CN113788881B - 半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产l-半胱氨酸中的应用 - Google Patents
半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产l-半胱氨酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明综合利用随机突变、饱和突变和组合突变方法，得到了多种L‑半胱氨酸外排能力增强的转运蛋白EamB突变体，相对于野生的EamB转运蛋白，存在I83M、G156A、N157M、G156S、N157S中一个或多个突变。在具体实施中，分别过表达上述EamB突变体，底盘菌株的L‑半胱氨酸发酵产量可提升约30%~70%，并且不会对菌体正常生长造成影响。因此，本发明提供的有益突变体可以为工业化高效生产L‑半胱氨酸及下游代谢产物奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及外排能力增强的L-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在制备L-半胱氨酸中的应用。
背景技术
L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，在食品、医药、化妆品及饲料工业等领域都具有广泛的应用，其中食品添加剂用途约占半胱氨酸产量的近六成。近年来，研究人员开发出许多半胱氨酸新产品，如面包发酵改良剂、半胱氨酸口服片、乙酰半胱氨酸滴眼液、保健口香糖等。随着半胱氨酸终端用途的不断开拓，全球半胱氨酸市场需求迅速增大，市场前景十分光明。我国半胱氨酸产量约占全球总产量的2/3，每年出口量保持在80%以上，在竞争激烈的国际市场上占据着重要地位。
目前，大多数L-半胱氨酸是通过工业水解人类毛发和家禽羽毛获得的，但往往伴随着产量低以及严重环境和安全问题。近年来，微生物发酵生产L-半胱氨酸受到越来越多的关注，与目前的蛋白水解制备法相比，微生物发酵法提供了一种食品安全、经济效益高、环境友好的替代生产策略。***代谢工程和合成生物学的发展为改造微生物菌株以高效生产生物基化学品提供了各种工具和技术。在这些策略中，通过改造优化底物、代谢中间体或代谢产物的转运能力，为菌株增强底物吸收、克服代谢抑制和保护细胞免受有毒化合物的毒害提供了很好的机会，是提高微生物细胞工厂鲁棒性和生产效率的有效方法。但不幸的是，大多数天然转运蛋白具有一些固有的局限性，例如底物转运活性低、底物亲和力差以及未预料的底物/产物抑制效应等，阻碍了这些转运蛋白在工业生物技术中的广泛应用。
由于高浓度L-半胱氨酸具有细胞毒性及复杂的反馈效应，用于工业发酵生产L-半胱氨酸的高效微生物细胞工厂的构建具有较大挑战性。为了减轻其细胞毒性，微生物已经进化出多种策略来维持细胞内L-半胱氨酸的低水平，例如通过降解与外排两种途径降低胞内L-半胱氨酸浓度。因此，提升L-半胱氨酸外排***对于微生物发酵生产L-半胱氨酸是必需的。目前在大肠杆菌中，已证实有几种转运蛋白与L-半胱氨酸的输出密切相关，其中包括内膜转运蛋白EamB（YfiK）、Eama（YdeD）、Bcr、CydDC和TolC。作为主要的L-半胱氨酸外排蛋白，EamB的过表达可促进大肠杆菌细胞中O-乙酰丝氨酸和L-半胱氨酸的分泌过程，在改善工程菌株发酵生产L-半胱氨酸中具有重要意义。然而，目前关于EamB转运蛋白的结构和转运机制的研究匮乏，增加了通过设计改造提高其转运效率的难度。
发明内容
基于上述要求，本发明的首要目的在于提供L-半胱氨酸转运蛋白突变体，以使得其底物转运能力得到提升，利于微生物发酵生产L-半胱氨酸等代谢产物。
本发明提供一种来源于Escherichia coli MG1655的L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丙氨酸A或丝氨酸S，第157位由天冬酰胺N突变为甲硫氨酸M或丝氨酸S中的一个或多个位点突变。
优选实施方式是，仅第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丙氨酸A，第157位由天冬酰胺N突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S，第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S中的一个位点突变；仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M和第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S的组合突变；仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变；仅存在第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变；仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变。
其中更优选地，仅存在第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变，最优选的其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明进一步提供所述L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的编码基因。
