CN107417749A - 一种辅酶i的树脂填料分离方法 - Google Patents

一种辅酶i的树脂填料分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于涉及辅酶I提取领域，提出一种辅酶I的树脂填料分离方法，将过滤后的含有辅酶I的细胞过滤液经过D945大孔树脂柱交换后水洗和洗脱，收集洗脱液，即得。本发明仅采用一种树脂填料对辅酶I进行分离纯化，且能在辅酶I最适宜的PH范围内进行分离操作，降低副产品的生成率，大大提高了辅酶I经树脂分离后的纯度。

Description

一种辅酶I的树脂填料分离方法
技术领域
本发明涉及辅酶I提取领域，特别是一种辅酶I的树脂填料分离方法。
背景技术
辅酶I(NAD)，化学名为烟酰胺腺嘌呤二核甘酸或二磷酸烟苷，在哺乳动物体内存在氧化型(NAD+)和还原型(NADH)两种状态，是人体氧化还原反应中重要的辅酶，参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度稳定，维持各项细胞正常功能。体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度决定了细胞衰老的过程和程度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。
目前，生物制品常用树脂分离的方法对有效成分进行分离纯化，以得到高纯度的目的物。而采用树脂分离的方法对辅酶I进行纯化的报道极少，之前有报道提出，依次用122#树脂和732#树脂对辅酶I粗品进行层析分离，用122#树脂分离时，洗脱剂为氨水；用732#树脂分离时，洗脱剂为蒸馏水；需调节PH。此种方法存在弊端：采用两种树脂进行层析分离，步骤繁琐；122#树脂为弱酸性酚醛系阳离子交换树脂，要求PH的使用范围为4-14，且在偏碱性环境中吸附效果比较好，而辅酶I在PH值为2.5-3.5时最为稳定，且在碱性环境下极易变质，因此，用122#树脂对辅酶I粗品进行柱洗脱，洗脱剂为氨水，此种条件下，辅酶I容易发生变质，产生副产物，影响辅酶I纯度。因此需要寻求一种合适的树脂填料分离技术。
发明内容
本发明旨在提供一种新型树脂填料分离技术。本发明采用D945大孔树脂代替122#树脂和732#树脂，用于辅酶I的分离纯化。相较于122#树脂和732#树脂，D945大孔树脂的优点比表面积大、吸附力强、选择性高、重复利用率高，不需要调节PH，条件要求比较温和。本发明仅采用一种树脂填料对辅酶I进行分离纯化，且能在辅酶I最适宜的PH范围内进行分离操作，降低副产品的生成率，大大提高了辅酶I经树脂分离后的纯度。
其具体方案为：一种辅酶I的树脂填料分离方法，将过滤后的含有辅酶I的细胞过滤液经过D945大孔树脂柱交换后水洗和洗脱，收集洗脱液，即得。
在上述的辅酶I的树脂填料分离方法中，洗脱液为7-10vol％的乙醇溶液。
在上述的辅酶I的树脂填料分离方法中，洗脱液为8-9vol％的乙醇溶液。
在上述的辅酶I的树脂填料分离方法中，水洗操作中的水为纯化水。
在上述的辅酶I的树脂填料分离方法中，所述的含有辅酶I的细胞过滤液以20-30ml/min的速度进行上柱交换。
在上述的辅酶I的树脂填料分离方法中，D945大孔树脂和水洗操作中的水的体积比为1：2-4。
在上述的辅酶I的树脂填料分离方法中，所述的水洗操作中水洗速度为20-30ml/min。
在上述的辅酶I的树脂填料分离方法中，洗脱操作中的洗脱速度为15-20ml/min。
在上述的辅酶I的树脂填料分离方法中，所述的方法具体为：
S1、从鲜酵母中提取辅酶I：采用温差法对鲜酵母进行破壁，得细胞液，将细胞液经陶瓷膜微滤，得微滤液，继续超滤得超滤液，再经过纳滤得纳滤液，所述的纳滤液即为含有辅酶I的细胞过滤液；
S2、上柱：将S1中得到的纳滤液上D945大孔树脂柱交换；
S3、水洗：S2结束后，用纯化水洗涤；
S4、洗脱：S3结束后，用乙醇溶液进行洗脱，得洗脱液。
