CN1074791C - 生产d－泛酸钙的方法 - Google Patents

Abstract

生产D-泛酸钙的一种方法，其包含将通过微生物发酵方法直接生产的D-泛酸溶液与活性炭相接触，将D-泛酸吸附于活性炭上，用一个亲水性有机溶剂洗脱D-泛酸，用一个含钙的碱性试剂中和洗脱液，沉淀D-泛酸钙，收集D-泛酸钙。

Description

生产D-泛酸钙的方法

发明的范围

本发明是关于生产D-泛酸钙的一个方法，该D-泛酸钙是从微生物直接生产D-泛酸的液体发酵液中得到的。D-泛酸钙作为一种维生素在医药，食品，饲料等方面已经广泛应用。

发明的背景

生产泛酸钙常规方法粗略可分为化学合成方法和直接发酵方法。在工业生产上广泛应用的化学合成方法包括从起始化合物异丁基醛合成D，L-泛酸内酯，用化学或酶方法进行旋光拆分，然后将得到D-泛酸与β-丙氨酸钙缩合而得到D-泛酸钙。作为直接发酵的方法，JP-A 6-261772最近阐述一种应用糖类和β-丙氨酸，通过微生物直接生产D-泛酸的新方法。特别是该方法应用含有D-泛酸发酵液体培养基来生产D-泛酸钙。该方法包括液体发酵液通过离子交换层析法进行脱盐，以钙盐形式中和浓缩的D-泛酸，加入甲醇(甲醇浓度：83v/v ％)沉淀D-泛酸钙晶体。

直接发酵方法比化学合成方法更有效，因为此方法不需要旋光拆分等，但是在液体发酵液中，除了D-泛酸以外还含有微生物细胞等不溶物质和其它各类可溶杂质如糖类，低聚糖类，有机酸，蛋白质，无机盐(正负离子)等。因此，最主要的问题是如何以高收率和纯度从液体发酵液中有效地分离纯化D-泛酸钙。如上所述，JP-A 6-261772阐述了一个以D-泛酸直接发酵液体培养基中生产D-泛酸钙的方法，该方法包括应用离子交换层析法脱盐液体发酵液，接着以钙盐形式中和浓缩D-泛酸，加入甲醇(甲醇浓度83v/v ％)沉淀D-泛酸钙晶体。但是该方法有下列缺点：(i)用离子交换树脂处理并不能除去在液体发酵液中的单糖或低聚糖，在结晶母液中含有糖类的量相当于泛酸的10％，这些残留的单糖或低聚糖，在离子交换树脂处理的溶液进行热浓缩过程中会产生颜色或在结晶过程中降低结晶的产率。(ii)为了得到高结晶产率，离子交换树脂处理的溶液，在加甲醇以前必须浓缩以获得高浓度的D-泛酸钙(大约为50％)，以便在结晶母液D-泛酸钙的浓度不低于7w/v ％，甲醇的浓度为约90v/v ％。在此浓度下的D-泛酸钙有很高的粘度，这使得溶液的浓缩非常困难。

附图的简述

图1是固定床柱图式，装有活性炭的柱A和B串联，符号(i)到(vi)表示路径。

图2表示经处理的液体通过碳柱LH2C的流过曲线(breakthrough)。细实线A表示D泛酸钙流过曲线，粗实线B表示糖类流过曲线。(a)表示D-泛酸的流过吸附点，(b)是D-泛酸饱和吸附点。

图3表示应用甲醇作为洗脱剂，从LH2C碳柱洗脱得到的洗脱曲线，细实线A，粗实线B和虚线C表示D-泛酸，水和糖类的洗脱曲线。

发明概述

本发明者经过深入研究，已得到一个从除通过直接发酵方法得到D-泛酸之外还含有糖类等的液体培养液中高产率制备优质D-泛酸钙的有效方法，现已完成本发明全过程。

本发明提供一个生产D-泛酸钙的方法，该方法包括将通过微生物发酵法直接生产的D-泛酸与活性炭相接触，以将D-泛酸吸附于活性炭上，用亲水有机溶剂洗脱D-泛酸，用含钙的碱试剂中和洗脱液，以便沉淀D-泛酸钙，收集D-泛酸钙。

