值控制在7.0-7.4。当发酵过程中的培养基、pH值、温度、罐压等技术参数优选确定后,菌体发酵过程中发酵液中的菌体的需氧量相对于培养时间来说就是个变量,而且是一个极为重要的参数,直接影响着发酵液中菌体的生长发育。发酵的初期,发酵液中的菌体密度较小,发酵罐中的氧气的消耗量不大,这时如果通入大量的空气,溶解氧虽然提高了,但是菌体并不需要这么高的溶解氧,浪费了能源和机器设备。随着培养时间的增加,菌体生长繁殖逐渐进入到对数生长期,菌体的生长速度不断加快,其需氧量也不断增加,这时如果溶解氧含量低,就会影响菌体的生长,影响产品质量。我们通过在菌体生长到对数生长期时,增加进入罐体的无菌空气通入量至通气总量的40％,并从菌体的对数生长期开始,始终维持这一通气量水平,直至发酵终止,以使发酵液中溶解氧的含量维持在一个较高的水平上,满足菌体生长对氧气的需求。

发酵结果分析：

碳源和氮源是构成菌体结构的物质基础,是组成蛋白质和核酸的重要元素,同时也为微生物生长提供主要能源。选择适宜的氮源和碳源,有利于微生物的生长发育和繁殖。不同的氮源和碳源对发酵液菌体密度和菌体形态等生物学性状影响很大。本专利通过在不同的培养基中根瘤菌菌体的数量变化,确立了根瘤菌的最佳培养基,在此基础上向培养基中添加了适宜的碳氮比成分,即最佳的麸皮和豆饼粉的加入量,达到了促进根瘤菌生长的目的,从而增加了发酵液中菌体数量和代谢产物。

影响微生物群体生长繁殖的主要因素有培养基的成分、发酵液中溶解氧浓度的高低、发酵液的值、发酵过程中培养液的温度、培养基中可溶营养物质的浓度等。当培养基成分和值、温度等技术参数经优化确定以后,液体培养基中溶解氧浓度的高低则成为影响细菌生长发育、代谢途经及产物的质量和数量的重要因素。菌体发酵过程中需氧量相对培养时间是个变量,发酵初期,虽然菌体处于旺盛的代谢生长期,但因其总体数量少,故需氧量也少。随着培养时间的推移,菌体繁殖进入对数生长期,此时细菌数量以几何级速度增长,菌体处于高速生长旺盛期,需氧量不断增加,这时就要相应地增加发酵液中的溶解氧的含量,以满足根瘤菌生长发育的需要。我们在研究发酵工艺时,在菌体培养的初期将溶解氧控制在20％,在菌体生长到对数生长期时,通过增加进入罐体的无菌空气通入量,将其升至30％,再提高到40％,并从菌体的对数生长期开始,始终维持通气量40％这一水平,直至发酵终止,获得了菌体密度为800亿/ml以上的根瘤菌菌剂。

3原料的来源与处理对比

供试的吸附载体

草碳:黑龙江省七台河市,储量丰富；

珍珠岩:河南省信阳市珍珠岩厂；

蛭石:河南省南阳市广溢矿产品有限公司；

大豆粉：安阳市得天力食品有限公司。

吸附剂的灭菌

微生物菌剂主要分为液体菌剂、固体菌剂两种类型。液体菌剂容易腐败变质,必需添加防腐剂才能保存较长时间。防腐剂的添加对以微生物代谢产物为主要成分的产品影响较小,但对以有效活菌数为质量标准的产品因强酸对微生物的杀伤作用和抑制作用,严重影响微生物的生物活性。在国内外,对以有效菌数为主体的微生态制剂,多选用固体物料吸附的方式，使液体转变为固体,即将菌悬液吸附到一定的灭菌载体上,制成固体肥料。载体的种类很多,主要有草碳、蛙石、褐煤、珍珠岩、稻壳、膨润上和滑石等。我们根据价格低廉和取材方便的原则,重点考察了草炭，珍珠岩，蛭石和大豆拉丝蛋白四种载体,采用巴氏灭菌法、高温高压湿热灭菌法和一射线灭菌法三种方法,对上述载体进行灭菌,确定出最佳的载体和灭菌方法。