优选地实施方式中，所述L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的编码基因的核苷酸序列是在SEQ ID No.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。在更优选地实施方式中，所述的L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的编码基因核苷酸序列如选为SEQ ID No.4（编码I83M-G156S）、SEQ ID No.5（编码I83M-N157S）、SEQ ID No.6（编码G156S-N157S）以及SEQID No.7（编码I83M-G156S-N157S）所示。
本发明还提供含有所述的L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体编码基因的表达载体和宿主细胞。
本发明还提供所述的L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体或其编码基因或者所述的重组宿主细胞在制备L-半胱氨酸中的应用。
在具体实施方式中，培养导入含有所述的L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体编码基因的表达载体的微生物细胞以产生L-半胱氨酸，进一步还包括收集和纯化L-半胱氨酸的步骤。
在一个更具体实施方式中，所述表达载体是低拷贝质粒pMW118，通过构建含有EamB突变体编码基因的重组质粒，并将其导入微生物细胞中，用于发酵生产L-半胱氨酸等代谢产物。在更优选的实施方式中，所述微生物细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
本发明进一步提供增强L-半胱氨酸生产能力的重组菌，其特征在于，其出发菌株中过表达所述的编码基因。优选地，所述出发菌株中敲除了L-半胱氨酸降解途径基因tanA和yhaM，同时过表达L-半胱氨酸合成途径基因cysE。在具体实施方式中，其出发菌株是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、菠萝泛菌、枯草芽孢杆菌，优选地为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌。
本发明通过以下技术思路实现，以大肠杆菌E. coli MG1655基因组为模板，利用易错PCR随机突变方法获得EamB编码基因突变文库，采用一步法高效无缝克隆技术（ClonExpress®II One Step Cloning Kit，Vazyme Biotech, China），将其构建到表达载体上，获得含有L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体编码基因的重组质粒文库。将重组质粒文库导入E. coli MG1655 L-半胱氨酸转运蛋白缺失背景菌（∆eamA ∆eamB ∆bcr），通过固体平板初筛和96孔板复筛，寻找能够提高背景菌株对L-半胱氨酸抗性的有益突变体，最终筛选获得三个转运活性提高的突变体，其突变位点分别为I83M、G156A和N157M。随后通过对每个氨基酸残位点进行饱和突变，经过高通量筛选获得了两个转运活性进一步提高的突变体G156S和N157S。最后，对获得的有益突变体I83M、G156S和N157S进行组合突变，获得最优的突变组合G156S-N157S，该突变体能赋予底盘菌最高的L-半胱氨酸耐受性和生产能力。
本发明有益效果在于，通过对大肠杆菌来源的L-半胱氨酸转运蛋白EamB编码基因进行的突变和筛选，获得了能够显著赋予菌株增强的L-半胱氨酸耐受性和生产能力的突变体，可将底盘菌株的L-半胱氨酸发酵产量提升约30%~70%。因此，本发明提供的半胱氨酸转运蛋白EamB突变体能够为高效发酵生产L-半胱氨酸及下游产物奠定了良好基础。
附图说明
图1 L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的耐受性生长测试。
图2 L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的发酵分析。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明，但并不应理解为对本发明的限制。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体文库的构建
本发明采用保真性低的EasyTaq DNA聚合酶，以E. coli MG1655基因组为模板，利用引物P1（5’-TATGACCATGGTGACACCGACCCTTTTAAGTGCTTTTTGGACTTAC-3’）和P2（5’-GGGCGACCTCTTAATAGAAAATGCGTACCGCGCAATAGACCAGCA-3’），通过易错PCR方法获得eamB编码基因突变文库。通过在PCR反应体系中加入一定浓度的镁离子和锰离子，进一步降低PCR扩增过程中的保真性，控制获得的eamB编码基因中含有2-3个点突变。本发明采用的易错PCR体系为：5 μL 10 × EasyTaq缓冲液、0.2 μM上游引物P1、0.2 μM下游引物P2，200 μM dNTPs、0.8mM MnCl2、6 mM MgSO4、50 ng模板DNA、1 μL EasyTaq DNA聚合酶 (TransGen Biotech,China)，加入无菌的水补齐至50 μL体系。PCR反应程序为：95℃ 预变性3 min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸2 min，循环35次；72℃ 延伸 5min，4℃保存。