如下详述，优选地，含有D-泛酸的溶液是发酵溶液，其中不溶物质被除去，含有D-泛酸溶液的pH在优选地为1-5。优选地，含有D-泛酸的溶液持续与包装在至少两个串联柱中的活性炭相接触，直到达到饱和吸附点。优选地，亲水的有机溶剂为1～5碳原子的低级醇，更优选为甲醇。含钙的碱试剂优选地为氢氧化钙。优选地，亲水有机溶剂是甲醇，含钙碱试剂是氢氧化钙，作为晶体收集的D-泛酸钙含有4分子的甲醇和1分子的水。

发明详述

本发明的含有通过微生物发酵法直接生产D-泛酸的液体，可以如在JP-A 6-261772中公开的通过培养能生产D-泛酸的微生物，例如肠细菌株大肠杆菌814/pFV 31(IFO 15374，FERM BP-4401)，其培养基中含有如葡萄糖类的糖源，并让菌株与β-丙氨酸相接触而生产。此时D-泛酸生产量通常为40g/l。优选地，除去例如细菌细胞之类的不溶物质应用常用的方法例如离心，过滤等，以免以后活性炭处理时碳的污染，并可延长碳的寿命等。

已经除去细菌细胞等不溶物质，并含有D-泛酸的溶液，通常调pH为1～5，优选地pH2～4，应用的酸为无机酸例如盐酸，硫酸等。当pH低于1时，D-泛酸很容易分解，产率下降。当pH超过5时，吸附到活性炭上的D-泛酸的量减少，而糖类增加，这样糖类分离率降低。

本发明中应用的活性炭没有特殊的限制，应用于液相分离的任何商用活性炭产物都能使用。优选实施例中使用的筛孔直径不超过300(在此称为筛孔体积)的活性炭总的筛孔体积不少于0.4cc/g，平均的筛孔直径不大于300(在此称为平均筛孔直径)，不小于17。具有这样筛孔性质的活性炭可以通过下列方法得到，例如，1)将木材例如木头片，椰壳等浸入化学试剂中如氯化锌，磷酸，氯化钙等，在600～700℃时烧结，用酸如盐酸等洗涤化学试剂，或2)用碱处理矿物物质如煤，石油沥青等，接着用蒸汽，二氧化碳在750℃～900℃进行活化。活性碳是粉状或微粒形式。但是从柱压控制的观点来看，在装柱使用时，更愿意使用微粒型。活性炭的例子如微粒型Shirasagi KLH(由Takeda化学工业有限公司生产，筛孔体积为1.09cc/g，平均筛孔直径：32)，微粒型Sirasagi W(由Takeda化学工业有限公司制造筛孔体积：0.49cc/g，平均筛孔直径：18)，微粒型Sirasagi LH2C(由Takeda化学工业有限公司制造，筛孔体积0.74cc/g，平均筛孔直径：19)，CAL(由Calgon联合公司制造，筛孔体积：0.55cc/g，平均筛孔直径：21)，微粒型活性炭Daiahope 008(由Mitsubishi化学联合公司生产，筛孔体积：0.61cc/g，平均筛孔直径：20)等。

优选地，应用固定床吸附方法，使被处理的液体流过以接触活性炭，在此方法中被处理的液体流过包装在柱里的活性炭，此方法可以层析分离杂质，有利于含有亲水性的有机溶剂的D-泛酸洗脱物的分级分离。实际应用中的优选方案是所谓的系列吸附，让待处理的液体通过至少由两个以上包装有活性炭的串联的柱，以便将D-泛酸吸附于活性炭上。

应用两个柱的吸附处理在下文实例中进行讲述。如图1所示，装有活性碳的柱A和柱B串联连接，被处理的液体按如下顺序通过柱：(i)→(ii)→(iv)→(v)→(vi)。液流不断地通过柱，直到柱A出口处的泛酸浓度与柱A进口处之浓度相同为止。一旦柱A出口处和进口处浓度相同，将柱A和柱B分开，将液流接管接到柱B进口处，再将另一个活性炭柱与柱B串联相连接，液流是持续地，直到柱B进口和出口处泛酸浓度相等为止。

图2表示D-泛酸和糖类的流过曲线，在此之前，直接发酵液体培养液经过细菌细胞分离，活性炭脱色和用盐酸调pH到3并流过LH2C碳柱，当柱A进口和出口的泛酸浓度相同时的点称为饱和吸附点(b)。在饱和吸附点(b)D-泛酸吸附于柱上的量(大约200g/l-LH2C)是流过吸附点(a)的1.5倍，在流过吸附点时，在柱中没有泛酸流出。在经过流过吸附点之后流出的D-泛酸被吸附于另一个柱上。共存于被处理液体中的糖类或其它杂质与D-泛酸相比吸附率较低，因此被D-泛酸强迫流出，糖类或其它杂质的流过比率可达250％。现已发现，当处理过程不断进行以达到饱和吸附点时，在被处理液体中至少90％的糖类被分离而除去。这是该项技术中一个意外的发现。在处理液体中所含有的无机盐流出到吸附废液中，因为它们并不为活性炭所吸附，这样可将无机盐分离而除去。