仪器设备如表3所示

表3

名称	型号	产地
			恒温震荡培养箱	ZD-85	太仓
超净工作台	DL-CJ-2ND	北京
			高压锅	LDZF-50KB	上海
射线钴源	——	北京

灭菌方法

1)巴氏灭菌法：分别取上述吸附剂于聚丙烯塑料袋中,即将上述装好载体的聚丙烯塑料袋折叠卷起可以起到很好的密封防止杂菌效果,***到灭菌的肥料袋中间,用巴氏灭菌法进行灭菌。具体灭菌条件和方法是自然条件下堆制成每立方米一堆,外包塑料袋保湿覆盖草帘子保温,必要时人工加温,堆置时间分别是堆置7d,14d,21d,其间观察记录每个试验组的温度变化注意观察温度是否从室温逐渐温和升高,升至约70℃左右又逐渐回落至室温。

2)高温高压湿热灭菌法分别取上述的四种吸附剂分装于聚丙烯塑料袋中,即将上述装好载体的聚丙烯塑料袋折叠卷起可以起到很好的密封防止杂菌效果,置于大型高压湿热灭菌锅中,121℃条件下分别灭菌30min。

3)射线灭菌：分别取上述的四种吸附剂于聚丙烯塑料袋中,即将上述装

好载体的聚丙烯塑料袋折叠卷起可以起到很好的密封防止杂菌效果,置一射线钻源室中照射灭菌。

灭菌检验

根瘤菌微生物菌剂所选用的吸附载体中如果含有杂菌,将直接影响根瘤菌的质量。因此对吸附载体进行灭菌,从而使大豆根瘤菌肥料中的有益微生物可以最大限度地吸附到载体上并定植和繁殖,减少吸附载体中原有的杂菌对肥料中的菌体的竞争抑制作用。我们对吸附载体的灭菌方法和灭菌条件进行了研究,采用了三种灭菌方法,分别在不同灭菌时间段取样,用显微镜镜检法结合活菌平板计数法,检测每种灭菌条件下不同时间段的活菌存活情况,确定最佳的灭菌方法和灭菌条件。

吸附剂选择比较

方法

1)根瘤菌在草碳、珍珠岩、蛭石、大豆拉丝蛋白不同吸附载体中的吸附量检测在超净工作台中将根瘤菌培养液分批次加入上述四种灭菌的吸附载体中,每次加入量为5ml,以100g载体所能加入的菌液量为载体吸附量。根瘤菌在不同吸附载体中的存活率测定将吸附了菌剂的载体放置在阴凉处保存,48h后取出10g样品加入到100mL无菌的生理盐水中,在200r/min下摇床中培养1h后,检测液体中的活菌数。

2)根瘤菌在草碳、珍珠岩、蛭石、拉丝蛋白不同吸附载体中的稳定性测定将放置在室温下的菌剂在2d,12d,21d,45d和120d时分别取l0g样品加入到100mL生理盐水中,在200r/min下培养1h后,检测在不同时间段载体释放的活菌数。

结果与分析

根瘤菌在不同吸附载体中的吸附率和存活率

比较大豆拉丝蛋白(图1)与目前常用载体的负载菌剂的能力和菌剂存活率。我们检测发现所示4种吸附载体的吸附菌剂能力依次为:蛭石>大豆拉丝蛋白>草炭>珍珠岩(图2)。如图3所示根瘤菌菌体在4种吸附载体上的存活率依次为:大豆拉丝蛋白>蛭石>草炭>珍珠岩；大豆拉丝蛋白的吸附率虽然略低于蛭石,但根瘤菌在其上的存活率却达到95.4％。在选择吸附载体时根瘤菌在吸附载体上的存活率应作为关键指标,以使肥料中能够存活更多的根瘤菌,发挥更大的肥效。