在上述的辅酶I的树脂填料分离方法中，陶瓷膜孔径为100nm，超滤膜的截留分子量为2000，纳滤膜为聚醚砜膜，截留分子量为300；
S4中，通过色谱仪检测洗脱液中辅酶I的浓度，随时观察色谱图上信号峰值变化，待响应值呈直线上升趋势，且上升至为500-1000时开始收集，待信号峰值500-700一定峰值，且呈平稳状态时，停止收集。
本发明的有益效果在于：
本发明选用D945大孔树脂对纳滤后的辅酶I进行洗脱分离，有效地去除了无机盐及一部分有机杂质，大大提高了辅酶I的纯度；且D945大孔树脂再生方法简单，操作方便，节省能耗，适合工业化应用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
为了更加清楚的对本发明进行说明，列举如下实施例来说明本发明的优越性。
实施例1
辅酶I的一种新型洗脱方法，包括如下步骤：
S1、从鲜酵母中提取辅酶I：采用温差法对鲜酵母进行破壁，得细胞液A。将细胞液A经100nm陶瓷膜微滤，得微滤液B，继续用截留分子量为2000D的超滤膜进行超滤，得超滤液C，再经过截留分子量为300D的纳滤膜，得纳滤液D。
S2、上柱：将S1中得到的纳滤液D以20ml/min的速度上D945大孔树脂柱。
S3、水洗：S2结束后，用纯化水以23ml/min的速度进行洗涤，纯化水用量为2倍树脂柱体积。
S4、洗脱：S3结束后，用7％乙醇溶液以15ml/min的速度进行洗脱，得洗脱液E。洗脱过程中，用紫外检测器进行实时监控，随时观察色谱图上信号峰值变化，待响应值呈直线上升趋势，且上升至为500时开始收集，待信号峰值500一定峰值，且呈平稳状态时，停止收集。
实施例2
辅酶I的一种新型洗脱方法，包括如下步骤：
S1、从鲜酵母中提取辅酶I：采用温差法对鲜酵母进行破壁，得细胞液A。将细胞液A经100nm陶瓷膜微滤，得微滤液B，继续用截留分子量为2000D的超滤膜进行超滤，得超滤液C，再经过截留分子量为300D的纳滤膜，得纳滤液D。
S2、上柱：将S1中得到的纳滤液D以25ml/min的速度上D945大孔树脂柱。
S3、水洗：S2结束后，用纯化水以20ml/min的速度进行洗涤，纯化水用量为2.5倍树脂柱体积。
S4、洗脱：S3结束后，用7.5％乙醇溶液以17ml/min的速度进行洗脱，得洗脱液E。洗脱过程中，用紫外检测器进行实时监控，随时观察色谱图上信号峰值变化，待响应值呈直线上升趋势，且上升至为560时开始收集，待信号峰值700一定峰值，且呈平稳状态时，停止收集。
实施例3
辅酶I的一种新型洗脱方法，包括如下步骤：
S1、从鲜酵母中提取辅酶I：采用温差法对鲜酵母进行破壁，得细胞液A。将细胞液A经100nm陶瓷膜微滤，得微滤液B，继续用截留分子量为2000D的超滤膜进行超滤，得超滤液C，再经过截留分子量为300D的纳滤膜，得纳滤液D。
S2、上柱：将S1中得到的纳滤液D以22.5ml/min的速度上D945大孔树脂柱。
S3、水洗：S2结束后，用纯化水以25.5ml/min的速度进行洗涤，纯化水用量为3倍树脂柱体积。
S4、洗脱：S3结束后，用8％乙醇溶液以18.5ml/min的速度进行洗脱，得洗脱液E。洗脱过程中，用紫外检测器进行实时监控，随时观察色谱图上信号峰值变化，待响应值呈直线上升趋势，且上升至为750时开始收集，待信号峰值600一定峰值，且呈平稳状态时，停止收集。
实施例4
辅酶I的一种新型洗脱方法，包括如下步骤：
S1、从鲜酵母中提取辅酶I：采用温差法对鲜酵母进行破壁，得细胞液A。将细胞液A经100nm陶瓷膜微滤，得微滤液B，继续用截留分子量为2000D的超滤膜进行超滤，得超滤液C，再经过截留分子量为300D的纳滤膜，得纳滤液D。
S2、上柱：将S1中得到的纳滤液D以27.5ml/min的速度上D945大孔树脂柱。
S3、水洗：S2结束后，用纯化水以30ml/min的速度进行洗涤，纯化水用量为3.5倍树脂柱体积。
S4、洗脱：S3结束后，用9％乙醇溶液以20ml/min的速度进行洗脱，得洗脱液E。洗脱过程中，用紫外检测器进行实时监控，随时观察色谱图上信号峰值变化，待响应值呈直线上升趋势，且上升至为850时开始收集，待信号峰值550一定峰值，且呈平稳状态时，停止收集。
