CN104892710B - 一种纯化还原型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法 - Google Patents
一种纯化还原型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种纯化还原型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：对酶催化反应所得反应液先后进行微滤和纳滤，收集浓缩液备用；然后在浓缩液中加入离子对试剂，用反相色谱柱为固定相，以缓冲盐溶液为A相、乙醇为B相，进行梯度洗脱纯化；采用阳离子交换树脂将纯化后滤液中的阳离子转化为钠离子；对上述步骤所得的滤液进行纳滤，最后用真空冷冻干燥机冻干。本发明使用反相高效液相色谱和阳离子交换法纯化还原型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，使得还原型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高、收益好，达到产业化要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种纯化辅酶的方法，尤其涉及一种纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。
背景技术
还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸是辅酶I的还原型，又称β-Nicotinamideadenine dinucleotide,reduced form，通常情况下为二钠盐型式，以下简称NADH。NADH在生物体内产生于糖酵解和呼吸作用的柠檬酸循环中，NADH经由一个电子传递的氧化反应可产生大量的ATP，从而满足生物体的能量需要。还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸可用于氧化还原反应当中，以实现电子传递，所以它的用途非常广泛，可以用于化工催化反应、原料药生产、保健品行业、化妆品行业等。NADH为原料的保健品，主要用于抗衰老、防治慢性病等领域。
目前，由于NADH的化学性质不稳定，各种环境因素都会使其降解，选择传统的离子交换层析生产过程不易控制降解，导致最终的产品纯度只有90%左右，收率只有60%，产能受到很大限制，不能满足市场的需求。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，旨在解决现有纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的工艺存在纯度低、收率低及产能受到限制的问题。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，包括步骤：
a、对酶催化反应所得反应液先后进行微滤和纳滤，收集浓缩液备用；
b、然后在浓缩液中加入离子对试剂，用反相色谱柱为固定相，以缓冲盐溶液为A相、乙醇为B相，进行梯度洗脱纯化；
c、采用阳离子交换树脂将纯化后滤液中的阳离子转化为钠离子；
d、对步骤c所得的滤液进行纳滤，最后用真空冷冻干燥机冻干。
所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤a中纳滤采用的纳滤膜为截留分子量200的中空纤维膜。
所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤a中浓缩液浓度为30-40g/L。
所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中离子对试剂为四甲基氢氧化铵。
所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中反相色谱柱为八烷基硅烷键合硅胶。
所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中缓冲盐溶液为盐酸和氨水配成的浓度为20mM的缓冲盐溶液。
所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中缓冲盐溶液的pH为7-9。
所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中梯度洗脱时间为40min。
所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤c中阳离子交换树脂为001×7强阳离子交换树脂。
所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤c具体为：将阳离子交换树脂用盐酸洗3倍柱体积，再用氢氧化钠洗3倍柱体积，最后用纯水洗涤柱子至pH为7-8，将待转盐的纯化后的滤液上样到阳离子交换柱中，收集洗脱液即为转盐后的产品溶液。
有益效果：本发明提供的一种纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，本发明采用反相高效液相色谱法和阳离子交换法纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，获得的产品纯度高达98%，收率高达90%以上，生产效率也比其他工艺提高了1倍以上，大大降低了生产成本，符合市场对产量和价格的需求，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