根瘤菌在不同吸附载体中的稳定性

所用的根瘤菌液中每毫升的活菌数为25亿,大豆拉丝蛋白、蛭石、草炭、珍珠岩吸附后的有效活菌数分别为5.65亿/g、2.85亿/g、2.12亿/g、1.85亿/g(图4),随着保存时间的增加而在不同载体中呈减少的趋势。分别在不同的时间点上拉丝蛋白中的根瘤菌存活数明显高于其他吸附剂。我们研究发现4种吸附载体中,粉是最好的吸附载体,其次是蛭石,均好于草炭和珍珠岩。

结论

菌剂的保藏对于菌剂生产具有极其重要的意义。保质期的长短直接关系到菌剂的运输和使用效果，进而关系到生产厂家的盈亏。因此，良好的保藏方法是菌剂制备结束后一项重要的工作。针对菌剂的保藏，固体菌剂主要是采取常温保藏法，我们研究发现利用大豆拉丝蛋白为主要吸附剂制备的固体菌剂，置于室温保藏6个月后，菌剂中活菌数仍大于1×10⁹CFU/g。

大豆拉丝蛋白是一种优良的农业资源，材料丰富,成本低廉，在选用吸附载体时,可考虑选用作为根瘤菌类肥料的吸附载体。根瘤菌在大豆拉丝蛋白中有较好的吸附能力和存活能力,还有较高的稳定性,能够在180d甚至更长的时间范围内使根瘤菌保持活性,从而保证了根瘤菌肥料的肥效和产品质量。

4发酵液的生产和吸附及检测与包装

根瘤菌肥料是用拉丝蛋白作为载体,吸附根瘤菌菌剂后搅拌和干燥而成的生物产品。根瘤菌的生物学特性是耐高温性差,一般生长和存活温度为15-40℃,当温度达到60℃以上时,80％的菌体将死亡,温度越高,死亡速度越快,死亡数量越多。因此,根瘤菌肥料的生产,工艺上要求生产过程中温度必须始终严格控制在50℃以下,才能有效地保证成品肥料中的根瘤菌有效活菌数在较高的水平。此外,为防止产品中的杂菌污染和大量繁殖,应该对载体进行灭菌,以尽可能地杀灭载体中的杂菌。本专利将在前面研究的基础上,进一步研究根瘤菌肥料的生产工艺及其质量控制标准。

方法：

1)菌体的发酵培养：将根瘤菌菌种接入到新鲜配制的经过高温高压湿热灭菌后冷却至30℃的液体YMA培养基中,按照上面制定的菌剂生产工艺参数进行发酵培养,培养出的发酵液分装于25L的菌剂塑料桶中,备用。

2)载体的灭菌按照本专利研究制定的灭菌工艺条件,将大豆粉载体装于的塑料编织袋中,运入到灭菌室中,进行灭菌,得到符合根瘤菌肥料生产工艺的、经过彻底灭菌的吸附载体。

3)根瘤菌肥料的生产方法分别取吸附剂大豆拉丝蛋白,有效活菌数80亿/ml以上的根瘤菌的发酵液按20％的比例吸附,一定量的pH调节剂,在混合搅拌器中搅拌均匀,在30℃条件下干燥至水分合格的范围内。

4)肥料中有效活菌数的检测上述方法进行三次重复的生产,从三次重复生产的产品中分别取样,每次取1kg,将三个样品混合均匀后,称取1kg,按微生物稀释平板计数法结合显微镜镜检法常规操作,检测有效活菌数。

5)将生产的产品抽真空后置于阴凉干燥处保存，避免阳光直射和温度过高。

结果分析

我们按照上述的生产工艺进行了根瘤菌肥料的生产,生产之后取样进行了肥料中有效活菌数的化验分析。分析方法是血球计数板结合平板活菌计数法,测定肥料中的根瘤菌有效活菌数量和PH值分别为15亿/g和6.8。