实施例5
辅酶I的一种新型洗脱方法，包括如下步骤：
S1、从鲜酵母中提取辅酶I：采用温差法对鲜酵母进行破壁，得细胞液A。将细胞液A经100nm陶瓷膜微滤，得微滤液B，继续用截留分子量为2000D的超滤膜进行超滤，得超滤液C，再经过截留分子量为300D的纳滤膜，得纳滤液D。
S2、上柱：将S1中得到的纳滤液D以30ml/min的速度上D945大孔树脂柱。
S3、水洗：S2结束后，用纯化水以27ml/min的速度进行洗涤，纯化水用量为4倍树脂柱体积。
S4、洗脱：S3结束后，用10％乙醇溶液以16ml/min的速度进行洗脱，得洗脱液E。洗脱过程中，用紫外检测器进行实时监控，随时观察色谱图上信号峰值变化，待响应值呈直线上升趋势，且上升至为1000时开始收集，待信号峰值650一定峰值，且呈平稳状态时，停止收集。
试验例1
测定实施例1-5中洗脱液中辅酶I的含量，并与122#树脂和732#树脂分离的结果进行比较。
按照辅酶I国家质量标准(WS-10001(HD-0877)-2002)进行含量检测，结果如下：
由上表可知，本发明的含量高，副反应少。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，将过滤后的含有辅酶I的细胞过滤液经过D945大孔树脂柱交换后水洗和洗脱，收集洗脱液，即得。
2.根据权利要求1所述的辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，洗脱液为7-10vol％的乙醇溶液。
3.根据权利要求2所述的辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，洗脱液为8-9vol％的乙醇溶液。
4.根据权利要求3所述的辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，水洗操作中的水为纯化水。
5.根据权利要求1所述的辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，所述的含有辅酶I的细胞过滤液以20-30ml/min的速度进行上柱交换。
6.根据权利要求1所述的辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，D945大孔树脂和水洗操作中的水的体积比为1：2-4。
7.根据权利要求6所述的辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，所述的水洗操作中水洗速度为20-30ml/min。
8.根据权利要求1所述的辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，洗脱操作中的洗脱速度为15-20ml/min。
9.根据权利要求1-8任一所述的辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，所述的方法具体为：
S1、从鲜酵母中提取辅酶I：采用温差法对鲜酵母进行破壁，得细胞液，将细胞液经陶瓷膜微滤，得微滤液，继续超滤得超滤液，再经过纳滤得纳滤液，所述的纳滤液即为含有辅酶I的细胞过滤液；
S2、上柱：将S1中得到的纳滤液上D945大孔树脂柱交换；
S3、水洗：S2结束后，用纯化水洗涤；
S4、洗脱：S3结束后，用乙醇溶液进行洗脱，得洗脱液。
10.根据权利要求9所述的辅酶I的树脂填料分离方法，其特征在于，陶瓷膜孔径为100nm，超滤膜的截留分子量为2000，纳滤膜为聚醚砜膜，截留分子量为300；
S4中，通过色谱仪检测洗脱液中辅酶I的浓度，随时观察色谱图上信号峰值变化，待响应值呈直线上升趋势，且上升至为500-1000时开始收集，待信号峰值500-700一定峰值，且呈平稳状态时，停止收集。
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