D-泛酸已达到饱和吸附的活性炭柱应用亲水性有机溶剂将其洗出。优选地，亲水性有机溶剂包括含有1～5个碳原子的低级醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇等，特别是甲醇，它有利于后面的结晶步骤。这是因为D-泛酸的晶体具有多态性，以α、β或γ晶型存在，晶体含有4分子的甲醇和一分子的水(4MeOH·1H₂O晶体)，或以非晶型形式存在，这取决于溶剂环境。微粒型4MeOH·1H₂O晶体是从结晶母液，当用甲醇为结晶溶剂时结晶而成，分离率相当高，洗脱温度是10～30℃，优选是20～30℃。

D-泛酸用甲醇从活性炭的洗脱情况，在下面可参阅例1中图3所显示的洗脱曲线。

洗脱的第一部分(0.7倍LH2C碳柱体积)含有柱内残留的水，从柱中被强迫洗出。这一部分D-泛酸的浓度只有0.4w/v ％。第二部分(1.5倍体积)含有8.7w/v ％ D-泛酸和7.5w/v ％水。因为被处理液体中D-泛酸的浓度是2.6w/v ％，在这部分D-泛酸被浓缩了3.4倍。最后一部分(0.8倍体积)含有0.9w/v ％ D-泛酸和0.05w/v的水。在三部分中D-泛酸的回收率分别为2％，90％，4％。

从后面结晶过程的结晶效率来看，通常洗脱液中亲水性有机溶剂的浓度是80～98v/v％，优选地为85～95％，更优选的为90～92％。优选地，D-泛酸的浓度不低于7w/v％。因此，在1.5倍体积以上的洗脱部分经中和得到结晶母液。

然后，洗脱液用含钙的碱性试剂进行中和。任何碱性试剂只要含有足够量的钙用以中和D-泛酸都可以被应用。特别优选的是氢氧化钙。具体应用中，粉末状氢氧化钙几乎与D-泛酸等克分子被加入到洗脱液中。残留的未反应的氢氧化钙微粉，经过滤而除去。在优选地，中和过程中液体的温度不低于15℃，以免D-泛酸钙结晶。

结晶之后，如此制备的母液，冷却至温度不高于10℃，优选地，不高于5℃。晶种以基于D-泛酸钙计算约为0.2w/w％的量加入，混合物在0～5℃搅拌静置不低于10小时，以高产率地获得D-泛酸钙结晶。结晶浆液应用通常的离心脱水机离心或滤器加压过滤以得到湿的晶体。

当用甲醇作为洗脱剂时，湿的结晶含有约25v/v％的甲醇和约5v/v％的水。湿结晶在70～80℃经减压进行干燥，将水含量降低到约0.5％。如果必要，湿结晶可应用湿度调节的空气(80℃，RH20％)进行干燥，将水的含量控制在约为2％。以这种方式获得基本不含有甲醇的D-泛酸钙粉末。或者是，湿结晶溶解于水中，通过蒸发溶剂浓缩溶液其D-泛酸钙浓度变成50w/v％，再用通常喷雾干燥机进行喷雾干燥，以得到D-泛酸钙粉末。所有干燥产物的结晶型转变成无晶型。

如上所述，本发明方法是一个高产率生产D-泛酸钙的有效方法。在该方法中，含有D-泛酸的溶液通过一个活性炭柱饱和吸附D-泛酸到活性炭上，同时有效地分离除去无机离子和糖类，D-泛酸应用一个亲水的有机溶剂例如乙醇进行洗脱。从溶剂浓度和D-泛酸浓度的角度，选择合适的洗脱部分，被选中的部分作为起始粗溶液用于中和和结晶步骤。此外，结晶后D-泛酸钙很容易分离和收集。