试验中制备的根瘤菌发酵菌剂有效活菌数为80亿/g,按生产工艺要求20％的比例加入菌剂,与吸附载体混合物搅拌混合均匀后,有效活菌数是15亿/g,分别经过重复三次生产后进行产品质量检测,在产品的有效活菌数这一指标上,根瘤菌存活数平均为15亿/g,且能够保持肥料湿度的相对稳定。

本发明方法制备的菌剂，采用大豆拉丝蛋白吸附，可以提高根瘤菌的存活率和存活时间，而且在根瘤菌的浓度上加以控制，能够进一步与大豆拉丝蛋白配合提高存活率，而且，制备的菌剂中根瘤菌的平均存活数很高，大大提高了菌剂的效能。

在本发明的一些实施例中，可以将制备的菌剂进行风干，风干后的菌剂存活期更长。

在本发明的另一些实施例中，在吸附前在纳米层级上对大豆拉丝蛋白进行粉碎处理，使其具有大的表面积，有利于提高吸附率，保证干燥的效果，延长根瘤菌的存活率。

在本发明的另一些实施例中，在吸附前在纳米层级上对大豆拉丝蛋白进行穿孔处理，使其具有蜂窝状结构，有利于内部通风、保证干燥的效果，延长根瘤菌的存活率。

以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种提高根瘤菌剂存活率的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

选育根瘤菌菌种：将根瘤菌菌种经培养和选育得到选育的根瘤菌菌种；

将所述的选育的根瘤菌菌种进行发酵；

将大豆拉丝蛋白提纯、干燥灭菌后作为吸附剂；

将发酵后的根瘤菌菌种以喷淋搅拌方式加入到所述的吸附剂中，阴凉保存。

2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述的培养包括如下步骤：

将根瘤菌进行活化后,接种于根瘤菌YMA液体培养基中,用摇瓶培养法在28℃培养条件下180rpm摇床中培养至发酵液菌体密度为80亿/ml以上后,置于4℃的冰箱中低温保存备用。

3.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述的发酵采用的参数为：

将上述活化菌种接种到种子发酵罐进行三级发酵，发酵罐的参数设定为转速220rpm，罐压0.06rpm,培养温度为28℃,发酵过程中培养基的pH控制在7.0-7.4，发酵完成时每毫升含活根瘤菌80-100亿。

4.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述的大豆拉丝蛋白提纯采用物理提纯法：将所述的大豆拉丝蛋白用纯净水浸泡，去除杂质、油脂和溶于水的物质,再将大豆拉丝蛋白通过离心分离方法取得纯度高的大豆拉丝蛋白。

5.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述的干燥采用低温烘干干燥法：将提纯后的大豆拉丝蛋白，投入烘干机，60℃低温干燥，干燥后含水量2％，干燥后再粉碎成细度为70目的微小颗粒。

6.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述大豆拉丝蛋白的灭菌采用钴源照射灭菌法，取大豆拉丝蛋白分装于聚丙烯塑料袋中,即将上述装好大豆拉丝蛋白的聚丙烯塑料袋折叠卷起可以起到很好的密封防止杂菌效果,置于钴源室中照射灭菌。

7.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，吸附采用无菌喷淋吸附，其步骤如下：

将灭菌干燥后的大豆拉丝蛋白转移至无菌喷淋接种罐，将根瘤菌发酵液通过无菌管道与接种罐链接，以喷淋搅拌方式接种到大豆拉丝蛋白中，接种量20％，搅拌器转速60rpm，喷淋流量0.06m³/h。

8.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述的保存采用无菌包装，常温保存，其步骤如下：将接种后的大豆拉丝蛋白根瘤菌转移至无菌包装车间，采用自动包装机真空包装，阴凉干燥处常温保存。

9.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述的大豆拉丝蛋白在干燥前进行穿孔处理，形成蜂窝状结构。