CN1138776C - 吡咯喹啉醌的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提取PQQ的方法，它是将PQQ发酵液用亲水性阴离子交换剂吸附后，经洗涤、洗脱，真空浓缩干燥得到PQQ粗品，再经重结晶，除去粗品中70%以上的盐份；接着上用Seppak C18柱反相吸附柱，用含5%吡啶的乙醇流过一倍柱体积，随之用70%甲醇溶液洗脱，使回收率提高约30%左右，降低成本30-40%。该方法具有工艺操作简单、成本低廉，产品回收率和纯度高等特点，可用于PQQ大规模生产的后处理过程。

Description

吡咯喹啉醌的提取方法
本发明涉及吡咯喹啉醌的一种提取方法。
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，简称PQQ)是一种小分子化合物。PQQ能刺激一些微生物和植物生长，促进雌鼠生长繁殖，加速胞外基质成熟，强化机体免疫力，清除和调节体内自由基，提高神经细胞和神经生长因子(NGF)生成，防止酒精、乙醛对肝脏的损害等[Van kleef.M.A.G&Duine JA.，Factors relevant inbacterial PQQ.Appl.Environ.Microbiol.1989.55.1209-1213]，因此PQQ可作为保健品、新药物开发的一种有用的原材料。
PQQ可以通过化学合成法或生物合成法[Ameyama.M，Hayashi.M et al.，Microbial production of PQQ.Agric.Biol.Chem.1984，48：561-565；Van.Kleef.M.A.G&Duine.J.A.，L-Tyr is the precursor of PQQ biosynthesis in Hyphomicrobium X.FEBS 1988，237：91-97；JP.昭63-267287 C12P 17/18]获得，由于前者有工艺复杂，异构体难以分离、成本高等弊端。因此，目前PQQ主要采用生物合成法进行。其提取方法为：PQQ发酵液→亲水性离子交换剂吸附→低盐溶液洗涤→高盐溶液洗脱→调pH≈2→反相吸附柱(0.75cm3)→70％甲醇洗脱→直空干燥。但该方法仅适合于少量发酵液(数十立升)制备PQQ，且仍处在实验室小规模试制阶段，产品价格极其昂贵(德国39美元/mg，日本150人民币/mg)，因此极大地限制了PQQ的开发应用。
本发明的目的在于提供一种吡咯喹啉醌(PQQ)的提取方法，该方法应具有工艺操作简单、成本低廉，产品回收率和纯度均高等特点，可用于PQQ大规模生产的后处理过程。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种吡咯喹啉醌的提取方法，将吡咯喹啉醌发酵液用亲水性阴离子交换剂吸附后，经洗涤、洗脱，再用反相吸附柱吸附、甲醇洗脱，真空浓缩干燥后得到吡咯喹啉醌，其特征在于：经洗涤、洗脱后，进行真空浓缩干燥，得到吡咯喹啉醌粗品，溶解达到KCl饱和度，调pH值至3.5，在10℃以下结晶；反相吸附柱为20cm3柱；甲醇洗脱前用含5％吡啶的乙醇洗涤反相吸附柱一倍柱体积。
本发明更具体的技术方案如下：一种吡咯喹啉醌(PQQ)的提取方法，将PQQ发酵液用DEAE-葡聚凝胶(亲水性阴离子交换剂)吸附后，用含0.6mol/L KCl的20mmol/LTris-HCl溶液洗涤，再用含0.6～1.2mol/LKCl的20mmol/LTris-HCl溶液洗脱，真空浓缩干燥得到PQQ粗品；将此粗品溶解达到KCl饱和度，溶液调pH≈3.5，在＜10℃下结晶，离心得晶体PQQ；将此加水溶解，调pH≈3.5，用柱体积为20cm3的Seppak C18柱进行反相吸附，用pH≈2.5的Tris溶液洗涤，用含5％吡啶的乙醇流过一倍柱体积，再用70％甲醇溶液洗脱，真空浓缩干燥得到产品PQQ。用上述方法提取的PQQ经HPLC和毛细管电泳检测，结果表明其纯度分别为98.3％和95％。从实验室收集的培养液，制备的PQQ经毛细管电泳检测其纯度达100％。
本发明的提取方法中，经高浓度盐溶液洗脱后，从吸附剂上解离的PQQ溶液体积大，经真空浓缩得到含高盐的PQQ制品，再采用重结晶方法能除去粗PQQ制品中70％以上的盐份。同时，反相吸附柱改0.75cm3小柱为20cm3柱，前者适用于纯化含10余毫克PQQ发酵液，而后一柱则能纯化含数百毫克PQQ发酵液。PQQ能有效地被反相层析柱吸附，若仅用70％甲醇溶液洗脱，即使减慢洗脱速度，延长洗脱时间，也难于将PQQ完全洗脱出来。本发明中先采用用含5％吡啶的乙醇洗涤反相吸附柱一倍柱体积，再用70％甲醇溶液洗脱，不仅使回收率提高30％左右(由原来的1mg/L回收率提高到1.3mg/L左右)，并且该反向柱可反复使用，从而降低成本30-40％。因此，本方法具有工艺操作简单、成本低廉，产品回收率和纯度高等特点，而且可用于PQQ大规模生产的后处理过程。
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明：
实施例：
将收集的PQQ发酵液用DEAE-葡聚凝胶吸附后，用含0.6mol/L KCl的20mmol/L Tris-HCl溶液洗涤，接着用0.6～1.2mol/L KCl的20mmol/L Tris-HCl溶液洗脱，真空浓缩干燥得到PQQ粗品；将此粗品溶解达到KCl饱和度溶液(调pH≈3.5)，在＜10℃下结晶，离心得晶体PQQ；将此加水溶解调pH≈3.5，用SeppakC18柱反相吸附，pH≈2.5溶液洗涤，用含5％吡啶的乙醇流过一倍柱体积，再用70％甲醇洗脱，真空浓缩干燥得到产品PQQ。经毛细管电泳检测其纯度可达95％～100％。PQQ的回收率提高30％。

Claims (1)

1.一种吡咯喹啉醌的提取方法，将吡咯喹啉醌发酵液用亲水性阴离子交换剂吸附后，经洗涤、洗脱，再用反相吸附柱吸附、甲醇洗脱，真空浓缩干燥后得到吡咯喹啉醌，其特征在于：经洗涤、洗脱后，进行真空浓缩干燥，得到吡咯喹啉醌粗品，溶解达到KCl饱和度，调pH值至3.5，在10℃以下结晶；反相吸附柱为20cm3柱；甲醇洗脱前用含5％吡啶的乙醇洗涤反相吸附柱一倍柱体积。
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