本发明提供了一种纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，该方法是采用反相高效液相色谱法和阳离子交换法对还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行纯化，从而使得纯化后的还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高、收率高，达到产业化要求。
一种纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，包括步骤：
a、对酶催化反应所得反应液先后进行微滤和纳滤，收集浓缩液备用；
b、然后在浓缩液中加入离子对试剂，用反相色谱柱为固定相，以缓冲盐溶液为A相、乙醇为B相，进行梯度洗脱纯化；
c、采用阳离子交换树脂将纯化后滤液中的阳离子转化为钠离子；
d、将步骤c所得的滤液进行纳滤，最后用真空冷冻干燥机冻干。
本发明中，所述步骤a对酶催化反应所得反应液先进行微滤，所述微滤采用0.35μm的微滤膜过滤，其操作压力为0.1Mpa，所述微滤用于除掉微生物，这是由于微滤膜允许大分子和溶解性无机盐通过，而截留微生物、细菌及悬浮物等物质；然后再对微滤后所得滤液用纳滤膜进行纳滤，所述纳滤膜为中空纤维膜，优选地，所述纳滤膜为截留分子量200的中空纤维膜，采用此材料的纳滤膜能去除部分溶解性盐和分子量200的有机物，从而进一步地提高产品纯度和产品收益。
本发明中，所述步骤a中浓缩液的浓度为30-40g/L。本发明在样品溶液进样前，采用微滤和纳滤对样品溶液进行处理，可去除颗粒物、微生物、有机物和部分溶解的无机盐等，以缩短后续色谱洗脱时间，且还能避免颗粒物堵塞柱子，从而延长柱子的使用寿命。本发明步骤a中经微滤和纳滤浓缩后的浓缩液的浓度为30-40g/L，将样品溶液浓缩至该浓度下有利于缩短步骤b中样品洗脱时间，且还能提高分离效率。
优选地，本发明所述步骤b中离子对试剂为四甲基氢氧化铵，在反相色谱柱中，样品在柱子中保留时间短时，可加入相应的离子对试剂，将样品中的离子进行结合，形成在柱子上有保留的分子。离子对试剂的种类对分离效果也有较大的影响，本发明采用四甲基氢氧化铵作为离子对试剂时，可有效增加样品保留时间，改善目的峰峰形，分离效果最好。
本发明中，所述步骤b中反相色谱柱为八烷基硅烷键合硅胶，采用该非极性的八烷基硅烷键合硅胶作为固定相，在结合极性的酸性氨水溶液为流动相作为本发明色谱分离模式，可有效分离样品溶液，获得的还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高和收益高。
本发明所述步骤b中，缓冲盐溶液为盐酸和氨水配成的浓度为20mM的缓冲盐溶液。缓冲盐溶液的浓度高低直接影响目标组分的峰形，从而影响色谱柱的分离效果。缓冲盐溶液浓度较低会导致色谱峰拖尾和色谱峰变宽，缓冲盐溶液浓度较高时会损伤色谱柱，缩短色谱柱的寿命，本发明中在缓冲盐溶液浓度为20mM时，得到的色谱峰峰形较好，色谱分离效果更佳。
进一步，本发明所述步骤b中缓冲盐溶液的pH为7-9。色谱分析中，被分离的物质在流动相中以一种形式存在，半峰宽小，峰形对称，分离的效果就更好，在缓冲盐溶液pH为7-9时，得到的目的峰峰形较好，优选地，缓冲盐溶液pH为8时，目的峰峰形最好，分离的效果最佳。
进一步，本发明所述步骤b中A相和B相的体积比大于4：96，小于1。优选地，A相和B相的体积比大于30：70，小于40：60。在该配比内，还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸能得到良好分离。
进一步，本发明所述步骤b中梯度为4%～14% B%，流动相在该比例内能保证杂质都能洗脱出来，分离效果较好。
进一步，本发明步骤b中色谱检测波长为340 nm，这是因为还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在该波长处具有最大吸收波长，从而使得色谱峰峰形较好，灵敏度更高。
本发明所述步骤b中梯度洗脱时间为40min，这是由于浓缩液中成分复杂，如果采用等梯度洗脱，洗脱时间较长，且分离的效率较差，灵敏度不高。本发明采用梯度洗脱来纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，不仅具有较好的分离度和较短的分离时间，且灵敏度高，分离效果佳。在梯度洗脱时间为40min时，就能很好地完成对样品的分离。
本发明中，所述步骤c中阳离子交换树脂为001×7强阳离子交换树脂，该001×7强阳离子交换树脂具有交换速度快、交换容量高和稳定性好的特点，从而有利于将纯化后滤液中的阳离子转化为钠离子。前述步骤b中采用的缓冲盐溶液为盐酸和氨水配制，其中铵根即为阳离子，另外离子对试剂也为阳离子。
本发明中，所述步骤c具体为：将阳离子交换树脂用盐酸洗3倍柱体积，再用氢氧化钠洗3倍柱体积，最后用纯水洗涤柱子至pH为7-8，将待转盐的纯化后的滤液上样到阳离子交换柱中，收集洗脱液即为转盐后的产品溶液。
本发明步骤d中，将转盐后的产品滤液用截留分子量200的中空纤维膜纳滤浓缩至100~150g/L，然后用真空冷冻干燥机冻干即可得到高纯度的和高收益的冻干产品。