本发明采用高保真性的Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶，以pMW118质粒为模板，利用引物P3（5’-TTTCTATTAAGAGGTCGCCCTCTTCCGCTTAGTAACTTGCTACTTAAG-3’）和P4（5’-TCGGTGTCACCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC-3’），通过普通PCR方法获得pMW118质粒骨架。为了保证质粒骨架扩增中的序列正确性，采用目前商用的高效超保真DNA聚合酶进行PCR反应，其体系为：10 μL 5 × Phusion HF缓冲液、0.5 μM上游引物P3、0.5 μM下游引物P4，200 μM dNTPs、3% DMSO、50 ng模板DNA、0.5 μL Phusion High-Fidelity DNA聚合酶 (Thermo Scientific, USA)，加入无菌的水补齐至50 μL体系。PCR反应程序为：98℃预变性1 min；98℃变性10 s；62℃退火20s；72℃延伸3 min，循环35次；72℃ 延伸 5 min，4℃保存。
基于ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒（ClonExpress II One StepCloning kit, Vazyme Biotech, China)，将PCR获得的eamB编码基因突变文库和pMW118质粒骨架进行连接，获得含有eamB编码基因不同突变体的重组表达质粒pMW118-eamBmut。连接体系为：4 μL 5 × CE II缓冲液，50~200 ng基因突变片段，50~200 ng质粒骨架，2 μLExnase II。体系配置完成后，置于37℃反应30 min，待反应完成后，置于冰水浴中冷却5min。然后将上述获得的质粒文库按照常规的大肠杆菌热激转化法，导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
实施例2 L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体文库的筛选
高通量筛选过程的基本依据是高浓度的L-半胱氨酸具有明显细胞毒性，将实施例1中的重组质粒突变文库导入大肠杆菌L-半胱氨酸转运蛋白缺失的背景菌中，通过对菌株进行L-半胱氨酸耐受性筛选获得有益突变体，转运能力更强的突变体会将过量的L-半胱氨酸排出胞外，菌株在高浓度L-半胱氨酸压力下具有增强的耐受能力。所述的大肠杆菌L-半胱氨酸转运蛋白缺失菌是指在E. coli MG1655中敲除三个潜在的L-半胱氨酸转运蛋白EamA、EamB和Bcr，菌株基因型为：∆eamA ∆eamB ∆bcr。在上述大肠杆菌L-半胱氨酸转运蛋白缺失菌的基础上筛选EamB突变体文库，可以有效降低筛选过程中的假阳性等问题。
具体筛选步骤为：由于L-半胱氨酸的细胞毒性作用，具有增强外排能力的EamB突变体将赋予菌株更强的L-半胱氨酸抗性。将含有实施例1中所述重组质粒突变文库的大肠杆菌L-半胱氨酸转运蛋白缺失背景菌，涂布在选择性抗生素和L-半胱氨酸的压力琼脂平板上。从选择性压力琼脂板上随机挑取菌落，接种到每孔含有200 μL LB培养基的96孔微量滴定板中，37°C 800 rpm过夜培养；然后取2 μL过夜培养物转移到含有200 μL新鲜M9-葡萄糖培养基(已经添加1 mM L-半胱氨酸)的96孔微量滴定板中，37℃ 800 rpm振荡孵育14小时。将含有天然EamB转运蛋白的pMW118-eamB重组质粒，导入大肠杆菌L-半胱氨酸转运蛋白缺失背景菌中，作为筛选实验的对照。选取在L-半胱氨酸筛选压力条件下，比对照菌生长状态较好的克隆，使用更高的L-半胱氨酸压力条件进行复筛。经过两轮筛选程序，经过Sanger测序确定，最终获得三个不同的EamB有益突变体，即I83M、G156A和N157M。
所述LB培养基组分包括：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，1% NaCl。所述M9-葡萄糖培养基组分包括：0.8%葡萄糖，12.8 g/L Na2HPO4·7H2O，3 g/L KH2PO4，0.5 g/L NaCl，1 g/LNH4Cl，2 mM MgSO4，0.1 mM CaCl2。
实施例3 L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的定点饱和突变
针对实施例2中获得的三个EamB有益突变体（I83M、G156A和N157M），采用定点饱和突变的策略，在第83位、156位和157位氨基酸残基位点设计随机的兼并引物NNK (其中N代表A、C、G或T，K代表G或T)，通过PCR方法获得含有该位点饱和突变的重组质粒文库。采用实施例2中的筛选策略和方法，将含有特定位点饱和突变的重组质粒文库，导入大肠杆菌L-半胱氨酸转运蛋白缺失菌，利用L-半胱氨酸压力条件进行筛选。经过Sanger测序确定，最终在第83位、156位和157位氨基酸残基位点都获得了最优的突变类型，即在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变。