实例

下面的实例进一步详细描述本发明，但并不构成对本发明范围的限制。

实施例1

大肠杆菌IFO 814/pEV 31菌株在5升发酵罐中按常规方法进行培养其培养基含有葡萄糖作为糖源，经发酵培养获得含有D-泛酸的直接发酵培养液(2.5升)。该液体发酵液通过一个陶瓷滤器(由Toshiba陶瓷公司制造)进行过滤，该滤器具有筛孔直径为0.1μ，在40℃条件下，除去细菌细胞等不溶物质以获得滤液(1.67升)。滤液含有D-泛酸(38.5mg/ml(64.3g))，糖类(用酚-硫酸方法测定总量：10.3mg/ml(基于D-泛酸计算约为27％))。该滤液通过一个装有活性炭K1用于脱色(由Takeda化学工业公司制造，筛孔体积1.12cc/g，平均筛孔直径：32A)的活性炭柱(内径：70mm，高：130mm，装填体积：500ml)，得到含有洗涤水的液体(2.4升)(脱色率：99.5％)，向该液体中加入浓盐酸(56ml)调节pH到3.0，液体连续通过由两个串联的，包装了活性炭的柱(柱A和柱B，内径：50mm，高：100mm，装填体积：200ml)，该活性炭柱用于液相分离(LH2C碳，微粒型，蒸汽活化的碳，Takeda化学工业公司制造)。通过柱A达到饱和吸附点的粗制液体的量为2.2L，经过这个操作，柱A吸附D-泛酸29g(145g/L-LH2C碳)，达到饱和吸附点后，柱A与柱B分开，剩余液体通过柱B，柱A用600ml水洗涤，然后D-泛酸用甲醇进行洗脱。第一部分0.7倍体积(140ml)弃去不要，第二部分1.5倍体积(300ml)用于后面的结晶步骤，最后的0.8倍体积(160ml)用于另一个柱的洗脱液以回收D-泛酸。

D-泛酸，总糖，甲醇在第二部分中的浓度分别为8.7w/v％(26.3g)，0.43w/v％(1.3g)和92.5v/v％。向第二部分中加入氢氧化钙粉末(4.8g)，搅拌混合均匀。这样D-泛酸中和并得到钙盐(D-泛酸钙：28.6g)。该液体通过一个预铺硅藻土的抽滤漏斗进行过滤，操作在20～25℃下进行，滤液作为结晶母液，将结晶母液转移到一个装有搅棒的圆底烧瓶中冷却到5℃。加入晶种(按D-泛酸钙计算0.2w/w％)混合物冷却到2℃，维持此温度15小时，以这种方式，实行结晶过程。结晶的浆液通过一个3G玻璃滤器进行过滤，在5℃时喷撒甲醇洗涤以得到湿晶体(36.6g)(D-泛酸钙：34.4g，结晶产率：90％)，该晶体含有4分子的甲醇(甲醇含量：26％)和一分子的水(水含量：4％)。湿晶体在80℃用常规方法减压干燥和经恒湿空调干燥(80℃，RH20％)，得到D-泛酸钙干粉(26.1g，水含量：2.4％)。该产品在澄清度，颜色，钙含量，氮含量，比旋光性，结晶形式等方面符合日本，美国和英国的要求。

如上所述，本发明方法能有效地除去杂质，特别是糖类，并通过将微生物发酵法直接生产的含有D-泛酸的发酵液，经与活性炭相接触，将D-泛酸饱和吸附于活性炭上，进而用亲水有机溶剂如甲醇进行洗脱，并通过结晶高产有效地从发酵滤液中得到优质的D-泛酸钙。

Claims (6)

1.一种生产D-泛酸钙的方法，其包括：

从通过微生物发酵方法直接得到的D-泛酸发酵液中除去不溶性物质；

得到含D-泛酸的溶液；

调节该含D-泛酸的溶液的pH至1-5；

使该含D-泛酸的溶液与粒状活性炭接触，所述粒状活性炭对糖的吸附性低于对D-泛酸的吸附性，并且被包装在至少两个串联连接的柱子中，以吸附D-泛酸到活性炭上直至达到饱和吸附点为止；

用亲水有机溶剂洗脱D-泛酸；

用含钙的碱性溶剂中和该洗脱液，以沉淀D-泛酸钙；和

收集D-泛酸钙。

2.权利要求1的方法，其中所述亲水有机溶剂是含有1～5个碳原子的低级醇。

3.权利要求2的方法，其中所述低级醇是甲醇。

4.权利要求1的方法，其中所述含钙的碱性试剂是氢氧化钙。

5.权利要求1的方法，其中所述亲水有机溶剂是甲醇，含钙碱性试剂是氢氧化钙，并且D-泛酸钙是以含有4分子甲醇和一分子水的结晶形式被收集。

6.权利要求1的方法，其中所述活性炭是粒状的蒸汽活化的炭。

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