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1
1. 样品处理：对酶催化反应所得反应液先后进行微滤和纳滤，微滤采用0.35μm的微滤膜过滤，其操作压力为0.1Mpa，微滤用于除掉微生物，纳滤采用截留分子量200的中空纤维膜将滤液浓缩至30-40g/L，收集浓缩液备用。
2. 纯化：
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×30cm。流动相：A相：用盐酸和氨水配成20mM pH为7的缓冲盐盐溶液；B相：乙醇。流速：50-80 mL/min。检测波长：340 nm。梯度：B%：4%～14%（洗脱时间40 min）。进样量为10-15g。
纯化过程：在浓缩液中加入10mM的四甲基氢氧化铵，将色谱柱用30%（质量浓度）以上的乙醇冲洗干净后平衡上样，上样量为10-15g样品滤液。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，将收集的目的峰溶液用容器装着于2-8℃冷库放置备用。
3．转盐：将001×7强阳离子交换树脂用1M盐酸洗3倍柱体积，再用0.5M氢氧化钠洗3倍柱体积，最后用纯水洗涤柱子至pH为7-8。将待转盐的样品滤液上样到阳离子交换柱中，收集洗脱液即为转盐后的产品溶液。
4. 浓缩及冻干：将转盐后的产品溶液用纳滤膜（截留分子量200的中空纤维膜）纳滤浓缩至100~150g/L，然后用真空冷冻干燥机冻干即可得到纯度大于98%的冻干产品，总收率可以达到90.6%。
实施例2：
1. 样品处理：对酶催化反应所得反应液先后进行微滤和纳滤，微滤采用0.35μm的微孔滤膜过滤，其操作压力为0.1Mpa，微滤用于除掉微生物，纳滤采用截留分子量200的中空纤维膜将滤液浓缩至30-40g/L，收集浓缩液备用。
2. 纯化：
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm×30cm。流动相：A相：用盐酸和氨水配成20mM pH为8的缓冲盐溶液；B相：乙醇。流速：400-500 mL/min。检测波长：340 nm。梯度：B%：4%～14%（洗脱时间40 min）。进样量为80-100g。
纯化过程：在浓缩液中加入15mM的四甲基氢氧化铵，将色谱柱用30%以上的乙醇冲洗干净后平衡上样，上样量为80-100g样品滤液。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，将收集的目的峰溶液用容器装着于2-8℃冷库放置备用。
3．转盐：将001×7强阳离子交换树脂用1M盐酸洗3倍柱体积，再用0.5M氢氧化钠洗3倍柱体积，最后用纯水洗涤柱子至pH为7-8。将待转盐的样品滤液上样到阳离子交换柱中，收集洗脱液即为转盐后的产品溶液。
4. 浓缩及冻干：将转盐后的产品溶液用纳滤膜（截留分子量200的中空纤维膜）纳滤浓缩至100~150g/L，然后用真空冷冻干燥机冻干即可得到纯度大于98%的冻干产品，总收率可以达到90.2%。
实施例3：
1. 样品处理：对酶催化反应所得反应液先后进行微滤和纳滤，微滤采用0.35μm的微孔滤膜过滤，其操作压力为0.1Mpa，微滤用于除掉微生物，纳滤采用截留分子量200的中空纤维膜将滤液浓缩至30-40g/L，收集浓缩液备用。
2. 纯化：
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×30cm。流动相：A相：用盐酸和氨水配成20mM pH为9的缓冲盐溶液；B相：乙醇。流速：2500-3000 mL/min。检测波长：340 nm。梯度：B%：4%～14%（洗脱时间40 min）。进样量为400-500g。
纯化过程：将浓缩后的样品溶液加入20mM的四甲基氢氧化铵，将色谱柱用30%以上的乙醇冲洗干净后平衡上样，上样量为400-500g样品滤液。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，将收集的目的峰溶液用容器装着于2-8℃冷库放置备用。
3．转盐：将001×7强阳离子交换树脂用1M盐酸洗3倍柱体积，再用0.5M氢氧化钠洗3倍柱体积，最后用纯水洗涤柱子至pH为7-8。将待转盐的样品滤液上样到阳离子交换柱中，收集洗脱液即为转盐后的产品溶液。
4. 浓缩及冻干：将转盐后的产品溶液用纳滤膜（截留分子量200的中空纤维膜）纳滤浓缩至100~150g/L，然后用真空冷冻干燥机冻干即可得到纯度大于98%的冻干产品，总收率可以达到91.1%。
通过上述实施例可知，采用反相高效液相色谱法和阳离子交换法纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，获得的产品纯度高达98%，收率高达90%以上，生产效率也比其他工艺提高了1倍以上，大大降低了生产成本，符合市场对产量和价格的需求，具有广泛的应用前景。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐的方法，其特征在于，包括步骤：
a、对酶催化反应所得反应液先后进行微滤和纳滤，收集浓缩液备用；
b、然后在浓缩液中加入离子对试剂，用反相色谱柱为固定相，以缓冲盐溶液为A相、乙醇为B相，进行梯度洗脱纯化；
c、采用阳离子交换树脂将纯化后滤液中的阳离子转化为钠离子；