所述兼并引物NNK，分别为：
I83-Sat-F：5'-TTTTGAGTTGGGCGGGGGCGGCATATNNKGTCTGGCTG-3'
I83-Sat-R：5'-CCCGCCCAACTCAAAAGGTGTACCGCT-3'
G156-Sat-F：5'-TGGCGATGATTGGGACGTTTNNKAATGTGTGCTGG-3'
G156-Sat-R：5'-CGTCCCAATCATCGCCAGCAAAACGCTGAC-3'
G157-Sat-F：5'-TGGCGATGATTGGGACGTTTGGCNNKGTGTGCTGG-3'
G157-Sat-R：5'-CGTCCCAATCATCGCCAGCAAAACGCTGAC-3'
测试了L-半胱氨酸转运蛋白EamB及其不同单突变体对于菌株在L-半胱氨酸压力条件下的生长影响。如图1所示，结果表明上述所有EamB突变体都能显著赋予菌株增强的L-半胱氨酸耐受能力，相对于野生型天然L-半胱氨酸转运蛋白EamB，重组菌株在1 mM L-半胱氨酸压力下的生物量提高约1.7~2.4倍。
实施例4有益突变位点的组合突变进一步提高转运蛋白活性
为了进一步提高转运蛋白的外排能力，将上述获得最佳突变位点I83M、G156S和N157S进行组合突变。本发明所涉及的定点突变采用QuikChange定点突变试剂盒（QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit）完成，所涉及的引物如下：
I83M-F：5'-TTTTGAGTTGGGCGGGGGCGGCATATATGGTCTGGCTG-3'
I83M-R：5'-CCCGCCCAACTCAAAAGGTGTACCGCT-3'
G156S-F：5'-TGGCGATGATTGGGACGTTTAGCAATGTGTGCTGG-3'
G156S-R：5'-CGTCCCAATCATCGCCAGCAAAACGCTGAC-3'
G157S-F：5'-TGGCGATGATTGGGACGTTTGGCAGTGTGTGCTGG-3'
G157S-R：5'-CGTCCCAATCATCGCCAGCAAAACGCTGAC-3'
QuikChange定点突变体系为：10 μL 5 × Phusion HF缓冲液、0.5 μM上游引物、0.5 μM下游引物，200 μM dNTPs、3% DMSO、50 ng模板DNA、0.5 μL Phusion DNA聚合酶(Thermo Scientific, USA)，加入无菌的水补齐至50 μL体系。PCR反应程序为：98℃预变性1 min；98℃变性10 s；62℃退火20s；72℃延伸3 min，循环35次；72℃ 延伸 5 min，4℃保存。
挑取单菌落进行测序验证，最终构建了3个双突变组合（I83M-G156S、I83M-N157S、G156S-N157S）和1个三突变组合（I83M-G156S-N157S）。同时，测试了上述突变组合对于菌株在L-半胱氨酸压力条件下的生长影响。结果表明，相对于野生型天然L-半胱氨酸转运蛋白EamB，含有上述四种组合突变体的重组菌株在1 mM L-半胱氨酸压力下的生物量提高分别约为2.1倍，2.6倍，2.9倍和2.4倍。上述结果表明，双突变组合G156S-N157S是最优组合，该突变体可以赋予菌株最强的L-半胱氨酸耐受性。
实施例5 L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的发酵测试
将上述实施例中获得的有益突变体I83M、G156S、N157S、I83M-G156S、I83M-N157S、G156S-N157S和I83M-G156S-N157S，按照常规的大肠杆菌热激转化法，导入具有一定半胱氨酸生产能力的大肠杆菌基础工程菌E.coli-CYS中，进行发酵测试。所述大肠杆菌基础工程菌E.coli-CYS是指在E. coli W3110中敲除两个L-半胱氨酸降解途径基因tanA和yhaM，同时表达一个L-半胱氨酸合成途径基因cysE，该菌株在发酵条件下具有一定的L-半胱氨酸生产能力。
将上述获得的菌株接种于LB培养基中，过夜培养后，按照10%接种量接种至新鲜发酵培养基中（50 g/L葡萄糖，12 g/L K2HPO4，3 g/L KH2PO4，0.1 g/L NaCl，5 g/L (NH4)2SO4，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.015 g/L CaCl2·2H2O，0.002 g/L FeSO4·7H2O，1 g/L 柠檬酸钠，5 mg/L 微生物B1和1 mL/L微量元素溶液），进行摇瓶发酵。菌株发酵培养42 h后，取样测定L-半胱氨酸的含量。
如图2所示，上述实施例中获得的有益突变体都能不同程度的提升基础工程菌的L-半胱氨酸生产能力，其中最优突变组合G156S-N157S能够提高基础工程菌的L-半胱氨酸发酵含量约70%。因此，本发明公开的几种L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体，对于大肠杆菌等微生物底盘菌高效生产L-半胱氨酸具有重要的应用价值。
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TTTTGAGTTGGGCGGGGGCGGCATATNNKGTCTGGCTG 38
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
CCCGCCCAACTCAAAAGGTGTACCGCT 27
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
TGGCGATGATTGGGACGTTTNNKAATGTGTGCTGG 35
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
CGTCCCAATCATCGCCAGCAAAACGCTGAC 30
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
TGGCGATGATTGGGACGTTTGGCNNKGTGTGCTGG 35
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
CGTCCCAATCATCGCCAGCAAAACGCTGAC 30
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
TTTTGAGTTGGGCGGGGGCGGCATATATGGTCTGGCTG 38
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
CCCGCCCAACTCAAAAGGTGTACCGCT 27
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
TGGCGATGATTGGGACGTTTAGCAATGTGTGCTGG 35
<210> 21
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<213> 人工序列
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TGGCGATGATTGGGACGTTTGGCAGTGTGTGCTGG 35
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
CGTCCCAATCATCGCCAGCAAAACGCTGAC 30
Claims (11)
1.一种来源于Escherichia coli MG1655的L-半胱氨酸转运蛋白EamB突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丙氨酸A，第157位由天冬酰胺N突变为甲硫氨酸M，第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S中的一个位点突变；或者仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M和第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S的组合突变；或者仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变；或者仅存在第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变；或者仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变。
2.如权利要求1所述的EamB突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.如权利要求1至2任一项所述的EamB突变体的编码基因。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列是在SEQ ID No.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。
5.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列选自如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示。
6.含有如权利要求3至5任一项所述的编码基因的表达载体。
7.含有如权利要求3至5任一项所述的编码基因的重组宿主细胞。
8.如权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、菠萝泛菌或枯草芽孢杆菌。
9.如权利要求1至2任一项所述的EamB突变体，或如3至5任一项所述的编码基因，或如权利要求7至8任一项所述的重组宿主细胞在制备L-半胱氨酸或其下游代谢产物中的应用。
10.一种增强L-半胱氨酸生产能力的重组菌，其特征在于，其出发菌株中过表达如权利要求3至5任一项所述的编码基因，其中出发菌是大肠杆菌。
11.如权利要求10所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌株中敲除了L-半胱氨酸降解途径基因tanA和yhaM，同时过表达L-半胱氨酸合成途径基因cysE。
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