d、对步骤c所得的滤液进行纳滤，最后用真空冷冻干燥机冻干；
所述步骤b中离子对试剂为四甲基氢氧化铵，缓冲盐溶液为盐酸和氨水配成的浓度为20mM的溶液。
2.根据权利要求1所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐的方法，其特征在于，所述步骤a中纳滤采用的纳滤膜为截留分子量200的中空纤维膜。
3.根据权利要求1所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐的方法，其特征在于，所述步骤a中浓缩液的浓度为30-40g/L。
4.根据权利要求1所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐的方法，其特征在于，所述步骤b中反相色谱柱为八烷基硅烷键合硅胶。
5.根据权利要求1所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐的方法，其特征在于，所述步骤b中缓冲盐溶液的pH为7-9。
6.根据权利要求1所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐的方法，其特征在于，所述步骤b中梯度洗脱时间为40min。
7.根据权利要求1所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐的方法，其特征在于，所述步骤c中阳离子交换树脂为001×7强阳离子交换树脂。
8.根据权利要求1或7所述的纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐的方法，其特征在于，所述步骤c具体为：将阳离子交换树脂用盐酸洗3倍柱体积，再用氢氧化钠洗3倍柱体积，最后用纯水洗涤柱子至pH为7-8，将待转盐的纯化后的滤液上样到阳离子交换柱中，收集洗脱液即为转盐后的产品溶液。
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| Analytical Procedures for the Preparation, Isolation, Analysis and Preservation of Reduced Nicotinamides.;Kelli A. Markham, et al.,;《Current Analytical Chemistry》;20061231;第2卷(第4期);第1-11页. * |
| Purification of Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide by lon-Exchange and High-Performance Liquid Chromatography.;Colin J. Newton, et al.,;《Analytical Biochemistry》;19831231;第132卷;第50-53页. * |
| Rapid extraction of (di)nucleotides from bacterial cells and determination by ion-pair reversed-phase HPLC.;R.H. Miller, et al.,;《Journal of Microbiological Methods》;19961231;第25卷;第29-35页. * |
| 多级超滤及亲和超滤法分离纯化NADH工艺的研究.;温居一等，;《药物生物技术》;20051231;第12卷(第5期);第317-322页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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Denomination of invention: A method of purifying reduced form beta-nicotinamide adenine dinucleotide Effective date of registration: 20190604 Granted publication date: 20170929 Pledgee: Shenzhen SME financing Company limited by guarantee Pledgor: Bontac Bio-engineering (Shenzhen) Co., Ltd. Registration number: 2019990000510 |
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Date of cancellation: 20210817 Granted publication date: 20170929 Pledgee: Shenzhen SME financing Company limited by guarantee Pledgor: BONTAC BIO-ENGINEERING (SHENZHEN) Co.,Ltd. Registration number: 2019990000510 |
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